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使用参考试剂验证细胞因子释放检测的稳健性以预测单克隆抗体安全性

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DOI：

10.3791/65087

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2023年9月15日

 ,  , 
1The Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency (MHRA)

本文内容

摘要

细胞因子释放试验参考试剂的使用有助于实现更可重复和标准化的结果 体外 免疫治疗性单克隆抗体的安全性特征。本文描述了如何将细胞因子释放试验与参考试剂组合联合使用，以预测某些治疗性单克隆抗体的安全性。

摘要

新型免疫刺激性抗体药物旨在通过直接激活特定免疫细胞，或通过阻断或激活免疫系统的内源性调节因子间接增强免疫应答，但这类药物可能引发严重的免疫相关不良事件，例如细胞因子释放综合征（CRS）。因此，在首次进行人体给药之前，结合体内（in vivo）和体外（in vitro）实验评估此类药物的安全性特征至关重要。细胞因子释放检测（CRAs）是识别潜在危害的关键方法，该方法将候选治疗性抗体与人类免疫细胞（如外周血单个核细胞（PBMCs）、全血或其他样本）共培养，并测定所产生的炎症性细胞因子的量。然而，不同实验室使用不同的对照抗体可能影响CRAs结果的标准化，而具有临床相关性的对照物（如TGN1412）又难以获取，这可能导致结果准确性或可靠性降低，或造成实验室间数据难以比较。在CRAs中纳入阳性和阴性对照有助于确保结果的准确性和可靠性。英国国家生物标准与控制研究所（NIBSC）已研制出一组冻干抗体对照品，旨在用于多种CRAs平台，以实现不同实验室和检测方法间结果的标准化。该对照组包含三种不同的阳性对照抗体：抗CD52抗体、抗CD3抗体和抗CD28超级激动剂（SA）抗体，这些抗体已知可在患者中诱导剂量依赖性的CRS反应。每种抗体均配有同型匹配的阴性对照抗体。此前的研究已证实，这一组参考试剂在不同实验室之间具有良好的重现性，适合作为多种CRAs平台中提高安全性数据可信度和稳健性的对照。

引言

诱导性细胞因子释放可能是某些免疫调节单克隆抗体（mAbs）预期且期望产生的效应。然而，促炎性细胞因子的意外释放可能导致患者发生细胞因子释放综合征（CRS），其特征为发热、疲劳，甚至多器官衰竭1因此，至关重要的是对新的免疫刺激性单克隆抗体进行测试 体外 通过细胞因子释放试验（CRA）检测其诱导细胞因子释放的能力，以评估引发细胞因子释放综合征（CRS）的潜在风险。

TGN1412 是一种单克隆抗体，最初作为 B 细胞慢性淋巴细胞白血病的潜在治疗方法而开发，其作用机制是作为 CD28 超级激动剂（CD28SA），可通过交联共刺激受体 CD282 来激活 T 淋巴细胞。2006 年，在一项临床试验中，六名健康志愿者在接受 TGN1412 给药后数小时内出现了严重不良反应，包括细胞因子释放综合征（CRS）1。该事件导致试验被紧急终止，TGN1412 也随即停止进一步开发。其他已知可引起 CRS 作为不良反应的抗体包括抗 CD52 单克隆抗体 Campath-1H3 和抗 CD3 单克隆抗体 Muromonab（OKT3）4。由于 TGN1412、OKT3 和 Campath-1H 能够在患者中诱导剂量依赖性的 CRS，因此它们适合作为细胞因子释放试验（CRA）中产生稳健且可靠结果的阳性对照抗体。然而，由于成本高昂或获取受限，这些对照抗体此前难以获得。

然而，英国国家生物标准与控制研究所（National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC）最近提供了一种包含上述三种抗体的经再制造冻干参考品组，同时配有同型匹配的阴性对照5,6,7。该参考试剂组此前已被证明具有良好的实验室间重复性8，因此可作为合适的对照，用于提高来自多种细胞因子释放测定（CRA）平台的安全性数据的可信度和稳健性。因此，本方案联合使用这些试剂的依据在于促进CRA检测的标准化，其优势在于这些试剂已在一项国际协作研究中得到验证8。

本文介绍了如何在固相（SP）PBMC细胞反应分析（CRA）和液相（AQ）全血（WB）CRA中最佳使用这一组参考试剂，以预测抗体诱导的细胞因子释放综合征（CRS）。由于抗体呈递方式的不同（固相为间接呈递，液相为直接呈递）以及两种方法靶向不同的应答细胞群体，这两种CRA格式具有互补性。相同方案可经适当调整后用于稀释全血（dWB）或内皮细胞与PBMC的共培养体系。

方案

以下方案遵循英国国家生物标准与控制研究所（NIBSC）研究伦理委员会的指导原则。根据适用的法规和指南，需获得健康供者或患者的书面知情同意。所有操作步骤均须在层流细胞培养罩内采用无菌技术进行。有关所有试剂和设备的详细信息，请参见材料表。

1. 固相（SP）实验用包被板的制备

  1. 用1 mL无菌蒸馏水重悬参考试剂安瓿瓶中的内容物。重悬后静置5-10分钟，待充分水化后，将抗体溶液混匀并转移至无菌带盖试管中。
  2. 用1 mL水重悬后，以下重组抗体的储备浓度均为200 µg/mL：抗CD3抗体（15/162）、抗CD52抗体（15/178）、用于抗CD52的IgG1K同型对照（15/198）、用于抗CD3的IgG2a同型对照（15/218）、用于抗CD28SA的IgG4同型对照（15/232）。
  3. 用1 mL水重悬后，抗CD28SA抗体（15/144）的储备浓度为100 µg/mL。若需短期储存（不超过7天），请将重悬后的试剂转移至无菌带盖试管，并置于4 °C保存。
  4. 将重悬后的抗体及待测抗体用无菌PBS稀释至10 µg/mL，取100 µL稀释后的抗体溶液（每孔含1 µg抗体）加入无菌、非组织培养处理的U型底聚丙烯96孔微孔板中，于4 °C孵育过夜。
    注意：必须使用聚丙烯板进行蛋白质吸附，因为该类板材在标准试剂验证过程中已被采用9。

2. 外周血单个核细胞的制备

  1. 采集至少 30 mL 外周全血（WB）至含肝素或肝素抗凝管中，并反复倒置数次，确保与肝素钠充分混匀。
  2. 将 15 mL 全血转移至另一管中，留待后续用于水相全血检测的制备（步骤 3.1）。
  3. 将剩余的 15 mL 血液以 1:1 体积比用 PBS 或无血清 RPMI-1640 培养基稀释，并轻轻叠加于 50 mL 离心管中 15 mL 密度梯度介质（如淋巴细胞分离液 Lymphoprep、Ficoll-Hypaque）的上层。
  4. 在室温下，使用水平转子以 500 × g 离心 20 分钟，不启用刹车功能，并降低加速度，以分离血液的不同组分。
  5. 离心后，密度梯度将分为上层血浆、中间薄层的含外周血单个核细胞（PBMCs）的白膜层，以及下层含有红细胞（RBCs）和包括中性粒细胞与嗜酸性粒细胞在内的多形核粒细胞的组分。通过将移液管直接穿过上层血浆层，小心吸取 PBMC 层。或者，在收集细胞前先移除上层液体。
  6. 用 10 mL PBS 或无血清 RPMI-1640 培养基轻柔重悬白膜层。再次以 500 × g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。吸除上清液并弃去。
  7. 重复步骤 2.6 的洗涤操作，并将细胞沉淀重悬于 2 mL 含 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基（完全 RPMI-1640，cRPMI）中。
  8. 使用血细胞计数板对细胞进行计数10。
  9. 用 cRPMI 将 PBMC 调整至浓度为 1 × 106 个细胞/mL。

3. 水相（AQ）全血（WB）细胞因子释放实验的制备

  1. 向96孔U型底聚苯乙烯板的各孔中加入190 µL WB。若处理抗体和参考试剂浓度尚未达到100 µg/mL，则需先用PBS将其预稀释至100 µg/mL。
  2. 将10 µL稀释后的抗体加入190 µL WB中，使抗体终浓度为5 µg/mL，WB终浓度为95%。
  3. 将板置于37 °C湿化培养箱中孵育48小时。

4. 固相（SP）PBMC 细胞因子释放试验的制备

  1. 使用多通道移液器从包被好的酶标板（见步骤1）中移除并弃去抗体溶液，用PBS填充试剂储液槽，每孔加入200 µL PBS，洗涤3次，以去除未结合的单克隆抗体。
  2. 向每孔加入2.8步骤中的细胞悬液200 µL。将酶标板置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育48小时。

5. 上清液或血浆的收集

  1. 用对照和待测单克隆抗体孵育 48 小时后，以 400 × g 离心 5 分钟，收集细胞条件培养基或血浆，注意不要扰动细胞沉淀。将收集的上清液或血浆于 -20 °C 冻存。
    ​注意：收集血浆时务必避免扰动红细胞沉淀。

6. 对上清液或血浆中的细胞因子进行定量分析

  1. 使用收集的上清液或血浆，采用首选的多重检测方法，对IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-6浓度进行细胞因子分析。已有文献报道使用流式微球阵列法进行多重细胞因子分析的示例方法11。
    注意：请参阅材料表，了解生成代表性结果所用的多重检测试剂盒。

结果

SP 实验的结果应显示，在刺激 48 小时后，所有阳性对照抗体均能诱导产生皮克每毫升（pg/mL）水平的 IL-2、IFN-γ、IL-6 和 TNF-α12，且其水平应显著高于相应的同型对照。我们具有代表性的实验结果表明，在人外周血单个核细胞（PBMC）SP 实验中，阳性对照抗体 αCD28、αCD3 和 αCD28SA 诱导产生的 IFN-γ、IL-6 和 TNF-α 水平显著高于相应的同型对照（图 1）。此外，该实验还表现出在使用 αCD28SA 刺激时，IL-2 释放量相较于其同型对照具有极高的倍数变化（859.0）。而 αCD3 和 αCD52 尽管仍可诱导 IL-2 表达，但其倍数变化低于 αCD28SA（分别为 6.2 和 3.3，图 2）。

在全血AQ检测（图3）中，可检测到的细胞因子水平明显低于PBMC SP检测，但对αCD52抗体刺激的敏感性更高（图2和 图3），其中IL-2、IFN-γ和IL-6的平均变化倍数均超过100。

一种待测抗体，其未来首次人体给药预计不会引起相较于相关同型对照更为显著或意外的细胞因子释放增加。然而，对于一种新的治疗性单克隆抗体，若细胞因子释放试验（CRA）结果呈阳性，不应直接终止其研发，而应将其视为风险/获益评估管理的一部分13。在开发新的CRA平台时，应使用另一组不同的供体重复实验，以确保该平台的可重复性。同时应充分考虑不同供体间反应差异的影响14，因此建议开展统计效能充足的实验15。为了全面了解反应的多样性，并完整呈现供体反应中可能观察到的变异性，理想情况下应在多个独立供体中进行该检测，同时对治疗性抗体开展重复实验。

PBMC细胞因子检测结果；比较αCD28、IgG4、αCD3、IgG2a、αCD52、IgG1标记物的图谱。
图 1：PBMC-SP实验中的细胞因子释放。 使用参考试剂抗体处理48小时后，PBMC-SP细胞因子释放实验中获得的IFN-γ、IL-2、IL-6和TNF-α释放的代表性结果（每个实验包含5–8名供体，共3次独立实验；n=8，n=10，n=5［从上至下］）。缩写：PBMC = 外周血单个核细胞；SP = 固相；IFN-γ = 干扰素-γ；IL-2 = 白细胞介素-2；IL-6 = 白细胞介素-6；TNF-α = 肿瘤坏死因子-α。 请点击此处查看本图的放大版本。

细胞因子表达比较柱状图；PBMC-SP 与 WB-AQ，通过抗体 αCD28、αCD3、αCD52 刺激后的倍数变化。
图 2：PBMC-SP 和 WB-AQ 实验中细胞因子释放的倍数变化。 CRS 诱导性抗体参考试剂在刺激外周血单个核细胞（PBMC-SP）或全血（WB-AQ）48 小时后，IFN-γ、IL-2、IL-6 和 TNF-α 的释放水平相对于同型对照组的倍数变化，来自细胞因子释放实验的结果。缩略语：PBMC = 外周血单个核细胞；SP = 固相；WB = 全血；AQ = 水相；IFN-γ = γ-干扰素；IL-2 = 白细胞介素-2；IL-6 = 白细胞介素-6；TNF-α = 肿瘤坏死因子-α；CRS = 细胞因子释放综合征。请点击此处查看本图的放大版本。

细胞因子水平比较图表，对数刻度；WB-AQ 实验；免疫学中的数据分析。
图3：WB-AQ 实验中细胞因子的释放。 使用参比试剂抗体处理 48 小时后，通过 WB-AQ 细胞因子释放检测获得的 IFN-γ、IL-2、IL-6 和 TNF-α 释放的代表性结果（3 次独立实验，每次实验包含 5–8 名供体；n=8，n=10，n=5 [从上到下]）。缩写：WB = 全血；AQ = 水相；IFN-γ = 干扰素-γ；IL-2 = 白细胞介素-2；IL-6 = 白细胞介素-6；TNF-α = 肿瘤坏死因子-α。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文描述了使用一组参考试剂作为阳性和阴性对照，通过抗体包被的培养板或溶液中抗体介导的刺激，检测PBMCs和全血（WB）中细胞因子释放的方法。这些检测方法各自具有相应的优势与局限性。PBMC与全血检测具有互补性，因为两种细胞反应分析（CRA）所用实验体系中各类免疫细胞（如淋巴细胞、单核细胞和粒细胞）的比例不同。值得注意的是，尽管全血检测相较于PBMC单细胞培养更能模拟体内（in vivo）状态，但其对TGN1412和OKT3所引发的T细胞介导的细胞因子释放综合征（CRS）风险的预测能力反而较低15；这是由于红细胞表面的血型糖蛋白A抑制了IL-2介导的T细胞扩增16。然而，抗CD52抗体引发的CRS风险在全血CRA中仍可被准确预测，这归因于中性粒细胞的存在（而该细胞在PBMC分离过程中常用的密度梯度离心法（见步骤2）中会丢失）。

CRA 的格式（SP 或 AQ 呈递）对于检测 CRS 特定机制至关重要。例如，将单克隆抗体以水相形式呈递给人类淋巴细胞17,18，用于临床前研究期间 体外 TGN1412的安全性测试未能识别出CRS风险，可能是由于缺乏局部细胞受体的聚集与结合19 以及由水相中抗体介导的T细胞活化。事实上，TGN1412介导的细胞因子释放综合征（CRS）仅能在SP格式中被准确检测到，该格式通过人工模拟Fcγ受体（FcγR）交联，如本文所示；或通过高密度外周血单个核细胞（PBMC）预培养中的接触依赖性启动，以及抗体Fc段与CD32+免疫细胞（如B细胞）的相互作用实现。20 和单核细胞21).

除了这些平台外，还有其他方法可通过更复杂的共培养系统进行细胞反应分析（CRA）。本方法中所述之外的一种替代性CRA示例是将外周血单个核细胞（PBMCs）与自体血液来源的内皮祖细胞（BOECs）进行共培养。22该检测方法于2015年被提出，是对当时常规的混合供体HUVEC:PBMC检测的改进，通过消除组织错配的干扰因素而提高了实验的准确性。与全血（WB）检测相比，该方法对抗CD28SA引起的细胞因子释放综合征（CRS）具有更高的敏感性；同时，通过模拟体内内皮细胞与白细胞共存的状态，克服了PBMC单细胞培养检测的局限性 体内，但代价是需要更复杂的操作步骤和专业的细胞培养技术22.

此外，尽管本方案主要关注 IFN-γ、IL-2、IL-6 和 TNF-α 的释放，MHRA 的同事此前已在该体系中检测过 IL-12 等其他细胞因子23。这些阳性对照 CRS 抗体可增加 IL-12 的产生，但其敏感性并不高，因此在该检测模式下可能并非预测 CRS 的理想指标。一些细胞因子（如 IL-15 等）尚未进行测试，但我们方案中评估的这 4 种细胞因子已能较好地反映 CRS 的潜在风险。当然，具体检测的细胞因子可根据检测模式和所测试的抗体而有所调整。

综合来看，这些观察结果强调了以下要点：尽管参考试剂的使用有助于识别新抗体的细胞因子释放综合征（CRS）风险，但仍需谨慎，以避免采用次优的细胞因子释放检测（CRA）平台，此类平台可能无法识别出 CRS 潜在风险。至关重要的是，治疗性药物的预测作用机制，无论其为 通过 其Fc区域或其对表达抗原的细胞的假设作用机制必须与检测体系的生物学特性相匹配。因此，尽管本文讨论的测试治疗性抗体与参比试剂在作用机制上的差异可能带来一定局限性，导致针对测试抗体的合适细胞毒性风险评估（CRA）方法与参比试剂的生物学特性不兼容，该检测仍为危害识别提供了稳健且可靠的平台。然而，为充分确保安全性评价数据的可信度，可能需要采用多种CRA形式，涵盖不同的作用机制和免疫细胞亚群。

披露

EM 曾受雇于药品和医疗产品监管局（MHRA）。其余作者无利益冲突。

致谢

本工作由国家生物标准与控制研究所资助。我们感谢Sandra Diebold对稿件的审阅以及提出的有益评论和建议。我们还感谢Ka Seng Ieong参与视频拍摄。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 ml  微量离心管，自然色（无菌）StarlabS1615-5510
胎牛血清，经鉴定，热灭活ThermoFisher10500064
肝素化采血管ThermoFisher12967676
Heracell 150i CO2 培养箱ThermoFisher16406639
MESO QuickPlex SQ 120 人促炎因子 Panel 1 V-PLEX 检测试剂盒 Meso Scale DiscoveryK15049
MESO QuickPlex SQ 120MMMeso Scale DiscoveryAI1AA-0
改进型 Neubauer 血细胞计数板HawksleyAS1000
细胞因子释放试验用冻干重组抗体对照品组合NISBC19/156
PBSThermoFisher10010023
聚丙烯 96 孔微孔板 Corning3879
聚苯乙烯 96 孔微孔板Corning3799
RPMI 1640 培养基ThermoFisher11875093
Sorvall ST 40 离心机ThermoFisher75004525
无菌水ThermoFisher15230162

参考文献

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