需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

大鼠模型中尿道狭窄诱导及颊黏膜移植物尿道成形术

2.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65094

⸱

2023年4月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Center of the University of Lisbon (CCUL@RISE), Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2Department of Urology, Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte, 3Department of Vascular Surgery, Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte

本文内容

摘要

本方案中，首先在Wistar大鼠中建立尿道狭窄模型，随后采用颊黏膜移植物进行尿道重建。通过逆行尿道造影和激光多普勒血流评估，验证了尿道重建效果（狭窄形成后）及移植物的植入情况。

摘要

尿道重建是泌尿科医生的一项重要专业领域。当需要进行尿道移植时，口腔黏膜被认为是最佳选择，但在某些情况下，该方法可能不适用或需要优化以修复特定的尿道狭窄。因此，开发创新性手术方法并在实验模型中评估其潜在疗效，对于满足临床需求至关重要。基于这一目标，本研究描述了一种在Wistar大鼠中通过电灼法诱导尿道狭窄的实验方案。一周后，从下唇获取口腔黏膜移植物，以腹侧覆板方式实施尿道重建手术。逆行尿道造影结果显示，与狭窄诱导后相比，尿道成形术后尿道直径显著改善。此外，通过激光多普勒血流灌注分析评估移植物的植入情况。正如预期，深蓝色区域对应于无血管化的口腔黏膜移植物。该方法能够以可重复的方式成功模拟尿道损伤及组织调控的正常病理生理过程，以及使用口腔黏膜移植物进行尿道重建的过程，可为基于组织工程或尿道移植物的未来研究提供基础。

引言

尿道重建是泌尿外科医生在处理尿道狭窄、创伤或先天性缺陷所致尿道损伤时面临的主要挑战1。以治愈为目的，尿道成形术是大多数患者的首选治疗方法，其中长度较长（>2 cm）及前尿道缺损通常需要采用某种形式的替代性尿道成形术2。多种组织曾被用作尿道替代材料，包括生殖器或非生殖器区域的全厚或中厚皮片、膀胱壁黏膜，以及广泛应用的口腔颊黏膜2。口腔颊黏膜移植物具有多项优势，例如取材于湿润且无毛区域，易于获取，抗感染能力强，上皮层较厚，形成假性憩室的可能性较低，且固有层较薄，有利于早期血浆渗透和血管吻合3。与皮瓣不同，移植物本身无血供，其存活依赖于受区的血管床4。

移植物或皮瓣的动物模型已被广泛用于开发或优化外科技术，研究和理解组织生理学、潜在机制及失败原因，并评估创新治疗策略5,6。尽管较大的动物更便于技术操作，但啮齿类动物（尤其是大鼠和小鼠）更易于操作和饲养，抗病能力强，成本效益更高，更重要的是具备研究分子机制的工具，这对于测试创新疗法至关重要5,6。已有多种使用不同组织（包括皮肤、骨骼、肌肉6、血管5，甚至实体器官7）的皮瓣和移植物模型在大鼠中建立。然而，关于用于尿道重建或组织工程的移植物，小鼠模型的研究仍十分有限。

然而，转化医学科学的进步依赖于能够模拟疾病的动物模型。迄今为止，由于尿道重建通常在尿道狭窄后立即进行，局部病理生理环境尚未得到充分研究。本研究旨在局部病理生理环境下，采用颊黏膜移植物进行尿道重建。为实现这一目标，我们在尿道重建前1周先诱导尿道狭窄。该大鼠实验模型可为未来测试创新疗法及其分子机制与临床优势提供研究平台。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验均按照欧盟指令2010/63/EU的规定进行。实验程序经机构动物福利委员会批准，并由葡萄牙动物保护主管机构DGAV授权（许可证号：0421/000/000/2021）。本研究采用12至14周龄、体重400-500 g的雄性Wistar Han IGS（Crl:WI(Han)）大鼠，动物购自商业供应商（见材料表）。

1. 溶液的配制

  1. 麻醉溶液
    1. 用一支3 mL注射器吸取2.3 mL的美托咪定（1 mg/mL；按体重0.715 mg/kg），转移至一个15 mL离心管中。
    2. 用一支3 mL注射器吸取1.55 mL的芬太尼（0.05 mg/mL；按体重0.02 mg/kg），转移至同一个15 mL离心管中。
    3. 用一支10 mL注射器吸取6.15 mL的咪达唑仑（5 mg/mL；按体重9.5 mg/kg），转移至同一个15 mL离心管中，最终配制成10 mL麻醉溶液。
    4. 标记管子，并在避光条件下于4 °C保存。
      注：该麻醉组合（美托咪定、芬太尼和咪达唑仑）可提供长达3小时的麻醉手术窗口期。使用阿替美唑和氟马西尼可逆转其作用效果。
  2. 抗镇静溶液
    1. 用一支1 mL注射器吸取0.7 mL的阿替美唑（5 mg/mL；按体重3.72 mg/kg），转移至一个15 mL离心管中。
    2. 用一支10 mL注射器吸取9.3 mL的氟马西尼（0.1 mg/mL；按体重1.56 mg/kg），转移至同一个15 mL离心管中，最终配制成10 mL抗镇静溶液。
    3. 标记管子，并在避光条件下于4 °C保存。
  3. 术后镇痛溶液
    1. 用一支1 mL注射器吸取0.5 mL的卡洛芬（50 mg/mL；按体重5 mg/kg），转移至一个15 mL离心管中。
    2. 加入9.5 mL氯化钠溶液（0.9%），配制成10 mL卡洛芬溶液。
    3. 用一支1 mL注射器吸取1 mL的丁丙诺啡（0.3 mg/mL；按体重0.01–0.05 mg/kg），转移至一个15 mL离心管中。
    4. 加入9 mL氯化钠溶液（0.9%），配制成10 mL丁丙诺啡溶液。
    5. 标记管子，并在避光条件下于4 °C保存。
  4. 围手术期抗生素
    1. 用一支2.5 mL注射器吸取2.5 mL的恩诺沙星（25 mg/mL；按体重10 mg/kg），转移至一个15 mL离心管中。
    2. 加入7.5 mL氯化钠溶液（0.9%），配制成10 mL恩诺沙星溶液。
    3. 标记管子，并在避光条件下于4 °C保存。
      ​注：上述溶液所用全部试剂的详细信息列于材料表中。

2. 尿道狭窄的手术诱导

注意：手术操作使用体视显微镜（10倍）进行（参见材料表）。

  1. 使用前对所有手术器械进行灭菌：手术刀片（11号）、尖头镊子、弹簧剪、外科镊子、眼科持针器、手术剪和持针器。使用无菌棉球清洁手术区域。
  2. 在抓取大鼠之前，将麻醉溶液装入注射器中。
  3. 使用固定管或毛巾固定动物，并抬高尾巴以暴露腹部。
  4. 保持动物固定状态，进行腹腔注射麻醉溶液（按步骤1.1配制）。
  5. 检测大鼠的足底回缩反射，以评估麻醉效果。
  6. 在动物双眼涂抹保护性眼用凝胶。皮下注射抗生素溶液（按步骤1.1配制），剂量为10 mg/kg体重。
  7. 将大鼠仰卧位放置于加热垫上，并使用解剖显微镜（10倍或20倍放大）进行手术操作。
  8. 用聚维酮碘（100 mg/mL）清洁阴茎及周围腹部皮肤。
  9. 手动回缩包皮，并在阴茎头背侧做一浅表固定缝线（7.0缝线；参见材料表），以牵拉阴茎，保留持针器在原位以维持阴茎回缩状态。
  10. 使用润滑凝胶将22 G静脉导管插入尿道以进行导尿。
  11. 使用手术刀片（11号）在阴茎皮肤上做一条长约1 cm的纵向腹侧切口。
  12. 使用尖头镊子和弹簧剪分离阴茎组织层，直至在阴茎中段水平暴露尿道。
  13. 使用电凝设备（参见材料表），在阴茎中段水平的尿道两侧腹面部位（每侧一处），施加10 W电流，持续1秒。
  14. 用6.0可吸收连续缝合线关闭切口（参见材料表）。
  15. 移除尿道导管。移除阴茎牵引缝线。
  16. 进行镇痛药物的皮下注射：卡洛芬剂量为5 mg/kg体重，布托啡诺剂量为0.03 mg/kg体重。
  17. 将抗镇静溶液（按步骤1.2配制）装入注射器，在动物处于俯卧位时提起松弛皮肤，进行抗镇静溶液的皮下注射。

3. 采用口腔黏膜移植物的尿道成形术手术步骤

注意：手术操作使用体视显微镜（10倍）进行（参见材料表）。

  1. 将本次手术所需的所有外科器械进行灭菌处理：尖头镊子、弹簧剪刀、眼科持针器、手术剪刀、持针器、三把蚊式钳以及11号手术刀片。使用小纱布清洁手术区域。
  2. 按照前述方法（步骤2.2–2.8）给予麻醉剂、抗生素，实施动物固定并摆放体位。
  3. 使用聚维酮碘（100 mg/mL）清洁下唇颊黏膜、阴茎及周围腹部皮肤。
  4. 在下唇两侧及中央位置放置三根固定缝线（7.0缝线），每根缝线上各夹一把蚊式钳，以牵拉下唇并暴露其内侧黏膜。
  5. 使用弹簧剪刀和尖头镊子，切取直径为4 mm的下唇内侧颊黏膜移植物，并将其置于盛有无菌生理盐水（0.9% NaCl）的小容器中备用。
  6. 在供区使用纱布加压止血。
  7. 拆除先前放置于下唇的固定缝线。
  8. 按照前述方法（步骤2.9）暴露阴茎。
  9. 使用润滑凝胶将22 G静脉导管插入尿道以进行导尿。
  10. 使用弹簧剪刀在冠状沟下方做环形切口，并将阴茎皮肤向后剥离至根部。
  11. 使用尖头镊子和弹簧剪刀分离剩余组织层，暴露尿道。
  12. 使用11号手术刀片和弹簧剪刀，在距冠状沟远端3 mm处开始，沿腹侧做长度为4 mm的纵向切口，并在先前诱导狭窄的部位水平对尿道进行铲状切开（见步骤2）。
  13. 在铲状切开的两侧各放置一根7.0不可吸收固定缝线，并在每根缝线上夹持一把蚊式钳以牵拉尿道。
  14. 在铲状切开的两端各放置一根7.0不可吸收缝线。
  15. 将颊黏膜移植物以腹侧原位覆盖的方式放置，使黏膜面朝向尿道腔内。
  16. 将其中一根缝线穿过移植物的一端，并采用连续缝合法完成半椭圆形缝合。
  17. 在移植物另一侧重复步骤3.15和步骤3.16的操作。
  18. 拔除尿道导管，复位阴茎皮肤。
  19. 使用6.0可吸收间断缝线关闭环形的冠状沟下切口。
  20. 拆除阴茎牵引缝线。
  21. 按照步骤2.16–2.17所述，给予镇痛剂，随后给予抗镇静药物。

4. 术后监测

  1. 每小时观察大鼠三到四次，确认其从麻醉中恢复情况。监测呼吸，并评估足底和眼部反射。
  2. 每12小时皮下注射镇痛药，持续48小时。
    注意：卡洛芬按每500 mg体重给予1 mL的剂量注射，布托啡诺按每500 mg体重给予0.5 mL的剂量注射（参见 材料表).
  3. 每次操作后提供软食 48 小时，并提供水 随意摄取.
  4. 术后每天监测大鼠的健康状况和手术部位外观，并记录其健康状态。评估指标包括面部表情、发声、活动状态、疼痛迹象、食物和饮水摄入、排泄及出血情况。

5. 血流灌注评估

注意：在狭窄诱导前即刻、尿道成形术前即刻以及尿道成形术后即刻测量血流。

  1. 进行激光多普勒灌注成像。
    1. 使用麻醉溶液对大鼠进行麻醉（步骤 1.1）。
    2. 将大鼠仰卧置于 37 °C 的加热垫上，并进行阴茎牵引，操作如步骤 2.9 所述。
    3. 启动激光多普勒血流成像仪（见材料表）以获取数据。预先设定激光束扫描的感兴趣区域。
    4. 使用拮抗镇静溶液（步骤 1.2）逆转麻醉状态。
    5. 利用图像分析软件，在阴茎区域周围绘制感兴趣区域（ROI），并记录随时间变化的血流值。

6. 放射学评估

注意：尿道狭窄的诱导确认以及尿道成形术后狭窄的缓解情况需通过逆行尿道造影来确认。该评估在诱导狭窄后1周（尿道成形术前）以及尿道成形术后2周进行。

  1. 使用单平面血管造影系统进行逆行尿道造影（参见材料表）。
    1. 使用麻醉溶液对大鼠进行麻醉。
    2. 将动物置于血管造影床垫上，呈右侧斜卧位，并施加阴茎牵引，操作如步骤2.9所述。
    3. 将锥形束聚焦于动物骨盆区域，包括阴茎。
    4. 将22 G静脉导管向前推进2 mm，插入远端尿道。
    5. 开始向尿道内注入1 mL碘造影剂（623 mg/mL碘普罗胺溶液与0.9% NaCl按1:1比例混合）。
    6. 同时进行平片X线摄影，以观察造影剂充盈尿道管腔的情况，并评估尿道直径。
    7. 成像完成后，使用拮抗镇静剂溶液逆转麻醉状态。

7. 安乐死

注意：在尿道成形术后3周（狭窄诱导后4周），于最后一次灌注评估后立即实施安乐死。

  1. 用2.5 mL注射器抽取2 mL/kg的戊巴比妥钠（400 mg/mL）。
  2. 对动物进行腹腔注射该溶液以实施安乐死。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

共使用12只雄性Wistar大鼠，体重400–500 g，年龄12–14周，用于诱导尿道狭窄。术后1周进行逆行尿道造影（RUG1）8，以确认造模成功。在狭窄部位测量尿道直径，单位为毫米。随后，在大鼠尿道腹侧行口腔黏膜移植尿道成形术。同一组大鼠在尿道成形术后14天接受第二次逆行尿道造影（RUG2），并在移植物植入水平测量尿道直径（单位为毫米）。RUG1与RUG2的平均直径分别为1.04 mm和1.52 mm，显示尿道通透性显著改善（p < 0.0001）（图1），证实手术干预成功，且两次测量结果具有良好一致性。

在尿道成形术前后，还通过激光多普勒血流仪对局部灌注情况进行评估，作为一种无创方法来监测组织微循环环境。组织灌注情况以彩色编码图像显示，灌注较低或无灌注区域呈深蓝色，灌注最高区域呈红色。平均血流值通过使用Moor LDI V5.3图像处理软件获得（见材料表）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

采用颊黏膜移植物的尿道成形术是尿道重建的重要基石。然而，应开发创新性手术方法以优化现有术式，并建立新的方法，例如组织工程材料和生物移植物，以减少并发症和病态率。已有多种手术方案发表，用于建立临床前模型并定义外科技术。Souza 等人1开展了一项研究，纳入12只新西兰兔。行腹侧纵向皮肤切口，将尿道从白膜上松解，随后切除尿道背侧一段组织，形成缺损。同时，从颊部获取一块颊黏膜移植物，并以背侧覆板方式用7-0可吸收缝线固定。在本研究中，使用雄性Wistar 大鼠。由于体型更小，手术操作技术要求更高，但动物更易于操作。为模拟尿道狭窄的病理生理过程以及移植物存活的生理条件，在本模型中，尿道狭窄样病变需预先诱导，而非在尿道成形术同时制造尿道缺损。与Souza等人的方法类似，本研究也采用连续缝合将移植物与尿道闭合1。然而，本研究使用不可吸收缝线，以便在后续研究（如组织学研究）中识别移植物的周界。Martín-Cano 等人9建立了一种使用Wistar大鼠的模型。行包皮下环形切口，继而进行阴茎脱套，以充...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢里斯本北部大学医院中心放射科主任 João Leitão 以及放射科技师 Catia Fernandes 在实施尿道造影过程中的合作。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿替美唑OrionPharmaANTISEDAN（阿替美唑）用于逆转镇静和镇痛作用。
丁丙诺啡RichterPharma丁丙诺啡是蒂巴因阿片类生物碱的衍生物，其镇痛效力比吗啡强25-40倍，且作用持续时间更长。
卡尔蔡司 Opmi-1 FC 外科立体显微镜Carl Zeiss Microscopy, Germany蔡司OPMI 1 FC代表高品质、高精度和高可靠性。该手动系统操作简便，结合传奇的蔡司光学系统，可提供高保真图像。
卡洛芬Zoetis卡洛芬是一种丙酸类非甾体抗炎药（NSAID）。
导管 22 G. x 1''B BraunIntrocan Safety氟化乙烯丙烯（FEP）材质静脉导管，结构更坚固，适用于
动脉穿刺。
恩诺沙星Bayer恩诺沙星是一种氟喹诺酮类抗生素。
芬太尼Braun3644960芬太尼是一种强效合成阿片类镇痛药。
氟马西尼Fresenius Kabi苯二氮䓬类拮抗剂，用于完全或部分逆转苯二氮䓬类药物引起的镇静作用。
高温电灼器FiabF7244一次性电灼器，无菌，高温（1200 °C），28 mm细尖头。
Instillagel凝胶Farco-pharma基于纤维素的润滑剂，具有局部麻醉和消毒特性。
碘普罗胺Bayer含碘的非离子型注射用造影剂。
激光多普勒成像系统（灌注成像仪moorLDI2-HIR及专用软件）MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK5710血管生成模型采用激光多普勒成像技术评估后肢血流灌注，其中一侧肢体经手术结扎。专用测量与比较软件可定义缺血与非缺血肢体的感兴趣区域，用于评估血流，从而建立"再灌注比"，可在同一受试对象上根据需要多次、连续多日进行评估。
Lubrithal眼用凝胶Dechra用于动物麻醉期间预防干眼的眼用凝胶，对角膜和结膜具有润滑和保湿作用。
雄性Wistar Han IGS（Crl:WI(Han)）大鼠Charles River Laboratories, 中国台湾12至14周龄
美托咪啶Virbac037/01/07RFVPT美托咪啶是一种用作手术麻醉的合成药物。
咪达唑仑Labesfal苯二氮䓬类药物，用于麻醉和操作镇静。
Monoplan血管造影系统Philips Medical SystemsAzurion 7 M20固定式诊断性荧光透视X射线系统，专为优化用户对心脏、大脑及其他器官血管系统以及淋巴系统的解剖结构和功能进行视觉与定量评估能力而设计。
蚊式止血钳Henry Schein102-4346Hartman-Mosquito止血钳，弯型，3-1/2"，不锈钢
持针器Henry Schein100-2570Mayo-Hegar持针器，不锈钢，14 cm
眼科持针器AsicoAE-6143Barranquer精细无锁持针器
戊巴比妥钠Ecuphar戊巴比妥钠是戊巴比妥的钠盐，用于安乐死。
尖头镊AesculapBD335R显微镊，0.30 mm尖端
Polysorb 6.0Medtronic (Covidien)UL-101涂层合成可吸收缝线，旨在减少组织中的炎症反应，随后由纤维结缔组织逐渐包裹。
聚维酮碘Mylan10%聚维酮碘是一种抗菌药物，用于手术前后消毒。
手术刀片编号º11B BraunBB511碳钢，无菌
弹簧剪Henry Schein600-4826Castroviejo手术剪，31号
手术镊AesculapBD33R显微镊，0.20 mm尖端
手术剪AesculapMA873R显微虹膜剪，弯型锐尖
SurgiPro 7.0Medtronic (Coviden)VP-702-X非吸收性单丝聚丙烯缝线，适用于一般软组织结扎。

参考文献

  1. Souza, G. F., Calado, A. A., Delcelo, R., Ortiz, V., Macedo, A. Histopathological evaluation of urethroplasty with dorsal buccal mucosa: an experimental study in rabbits. International Brazilian Journal of Urology. 34 (3), 345-354 (2008).
  2. Andrich, D. E., Mundy, A. R. Urethral strictures and their surgical treatment. BJU International. 86 (5), 571-580 (2000).
  3. Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU International. 93 (6), 807-811 (2004).
  4. Fu, Q., et al. Substitution urethroplasty for anterior urethral stricture repair: comparison between lingual mucosa graft and pedicled skin flap. Scandinavian Journal of Urology. 51 (6), 479-483 (2017).
  5. Blain, B., et al. Vascular grafts in the rat model: an anatomic study. Microsurgery. 21 (3), 80-83 (2001).
  6. Schmauss, D., Weinzierl, A., Schmauss, V., Harder, Y. Common rodent flap models in experimental surgery. European Surgical Research. 59 (3-4), 255-264 (2018).
  7. You, H., et al. A rat orthotopic renal transplantation model for renal allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (180), e63464(2022).
  8. Park, J. H., et al. Balloon-expandable biodegradable stents versus self-expandable metallic stents: a comparison study of stent-induced tissue hyperplasia in the rat urethra. Cardiovascular and Interventional Radiology. 42 (9), 1343-1351 (2019).
  9. Martín-Cano, F., et al. Histological and immunohistochemical changes in the rat oral mucosa used as an autologous urethral graft. Journal of Pediatric Surgery. 48 (7), 1557-1564 (2013).
  10. Hofer, M. D., et al. Analysis of primary urethral wound healing in the rat. Urology. 84 (1), e1-7 (2014).
  11. Tavukcu, H. H., et al. Protective effect of platelet-rich plasma on urethral injury model of male rats. Neurourology and Urodynamics. 37 (4), 1286-1293 (2018).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

尿道成形术大鼠模型尿道重建电灼诱导狭窄腹侧带蒂移植物逆行尿道造影血流灌注分析组织工程移植物植入
大鼠模型中尿道狭窄诱导及颊黏膜移植物尿道成形术
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。