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Summary

本实验采用Box-Behnken实验设计-响应面法优化了羊藿果油加工技术，初步研究了粗提和优化水提取EF对斑马鱼胚胎发育的影响。

Abstract

作为一种传统中药（TCM），淫羊藿（EF）在医学和食品方面已有>2000年的历史。临床上，用羊油加工的EF常被用作药物。近年来，使用EF作为原料的产品的安全风险和不良反应的报告逐渐增加。加工可以有效提高中药的安全性。根据中医理论，羊油加工可以降低EF的毒性，增强其对肾脏的滋补作用。然而，对EF羊油加工技术缺乏系统的研究和评价。本研究采用Box-Behnken实验设计-响应曲面方法，通过评估多个组分的含量来优化加工技术的关键参数。结果表明，EF的最佳羊油加工工艺为:将羊油在120 °C±10 °C加热，加入粗EF，在189 °C±10 °C轻轻翻炒至均匀光泽，然后取出冷却。每100公斤EF，应使用15公斤羊油。在斑马鱼胚胎发育模型中比较了粗水和羊油加工EF水提取物的毒性和致畸性。结果表明，粗草本组更容易引起斑马鱼畸形，其半最大致死EF浓度较低。综上所述，优化后的羊油加工技术稳定可靠，重复性好。在一定剂量下，EF水提取物对斑马鱼胚胎的发育有毒，对生药的毒性强于对加工药物的毒性。结果表明，羊油加工降低了原油EF的毒性。这些发现可用于提高羊油加工EF的质量、均匀性和临床安全性。

Introduction

Epimedii folium（EF）是Epimedium brevicornu Maxim.，Epimedium sagittatum （Sieb. et Zucc.）的干燥叶子。Maxim.，Epimedium pubescens Maxim.，或Epimedium Koreanum Nakai。EF可用于治疗骨质疏松症、更年期综合征、乳腺肿块、高血压、冠心病^等疾病1.作为一种传统中药（TCM），EF在医学和食品领域已有2000多年的历史。由于其价格低廉，补肾效果显著，被广泛用于医药和保健食品。EF是用羊油炒制而成的，这一过程最早在刘宋时期^雷霄撰写的《雷功加工理论》中有所描述。粗EF和炒EF的功效完全不同。粗EF主要祛风湿，而炒EF则温肾^补阳3。目前，EF被广泛用作药品和保健食品的原料;上市中成药399种，进口保健食品9种，以EF^为原料的国产保健食品455种。该药材具有很大的应用前景。但近年来，保健食品和中成药以EF为原料引起不良反应和人体肝损伤的报道越来越多，相关毒性研究⁵、^6、7报道EF作为原料存在安全隐患。

中药加工是指能够有效降低或消除毒性，提高中药安全性的制药技术。EF的传统加工方法是用羊油炒，降低了EF的毒性，增强了其温肾^{益阳的作用}8。此加工方法收录于《中国药典》及各种加工规范¹.EF的工艺仅规定如下:每100公斤EF加入20公斤羊油（精制），温和烧制至均匀有光泽^1.上述标准中没有严格的EF处理方法参数，因此当地的处理规范尚未统一以提供一致性。因此，对EF过程进行系统研究将是有用的。本文采用Box-Behnken实验设计-响应面方法对EF的加工工艺进行了优化。

Box-Behnken 实验设计是一种通常用于优化过程中因子的方法。通过建立多元回归方程拟合因子与效应值之间的函数关系，可以优化提取参数。最近，该方法已被广泛用于研究中药提取⁵，⁶，⁷和加工⁹，^10，11。各种研究报道了中药制备方法，包括盐加工、葡萄酒加工和按照Box-Behnken设计进行炒菜，例如盐加工补骨脂¹²，葡萄酒加工的刺胞菌¹³和烤肉桂¹⁴。该方法测试时间短，测试精度高，适用于多因素、多级测试。该方法比正交设计试验方法简单，比统一设计方法¹⁵更全面。获得的关系可以确定测试范围内任何测试点的预测值，这是一个很大的优势。斑马鱼模型可用于测试EF在加工后的毒性是否较低。

在中药毒性研究中，斑马鱼模型具有细胞实验通量高和与啮齿动物实验相似性的双重优势¹⁶。该模型的特点是体积小，产卵率高，繁殖周期短，易于繁殖。该模型可用于细胞培养板的大规模同步实验，实验用药量小，实验周期短，成本低，整个实验过程易于观察和操作¹⁷.斑马鱼胚胎是透明的，发育迅速。因此，可以在显微镜下直接观察到药物在不同发育阶段对内脏组织的毒性和致畸作用¹⁸。斑马鱼与人类的基因同源性高达85%¹⁸。斑马鱼的信号转导途径与人类相似¹⁸。斑马鱼的生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似¹⁸。因此，用于药物测试的斑马鱼模型可以提供可靠且完全适用于人类的实验动物¹⁹。

本研究采用Box-Behnken设计-响应面法，以淫羊藿苷、淫羊藿素A、淫羊藿素B、淫羊藿素C、宝贝壳苷I等含量为评价指标，对EF加工工艺中羊肉油的用量、温度和油炸温度进行优化。利用斑马鱼模型初步探讨EF水提取物对斑马鱼加工前后胚胎发育的影响，评价加工对EF的衰减效果。

Protocol

所有动物相关实验均经重庆中医药研究院实验伦理委员会批准进行（实验动物伦理审查证书编号:ZJS2022-03）。

1. 生物活性成分的测定

注:本研究使用的物种为 淫羊藿矢状，样本采集于重庆丰都县。该样本被鉴定为 E. sagittatum （Sieb. et Zucc.）的干燥地上部分。格言。由重庆中医药研究所生物医学研究所的研究人员提供。

1. 使用电子分析天平准确称取淫羊藿苷、淫羊藿素A（EA）、淫羊藿素B（EB）、淫羊藿素C（EC）和宝活苷I（BI）各对照品的适量，制备对照品溶液，并溶于甲醇中。使用这些制备含有 381.61 μg/mL 淫羊藿苷、124.14 μg/mL EA、110.24 μg/mL EB、1091.75 μg/mL EC 和 184.98 μg/mL BI 的混合参比储备溶液。
2. 通过3号筛粉碎EF来制备测试产品溶液。将约0.2g（使用电子分析天平）粉碎的EF放入带塞锥形瓶中，加入20mL稀乙醇，然后在400W功率和50kHz频率下超声处理1小时。摇匀，通过0.22μm膜过滤器，得供试品溶液。
3. 按如下方式进行色谱分析。使用尺寸为4.6 mm x 250 mm，内径为5 μm的C₁₈ 色谱柱的高效液相色谱（HPLC）。使用乙腈作为流动相A，超纯水作为流动相B.使用以下梯度洗脱参数:0-30分钟，24%A至26%A;30-31分钟，26%A至45%A;31-45分钟，45%A至47%A.使用220nm的检测波长（对于使用的检测器，请参见 材料表）。将柱温保持在30 °C，当前速度保持在1.0 mL/min，并使用10 μL的样品量。
4. 为了研究线性关系，请使用步骤1.1中分别稀释2倍，4倍，8倍，16倍和32倍的混合参比溶液，用于淫羊藿苷，EA，EB，EC和BI。使用乙腈作为流动相A，超纯水作为流动相B。
5. 使用以下梯度洗脱参数:0-30分钟，24%A至26%A;30-31分钟，26%A至45%A;31-45分钟，45%A至47%A.使用220nm的检测波长（对于使用的检测器，请参见 材料表）。将柱温保持在30 °C，当前速度保持在1.0 mL/min，并使用10 μL的样品量。最后，记录峰值面积。使用专业软件绘制以参考浓度（x轴，μg/mL）为横坐标，以峰面积（y轴）为纵坐标的线性回归图（参见 材料表）。
6. 使用步骤1.3所示的色谱条件，通过HPLC连续测量混合对照溶液六次来进行精密度测试。记录每种化学成分的检测时间和峰面积，并使用以下公式计算峰面积的相对标准偏差（RSD），以评估精密度（重现性）:
   RSD% = 计算结果的标准偏差 （SD）/算术平均值 （X） x 100 %
7. 进行重现性试验，准确称取EF粉末，按步骤1.2中的方法平行制备六份供试品溶液。在步骤1.3所示的色谱条件下将制备的溶液置于HPLC中。记录每种化学成分的保留时间和峰面积，并根据标准曲线（峰面积与浓度）计算每种化合物的量。按上述方式计算 RSD%。
8. 为了进行稳定性测试，将测试溶液储存在室温下，并通过步骤1.3中描述的HPLC方法在制备后0小时，2小时，4小时，8小时，12小时和24小时测量其含量以评估稳定性。记录每种化学成分的保留时间和峰面积，并计算峰面积的RSD%，如上所述。
9. 要进行样品回收测试，将0.2 g EF粉末称取到带塞锥形瓶中重复六次。加对照品溶液适量（加入供试品的对照品量相当于供试品已知含量的100%），照步骤1.2所示方法制备供试品溶液。
10. 将样品注入色谱仪，根据步骤1.3中的色谱条件进行分析。记录峰面积，并计算平均回收率和RSD%值，如下所示:
    加标样品回收率 = （加标样品含量 − 样品含量）/样品量 x 100%

2. 基于Box-Behnken设计-响应曲面方法的EF羊油加工技术优化

1. 选择EF加工中的关键参数，如羊油用量（A;15%-35%）、羊油温度（B;50-120°C）、油炸温度（C;80-300°C）作为影响因素。使用淫羊藿苷、EA、EB、EC和BI含量的综合得分作为评价指标。这里的羊油百分比是质量百分比。
2. 使用响应面分析软件（见 材料表）设计Box-Behnken响应面实验，探索二次响应面，并构建二阶多项式模型。选择新的 Box-Behnken 设计，并将数值因子选项设置为 3;设置因子 A、B 和 C。单击” 继续“。将”响应”选项设置为 1（这是综合分数）。单击 “继续 “以完成设计。共计划进行17次实验（见 表1）。
   注意:有关自变量和因变量及其低、中、高水平，请参见 表 2。
3. 根据 表1中的具体参数处理EF;例如，对于订单号1，称取精制羊油为15% V/V，然后加热至50°C使其融化。将粗EF加入融化的羊肉中，用小火（190°C）翻炒至均匀光泽，然后取出冷却。进行了17次实验操作。本工作共获得17组EF加工产品。
   注意:羊肉油在室温（25°C）下是固体，加热时会融化成液体。液态羊油可用作赋形剂。
4. 按照步骤1.2中描述的方法制备加工产品的测试溶液。然后，根据步骤1.3中所述的色谱条件使用HPLC对其进行分析。记录每种化学成分的保留时间和峰面积，并根据外部标准曲线计算每种测试溶液中淫羊藿苷、EA、EB、EC和BI的含量。使用以下综合分数计算公式计算17个实验组的综合分数:
   综合分数 = Z/Z 最大值 × 0.5 + BI/BI_最大值 × 0.5
   其中 Z 是淫羊藿苷、EA、EB 和 EC 含量的总和;Z_max 是17个实验组中淫羊藿苷、EA、EB和EC含量之和的最大值;BI 是 BI 内容;BI_max 是17个实验组中BI含量的最大值。
5. 将17组实验的综合评分结果导入数据分析软件（见 材料表）对实验数据进行分析。在评估项下，选择二次处理顺序选项和多项式模型类型选项。

3. 测试加工对斑马鱼胚胎发育的影响

1. 样品制备
   1. 通过3号筛将原油和加工后的EF粉碎（见 材料表）。向每个 EF 样品的 100 g 中加入 1，000 mL 超纯水。将EF浸泡0.5小时，将水煮沸两次，每次30分钟，然后用滤纸过滤。
   2. 合并滤液并通过加热浓缩样品。将超纯水加入至最终体积为 100 mL，以获得处理后的 EF（PEF，1 g/mL）和粗 EF（CEF，1 g/mL）储备溶液。测量每种储备溶液中的原料药量。
   3. 将 1 mL、1.5 mL、2.5 mL、5 mL 和 7.5 mL 储备溶液等分试样放入 10 mL 容量瓶中，然后加入超纯水至体积，制备浓度为 100 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL、250 mg/mL、500 mg/mL 和 750 mg/mL 的测试溶液，用于斑马鱼胚胎毒性研究。
      注:参考相关文献20^，21并通过进行初步实验来制备测试溶液的浓度，以得到正常毒理学中使用的¹⁰倍浓度梯度。CEF是未经加工的样品，PEF是用第2节所述的最佳加工技术制备的样品。
2. 斑马鱼饲养和胚胎治疗²¹
   1. 在受控温度下适应野生型斑马鱼（见 材料表）2天，将它们保存在pH 7.0-7.4的流通水族箱中，每天喂食两次。
      注意:通过在培养基中加入浓度为0.003%（质量/体积）的1-苯基-2-硫脲来实现对斑马鱼黑色素形成的抑制，从而使它们的身体透明以进行形态学观察。
   2. 晚上选择成年可育野生型斑马鱼，并在交配箱中使用挡板将它们分开。第二天早上取下挡板，让鱼产卵 30 分钟。每15分钟用滴管收集受精卵。总共收集了520个健康的野生型胚胎。将斑马鱼胚胎保持在28.5°C的培养箱中24小时。
   3. 在受精后24小时（hpf）将健康胚胎随机分配到13组，并与一个对照组一起，分别浸泡在培养皿中的以下每种溶液的10mL中:PEF:100μg/mL，150μg/ mL，200μg/ mL，250μg/ mL，500μg/ mL，750μg/ mL;持续进频: 100 微克/毫升， 150 微克/毫升， 200 微克/毫升， 250 微克/毫升， 500 微克/毫升， 750 微克/毫升.用培养基处理空白对照组作为溶液。在这项研究中，每组包含40个胚胎。
      注意:培养基组成为 0.15 M NaCl、5 mM KCl、0.25 mM Na 2 HPO 4、0.45 mM KH 2 PO 4、1.3 mM CaCl₂、1.0 mM MgSO 4 和 ₄ mM NaHCO₃。
   4. 在恒温培养箱中培养斑马鱼，最高可达120 hpf。每天计算死亡幼虫的数量，在体视显微镜下观察每个实验组中幼虫的主要器官形态（比例尺= 500μm，见材料表），并使用数据分析软件计算斑马鱼在72hpf下的半死亡浓度（LC₅₀）（见材料表）。

Representative Results

Discussion

自变量及其水平的确定
EF加工技术仅在2020年版《中国药典》和^全国26个省、市、自治区公布的地方中药加工规范中有所描述1。描述涉及以下步骤:取羊油加热融化，加入EF丝，用慢火炒至均匀有光泽，取出，冷却。此外，每 100 公斤淫羊藿使用 20 公斤（缩写为 20%）羊油（精制）。但是，未指定EF处理过程的参数。本实验的自变量中，可以量化生产过程中的三个关键因素:羊油用量、羊油温度和油炸温度。应根据上述描述设置值范围。从初步试验的结果可以看出，当羊油用量为15%时，EF叶子可以均匀地涂上羊油。当用量超过35%时，羊油过多。最后，羊油用量范围应在15%-35%。当温度达到50°C时，羊油融化。当温度达到>120°C时，羊油开始冒烟，温度过高。因此，羊油的温度范围应在50°C-120°C。 中国药典2020年版规定，EF要用慢火炒。慢火不应超过200°C，油炸温度应在80°C-300°C之间。

综合评分
在淫羊藿的加工过程中，糖苷键断裂，糖苷组分转化为低糖苷组分。2020年版《中国药典》EF加工品含量的测定，是以原药材中淫羊藿苷、EA、EB、EC总含量的测定为依据，单糖苷类成分BI作为指标单独列出。在本实验中，处理后的EF中淫羊藿苷，EA，EB和EC的总重量为50%，BI的权重为50%，并根据这些值设置综合分数。

响应面方法 （RSM） 是一种用于识别最佳过程参数和解决多变量问题的统计技术。在该技术中，采用合理的实验设计通过实验获得某些数据，并采用多元二次回归方程推导因子与响应之间的函数关系²²。常用的是均匀设计和正交设计过程优化，但其检验精度不高，数学模型的可预测性不强。RSM背后的数学模型是高度可预测的。RSM需要更少的实验和更短的周期，不仅可以消除与传统数理统计相关的问题，还可以阐明因子与响应之间的关系²³。RSM将系统的响应概念化为一个或多个因素的函数，并使用图形技术来显示这种功能关系，以帮助用户通过直观的视觉观察在实验设计中选择最佳条件。这些优点导致该方法在化学工业²⁴，生物工程，食品工业²⁵，制药工业和中药制剂中的广泛使用。

尽管RSM可以识别响应（要研究的指标）和因子（自变量）之间的函数关系，但并非所有实验都适合响应面优化，因为响应和因子之间并不总是存在很强的函数关系。RSM 通常获得连续函数关系，这要求所有因子都是连续变量。然而，并非所有要研究的因素都是连续变量，或者在实验设计开始时对响应值有显著影响。为了减少实验次数，提高响应面建模的准确性，在进行响应面设计方法之前，需要筛选显著因子并通过因子设计、均匀设计或正交设计来确定其水平。响应面方法的最大优点是，一旦模型正确建立，就可以预测任意条件组合下的响应值，并且可以通过3D响应面更直观、直观地看到函数关系。这种可视化对研究人员找到最佳加工条件有很大帮助²⁶。

本研究利用RSM的Box-Behnken设计原理，以EF的综合化学含量得分为响应值，设计了17个组合实验。最后，通过回归分析得到最佳的工艺优化结果。加工工艺优化如下:将羊油在120°C±10°C加热，加入粗EF，用温火（189°C±10°C）煎至均匀光泽，然后取出冷却。每100公斤EF，应使用15公斤羊油（精炼油）。结果表明，EF工艺稳定、可靠且可重复。此外，分析了因子交互作用，羊油用量与煎炸温度的交互作用显著，但其他因子之间的交互作用不显著。本研究表明，响应面设计作为一种分析因子间相互作用以及因子与其响应面值之间的关系的方法，能够以最少的实验次数在短时间内优化处理条件。本研究中选择的因子是单因素筛选实验中确定的关键因子，并在初步实验中确定其水平。测试样本符合响应面法的特征，因此研究能够使用响应面法建立预测模型。实验结果可为提高处理EF的质量和均匀性提供参考。

斑马鱼胚胎被用作发育遗传学领域的模式生物，因为它们是透明的， 体外发育并且易于观察²⁷。发育毒性研究中常用的斑马鱼毒性指标包括胚胎死亡率、胚胎畸形率、卵黄囊水肿、色素形成、卵子凝结、尾巴伸展、头部形态和体段形成等²⁸.与哺乳动物毒性评价技术相比，斑马鱼胚胎对化合物毒性检测的特异性为70%-80%，灵敏度超过80%¹⁸。Ton等人²⁹ 发现，斑马鱼胚胎评估非致畸化合物发育毒性的准确率为75%。致畸化合物在这里以100%的准确性进行了评估。虽然中药具有成分复杂、靶器官毒性不明确等特点，但斑马鱼胚胎仍可作为实验动物模型，对发育毒性进行准确、快速的评价。他等³⁰ 发现大黄素影响斑马鱼胚胎的存活和孵化率，引起躯干弯曲和卵黄囊水肿。Chen等³¹ 发现斑马鱼胚胎引起心包水肿、脊柱弯曲和卵黄囊水肿。他等人³² 发现，红参对斑马鱼在所有发育阶段都有致死作用，1.0mg/L的桫椤抑制胚胎发育，导致斑马鱼胚胎中体细胞数量减少、尾巴畸形、身体弯曲和黑色素减少。

为研究粗EF和加工EF对斑马鱼胚胎发育的影响，本研究进行了斑马鱼胚胎发育毒性实验。数据显示，粗组（S）的LC 50值为151.3 μg/mL，加工组（P）的LC₅₀ 值为219.8 μg/mL。通过显微镜观察各实验组斑马鱼体，粗组斑马鱼致畸性明显。大多数鱼类表现出不同程度的致畸性，包括脊柱畸形、身体弯曲畸形、心包水肿、鱼鳔不完全或肝脏变形，这些观察结果在处理组中很少见。这些实验表明，加工后EF的毒性显著降低，表明加工可以降低人体的药物毒性。实验结果为提高羊油加工EF的临床用药安全性提供了参考。

中医认为，肾脏的功能与人体的生长、发育和繁殖密切相关³³。中医古籍记载，肾脏是人体的骨髓。肾脏储存精华，骨髓驻留在骨腔中滋养骨骼。当肾精不足时，骨髓减少³⁴。补肾阳的中医可治疗腰椎衰弱、骨质疏松、阳痿、早泄、子宫寒不孕³⁵.EF是补肾阳的代表性药材之一。现代药理研究表明，EF对骨骼系统、免疫系统、生殖系统、心血管系统和神经系统有明显作用，并具有抗肿瘤作用³⁶。在骨骼系统的活性方面，淫羊藿苷³⁷ 可以提高卵巢切除大鼠血清E₂ 的水平，并上调ERβ mRNA在卵巢切除大鼠骨组织中的表达。ERβ的合成增加，从而提高ER的生物学效应，削弱破骨细胞的骨吸收活性，增强成骨细胞的骨形成。骨吸收的变化大于骨代谢的负平衡。淫羊藿素A通过抑制破骨细胞的形成、分化和骨吸收，改善骨质疏松模型小鼠的骨微观结构和血清骨转换标志物，并起到骨保护作用³⁸。淫羊藿素C具有明显的抗骨质疏松活性，主要表现为增加骨量和改善小梁微观结构，最终增加骨强度³⁹。其他研究表明，淫羊衄黄素B⁴⁰ 和宝火苷I⁴¹ 具有抗骨质疏松活性。

Materials

Acetonitrile	Fisher	197164
Baohuoside <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65096/65096eq01.jpg" style="margin: auto;"/> (B<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65096/65096eq01.jpg" style="margin: auto;"/> )&nbsp;	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20042402
Chromatographic column	Waters Corporation	Symmetry C<sub>18</sub>
Design Expert software	Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN	Trial Version8.0.6.1
Detector	Waters Corporation	2998
Disintegrator	Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.	S-FS553
Electronic analytical balance	Mettler-Toledo International Inc.	MS205DU
Epimedin A (EA)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-21112118
Epimedin B (EB)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20080403
Epimedin C (EC)	Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.	MUST-20080310
Ethanol	Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd.	20180801
Graphpad software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	6.02
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)	Waters Corporation	2695
Icariin	Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.	21091401
Methanol	Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd.	20171101
Microporous membrane	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.	0.22&mu;m
Mutton oil	Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store	20211106
Office Excel office software	Microsoft	Office Excel 2021
Pharmacopoeia sieve	Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.	R40/3
Pure water machine	Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd.	AT Sro 10A
Qualitative filter paper	Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd.	18cm
Stereomicroscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Stemi 2000
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.	BUG25-12
Zebrafish	China Zebrafish Resource Center (CZRC)	The AB strain