淫羊藿叶羊油炮制工艺的优化及其对斑马鱼胚胎发育影响的检测

摘要

本实验通过应用Box-Behnken实验设计-响应面法优化了淫羊藿叶（EF）的羊油炮制工艺，并初步研究了生品及优化后水提淫羊藿叶对斑马鱼胚胎发育的影响。

摘要

作为一味传统中药，淫羊藿叶（Epimedii folium, EF）在药食两用方面具有悠久的历史 > 2,000年。临床上，经羊油制备的附子（EF）常作为药物使用。近年来，以附子为原料的药品安全风险及不良反应报道逐渐增多。炮制可有效提高中药的安全性。根据中医理论，羊油炮制可降低附子的毒性，并增强其补肾功效。然而，目前尚缺乏对附子羊油炮制工艺的系统性研究与评价。本研究采用Box-Behnken实验设计-响应面法，通过测定多种成分含量，优化炮制工艺的关键参数。结果表明，附子羊油炮制的最佳工艺为：将羊油加热至120 °C ± 10 °C，加入净附子，文火翻炒至189 °C ± 10 °C，炒至表面均匀显光泽，取出放凉；每100 kg附子，用羊油15 kg。采用斑马鱼胚胎发育模型，比较生附子与羊油炮制附子水提物的毒性和致畸性。结果显示，生药组更易引起斑马鱼畸形，其半数致死浓度（EF）较低。综上所述，优化后的羊油炮制工艺稳定可靠，重复性良好。在一定剂量下，附子水提物对斑马鱼胚胎发育具有毒性，且生品毒性强于炮制品。结果表明，羊油炮制可降低生附子的毒性。本研究结果可为提高羊油制附子的质量、均一性及临床用药安全性提供依据。

引言

淫羊藿（Epimedii folium，EF）为淫羊藿属植物Epimedium brevicornu Maxim.、Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim.、Epimedium pubescens Maxim. 或Epimedium koreanum Nakai的干燥叶。EF可用于治疗骨质疏松症、更年期综合征、乳腺增生、高血压、冠心病及其他疾病¹。作为一味中药，EF具有两千多年的药食同源历史。因其价格低廉且补肾功效显著，被广泛应用于药品和保健食品中。EF的传统炮制方法为羊油炙法，最早见于南北朝刘宋时期雷敩所著的《雷公炮炙论》²。生淫羊藿与炙淫羊藿的功效差异较大：生品以祛风湿为主，而炙品则偏于温肾助阳³。目前，EF作为原料被广泛用于药物和保健食品中，以EF为原料的国产中成药有399种，进口保健食品9种，国产保健食品455种⁴，该药材具有广阔的应用前景。然而近年来，以EF为原料的保健食品和中成药所致不良反应及人肝损伤的报道日益增多，相关毒性研究^5,6,7<....

方案

所有动物相关实验均经重庆市中医院实验伦理委员会批准（实验动物伦理审查证书编号：ZJS2022-03）。

1. 生物活性成分的测定

注意：本研究所用物种为Epimedium sagittatum，样品采自重庆市丰都县。经重庆市中药研究院生物医学研究所研究人员鉴定，该样品为E. sagittatum（Sieb. et Zucc.）Maxim.的干燥地上部分。

1. 使用电子分析天平准确称取适量的各对照品，即淫羊藿苷、宝藿苷I（BI）、朝藿定A（EA）、朝藿定B（EB）和朝藿定C（EC），用甲醇溶解。配制混合对照品储备液，其中含淫羊藿苷381.61 µg/mL、EA 124.14 µg/mL、EB 110.24 µg/mL、EC 1091.75 µg/mL、BI 184.98 µg/mL。
2. 将淫羊藿（EF）粉碎后过3号筛。取约0.2 g（使用电子分析天平）粉碎后的EF样品，置于带塞锥形瓶中，加入20 mL稀乙醇，于400 W功率、50 kHz频率下超声处理1小时。充分振摇后，经0.22 µm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
3. 按以下条件进行色谱分析：采用C₁₈色谱柱（4.6 mm × 250 mm，内径5 µm）进行高效液相色谱（HPLC）分析。以乙腈为流动相A，超纯水为流动相B。采....

结果

方法学考察结果
淫羊藿苷、EA、EB、EC、BI 的浓度与色谱峰面积之间呈良好的线性关系（见表3）。淫羊藿苷、EA、EB、EC 和 BI 的色谱峰面积的 RSD% 值（n = 6）分别为 0.28%、1.22%、0.65%、1.67% 和 1.06%，表明 HPLC 测定的精密度良好。淫羊藿苷、EA、EB、EC 和 BI 含量的 RSD% 值（n = 6）分别为 1.59%、1.46%、1.86%、2.29% 和 0.98%，表明该方法重复性良好。样品中淫羊藿苷、EA、EB、EC 和 BI 峰面积的 RSD% 值（n = 6）分别为 1.49%、1.96%、1.42%、0.96% 和 0.81%，表明样品溶液在 24 小时内稳定。淫羊藿苷、EA、EB、EC 和 BI 的平均加样回收率分别为 99.98%、100.14%、100.09%、100.75% 和 100.94%，RSD% 值分别为 0.56%、0.78%、0.84%、1.10% 和 1.47%（见表4）。结果表明，该方法的准确度符合要求。

讨论

自变量及其水平的确定
淫羊藿（EF）的炮制工艺仅在《中华人民共和国药典》2020年版以及全国26个省、直辖市和自治区发布的中药炮制规范中有描述¹。其描述包括以下步骤：取羊油加热至熔化，加入淫羊藿饮片，用文火炒至均匀、显光泽，取出，放凉。此外，每100 kg淫羊藿用精制羊油20 kg（简称为20%）。然而，淫羊藿炮制工艺的具体参数并未明确。在本实验的自变量中，生产过程中可量化的三个关键因素为：羊油用量、羊油温度和炒制温度。其取值范围应依据上述描述设定。根据预试验结果可知，当羊油用量为15%时，淫羊藿叶片可被羊油均匀包裹；当用量超过35%时，羊油过多。因此，羊油用量的合理范围应为15%–35%。当温度达到50 °C时，羊油开始熔化；当温度达到>120 °C时，羊油开始冒烟，温度过高。因此，羊油的温度范围应设定为50 °C–120 °C。《中华人民共和国药典》2020年版规定淫羊藿应以文火炒制，文火温度不应超过200 °C，炒制温度范围应在80 °C–300 °C之间。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈	Fisher	197164
宝藿苷 （B）	成都曼斯特生物科技有限公司	MUST-20042402
色谱柱	Waters Corporation	Symmetry C18
Design Expert 软件	Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN	试用版 8.0.6.1
检测器	Waters Corporation	2998
粉碎机	合肥荣事达小家电有限公司	S-FS553
电子分析天平	梅特勒-托利多国际有限公司	MS205DU
淫羊藿次苷 A（EA）	成都曼斯特生物科技有限公司	MUST-21112118
淫羊藿次苷 B（EB）	成都曼斯特生物科技有限公司	MUST-20080403
淫羊藿次苷 C（EC）	成都曼斯特生物科技有限公司	MUST-20080310
乙醇	重庆川东化工（集团）有限公司	20180801
GraphPad 软件	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	6.02
高效液相色谱（HPLC）	Waters Corporation	2695
淫羊藿苷	成都吉必生物技术有限公司	21091401
甲醇	重庆川东化工（集团）有限公司	20171101
微孔滤膜	天津津腾实验设备有限公司	0.22μm
羊油	阔山芝牛生鲜食品店	20211106
Office Excel 办公软件	Microsoft	Office Excel 2021
药典筛	绍兴上虞华丰五金仪器有限公司	R40/3
纯水机	重庆安德森环保设备有限公司	AT Sro 10A
定性滤纸	上海雷鼓仪器有限公司	18cm
体视显微镜	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Stemi 2000
超声波清洗器	必能信超声（上海）有限公司	BUG25-12
斑马鱼	中国斑马鱼资源中心（CZRC）	AB 品系