淫羊藿叶羊油加工技术优化及检验其对斑马鱼胚胎发育的影响

Summary

本实验采用Box-Behnken实验设计-响应面法优化了羊藿果油加工技术，初步研究了粗提和优化水提取EF对斑马鱼胚胎发育的影响。

Abstract

作为一种传统中药（TCM），淫羊藿（EF）在医学和食品方面已有>2000年的历史。临床上，用羊油加工的EF常被用作药物。近年来，使用EF作为原料的产品的安全风险和不良反应的报告逐渐增加。加工可以有效提高中药的安全性。根据中医理论，羊油加工可以降低EF的毒性，增强其对肾脏的滋补作用。然而，对EF羊油加工技术缺乏系统的研究和评价。本研究采用Box-Behnken实验设计-响应曲面方法，通过评估多个组分的含量来优化加工技术的关键参数。结果表明，EF的最佳羊油加工工艺为:将羊油在120 °C±10 °C加热，加入粗EF，在189 °C±10 °C轻轻翻炒至均匀光泽，然后取出冷却。每100公斤EF，应使用15公斤羊油。在斑马鱼胚胎发育模型中比较了粗水和羊油加工EF水提取物的毒性和致畸性。结果表明，粗草本组更容易引起斑马鱼畸形，其半最大致死EF浓度较低。综上所述，优化后的羊油加工技术稳定可靠，重复性好。在一定剂量下，EF水提取物对斑马鱼胚胎的发育有毒，对生药的毒性强于对加工药物的毒性。结果表明，羊油加工降低了原油EF的毒性。这些发现可用于提高羊油加工EF的质量、均匀性和临床安全性。

Introduction

Epimedii folium（EF）是Epimedium brevicornu Maxim.，Epimedium sagittatum （Sieb. et Zucc.）的干燥叶子。Maxim.，Epimedium pubescens Maxim.，或Epimedium Koreanum Nakai。EF可用于治疗骨质疏松症、更年期综合征、乳腺肿块、高血压、冠心病^等疾病1.作为一种传统中药（TCM），EF在医学和食品领域已有2000多年的历史。由于其价格低廉，补肾效果显著，被广泛用于医药和保健食品。EF是用羊油炒制而成的，这一过程最早在刘宋时期^雷霄撰写的《雷功加工理论》中有所描述。粗EF和炒EF的功效完全不同。粗EF主要祛风湿，而炒EF则温肾^补阳3。目前，EF被广泛用作药品和保健食品的原料;上市中成药399种，进口保健食品9种，以EF^为原料的国产保健食品455种。该药材具有很大的应用前景。但近年来，保健食品和中成药以EF为原料引起不良反应和人体肝损伤的报道越来越多，相关毒性研究⁵、^6、7....

Protocol

所有动物相关实验均经重庆中医药研究院实验伦理委员会批准进行（实验动物伦理审查证书编号:ZJS2022-03）。

1. 生物活性成分的测定

注:本研究使用的物种为 淫羊藿矢状，样本采集于重庆丰都县。该样本被鉴定为 E. sagittatum （Sieb. et Zucc.）的干燥地上部分。格言。由重庆中医药研究所生物医学研究所的研究人员提供。

1. 使用电子分析天平准确称取淫羊藿苷、淫羊藿素A（EA）、淫羊藿素B（EB）、淫羊藿素C（EC）和宝活苷I（BI）各对照品的适量，制备对照品溶液，并溶于甲醇中。使用这些制备含有 381.61 μg/mL 淫羊藿苷、124.14 μg/mL EA、110.24 μg/mL EB、1091.75 μg/mL EC 和 184.98 μg/mL BI 的混合参比储备溶液。
2. 通过3号筛粉碎EF来制备测试产品溶液。将约0.2g（使用电子分析天平）粉碎的EF放入带塞锥形瓶中，加入20mL稀乙醇，然后在400W功率和50kHz频率下超声处理1小时。摇匀，通过0.22μm膜过滤器，得供试品溶液。
3. 按如下方式进行色谱分析。使用尺寸为4.6 mm x 250 mm，内径为5 μm的C₁₈ 色谱柱的高效液相色谱（HPLC）。使用乙腈作为流动相A，超纯水作为流动....

Results

方法学调查结果
观察到淫羊藿苷、EA、EB、EC、BI的浓度与色谱峰面积之间存在线性关系（见 表3）。淫羊藿苷、EA、EB、EC和BI色谱峰面积的RSD%值（n = 6）分别为0.28%、1.22%、0.65%、1.67%和1.06%，表明HPLC测量的精密度良好。淫羊藿苷、EA、EB、EC和BI含量的RSD%值（n=6）分别为1.59%、1.46%、1.86%、2.29%和0.98%，表明该方法具有良好的重复性。样品中淫羊藿苷、EA、EB、EC和BI峰面积的RSD%值（n = 6）分别为1.49%、1.96%、1.42%、0.96%和0.81%，表明样品溶液在24 h内稳定。淫羊藿苷、EA、EB、EC和BI的平均回收率分别为99.98%、100.14%、100.09%、100.75%和100.94%，RSD%值分别为0.56%、0.78%、0.84%、1.10%和1.47%（见 表4）。这些结果表明，该方法的精度符合要求。

上述实验结果表明，该分析方法具有优异的精密度、重现.......

Discussion

自变量及其水平的确定
EF加工技术仅在2020年版《中国药典》和^全国26个省、市、自治区公布的地方中药加工规范中有所描述1。描述涉及以下步骤:取羊油加热融化，加入EF丝，用慢火炒至均匀有光泽，取出，冷却。此外，每 100 公斤淫羊藿使用 20 公斤（缩写为 20%）羊油（精制）。但是，未指定EF处理过程的参数。本实验的自变量中，可以量化生产过程中的三个关键因素:羊油用量、羊油温度和油炸温度。应根据上述描述设置值范围。从初步试验的结果可以看出，当羊油用量为15%时，EF叶子可以均匀地涂上羊油。当用量超过35%时，羊油过多。最后，羊油用量范围应在15%-35%。当温度达到50°C时，羊油融化。当温度达到>120°C时，羊油开始冒烟，温度过高。因此，羊油的温度范围应在50°C-120°C。 中国药典2020年版规定，EF要用慢火炒。慢火不应超过200°C，油炸温度应在80°C-300°C之间。

综合评分
在淫羊藿的加工过程中，糖苷键断裂，糖苷组分转化为低糖苷组分.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
腈	Fisher	197164
宝活苷 （B ）	Chengdu Manst Biotechnology Co.， Ltd. 成都曼斯特生物科技有限公司	MUST-20042402
色谱柱	Waters Corporation	Symmetry C18
Design Expert 软件	Stat- Ease Inc.，明尼苏达州明尼阿波利斯	试用版8.0.6.1
检测器	Waters Corporation	2998
粉碎机	合肥荣世达小家电有限公司	S-FS553
电子分析天平	梅特勒-托利多国际公司
Epimedin A （EA）	成都曼斯特生物科技有限公司	MUST-21112118
淫羊藿 B （EB）	成都曼斯特生物科技有限公司	MUST-20080403
Epimedin C （EC）	成都曼斯特生物科技有限公司	MUST-20080310
乙醇	重庆川东化工（集团）有限公司
Graphpad 软件	GraphPad Software Inc.， San Diego， CA， USA	6.02
高效液相色谱 （HPLC）	Waters Corporation	2695
Icariin	成都格力普生物科技有限公司
甲醇	Chongqing Chuandong Chemical （Group） Co.， Ltd.
微孔膜	天津金腾实验设备有限公司	0.22&亩;m
羊油	阔山智牛 生鲜店	20211106
Office Excel办公软件	Microsoft	Office Excel 2021
典筛	绍兴上虞华丰五金仪器有限公司	R40/3
纯水机	重庆安徒生环保设备有限公司	AT Sro 10A
定性滤纸	上海雷固仪器有限公司	18cm
立体显微镜	Carl Zeiss， Oberkochen， Germany	Stemi 2000
超声波清洗机	布兰森超声波（上海）有限公司	BUG25-12
斑马鱼	中国斑马鱼资源中心 （CZRC）	AB 菌株