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方法文章

淫羊藿叶羊油炮制工艺的优化及其对斑马鱼胚胎发育影响的检测

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DOI：

10.3791/65096

⸱

2023年3月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University

本文内容

摘要

本实验通过应用Box-Behnken实验设计-响应面法优化了淫羊藿叶（EF）的羊油炮制工艺，并初步研究了生品及优化后水提淫羊藿叶对斑马鱼胚胎发育的影响。

摘要

作为一味传统中药，淫羊藿叶（Epimedii folium, EF）在药食两用方面具有悠久的历史 > 2,000年。临床上，经羊油制备的附子（EF）常作为药物使用。近年来，以附子为原料的药品安全风险及不良反应报道逐渐增多。炮制可有效提高中药的安全性。根据中医理论，羊油炮制可降低附子的毒性，并增强其补肾功效。然而，目前尚缺乏对附子羊油炮制工艺的系统性研究与评价。本研究采用Box-Behnken实验设计-响应面法，通过测定多种成分含量，优化炮制工艺的关键参数。结果表明，附子羊油炮制的最佳工艺为：将羊油加热至120 °C ± 10 °C，加入净附子，文火翻炒至189 °C ± 10 °C，炒至表面均匀显光泽，取出放凉；每100 kg附子，用羊油15 kg。采用斑马鱼胚胎发育模型，比较生附子与羊油炮制附子水提物的毒性和致畸性。结果显示，生药组更易引起斑马鱼畸形，其半数致死浓度（EF）较低。综上所述，优化后的羊油炮制工艺稳定可靠，重复性良好。在一定剂量下，附子水提物对斑马鱼胚胎发育具有毒性，且生品毒性强于炮制品。结果表明，羊油炮制可降低生附子的毒性。本研究结果可为提高羊油制附子的质量、均一性及临床用药安全性提供依据。

引言

淫羊藿（Epimedii folium，EF）为淫羊藿属植物Epimedium brevicornu Maxim.、Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim.、Epimedium pubescens Maxim. 或Epimedium koreanum Nakai的干燥叶。EF可用于治疗骨质疏松症、更年期综合征、乳腺增生、高血压、冠心病及其他疾病1。作为一味中药，EF具有两千多年的药食同源历史。因其价格低廉且补肾功效显著，被广泛应用于药品和保健食品中。EF的传统炮制方法为羊油炙法，最早见于南北朝刘宋时期雷敩所著的《雷公炮炙论》2。生淫羊藿与炙淫羊藿的功效差异较大：生品以祛风湿为主，而炙品则偏于温肾助阳3。目前，EF作为原料被广泛用于药物和保健食品中，以EF为原料的国产中成药有399种，进口保健食品9种，国产保健食品455种4，该药材具有广阔的应用前景。然而近年来，以EF为原料的保健食品和中成药所致不良反应及人肝损伤的报道日益增多，相关毒性研究5,6,7亦表明其作为原料存在潜在的安全风险。

中药炮制是指能够有效降低或消除毒性并提高中药安全性的制药技术。附子的传统炮制方法为羊油炒制，该方法可降低附子的毒性，并增强其温肾助阳的作用8。此炮制方法已被收录于《中华人民共和国药典》及多种炮制规范中1。目前对附子炮制工艺的规定仅如下：每100 kg附子，加入20 kg羊油（精制），文火加热炒至表面均匀、显光泽1。上述标准中并未对附子炮制方法设定严格的工艺参数，导致各地炮制规范尚未统一，缺乏一致性。因此，系统研究附子炮制工艺具有重要意义。本文采用Box-Behnken实验设计-响应面法对附子的炮制工艺进行优化。

Box-Behnken 实验设计是一种常用于优化工艺中各因素的方法。通过建立多回归方程拟合因素与效应值之间的函数关系，可对提取参数进行优化。近年来，该方法已广泛应用于中药提取5,6,7和炮制工艺的研究9,10,11。已有多种研究报道了采用 Box-Behnken 设计的中药炮制方法，包括盐制Psoraleae fructus12、酒制Cnidii fructus13以及炒制Cinnamomi ramulus14等。该方法具有试验周期短、试验精度高、适用于多因素多水平试验的优点。相比正交设计试验法更为简便，相比均匀设计法又更为全面15。所获得的函数关系可确定试验范围内任意试验点的预测值，这是其显著优势之一。可利用斑马鱼模型来检测炮制后 EF 的毒性是否降低。

在中药毒性研究中，斑马鱼模型兼具细胞实验的高通量优势以及与啮齿类动物实验的相似性16。该模型具有个体小、产卵率高、繁殖周期短、易于饲养等特点。斑马鱼可用于细胞培养板中的大规模同步实验，实验用药剂量小、实验周期短、成本低，整个实验过程便于观察和操作17。斑马鱼胚胎透明且发育迅速，因此可通过显微镜直接观察药物在不同发育阶段对内脏组织的毒性及致畸效应18。斑马鱼与人类的基因同源性高达85%18，其信号转导通路与人类相似18，生物结构和生理功能也与哺乳动物高度相似18。因此，用于药物检测的斑马鱼模型可提供对人类具有高度可靠性和适用性的实验动物19。

本研究采用Box-Behnken设计-响应面法，以淫羊藿苷、宝藿苷I、淫羊藿次苷A、淫羊藿次苷B和淫羊藿次苷C的含量为评价指标，优化羊油用量、羊油温度及炸制温度在淫羊藿炮制工艺中的参数。采用斑马鱼模型，初步探讨淫羊藿水提取物在炮制前后对斑马鱼胚胎发育的影响，以评价炮制对淫羊藿毒性的降低作用。

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方案

所有动物相关实验均经重庆市中医院实验伦理委员会批准（实验动物伦理审查证书编号：ZJS2022-03）。

1. 生物活性成分的测定

注意：本研究所用物种为Epimedium sagittatum，样品采自重庆市丰都县。经重庆市中药研究院生物医学研究所研究人员鉴定，该样品为E. sagittatum（Sieb. et Zucc.）Maxim.的干燥地上部分。

  1. 使用电子分析天平准确称取适量的各对照品，即淫羊藿苷、宝藿苷I（BI）、朝藿定A（EA）、朝藿定B（EB）和朝藿定C（EC），用甲醇溶解。配制混合对照品储备液，其中含淫羊藿苷381.61 µg/mL、EA 124.14 µg/mL、EB 110.24 µg/mL、EC 1091.75 µg/mL、BI 184.98 µg/mL。
  2. 将淫羊藿（EF）粉碎后过3号筛。取约0.2 g（使用电子分析天平）粉碎后的EF样品，置于带塞锥形瓶中，加入20 mL稀乙醇，于400 W功率、50 kHz频率下超声处理1小时。充分振摇后，经0.22 µm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
  3. 按以下条件进行色谱分析：采用C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，内径5 µm）进行高效液相色谱（HPLC）分析。以乙腈为流动相A，超纯水为流动相B。采用以下梯度洗脱程序：0–30 min，24% A升至26% A；30–31 min，26% A升至45% A；31–45 min，45% A升至47% A。检测波长为220 nm（所用检测器见材料表）。柱温保持在30 °C，流速为1.0 mL/min，进样量为10 µL。
  4. 为考察线性关系，将步骤1.1中的混合对照品溶液分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍和32倍，用于淫羊藿苷、EA、EB、EC和BI的线性测定。以乙腈为流动相A，超纯水为流动相B。
  5. 采用以下梯度洗脱程序：0–30 min，24% A升至26% A；30–31 min，26% A升至45% A；31–45 min，45% A升至47% A。检测波长为220 nm（所用检测器见材料表）。柱温保持在30 °C，流速为1.0 mL/min，进样量为10 µL。记录各成分的峰面积。以对照品浓度（横坐标，µg/mL）为横轴，峰面积（纵坐标）为纵轴，采用专业软件（见材料表）绘制线性回归曲线。
  6. 进行精密度试验：在步骤1.3所述色谱条件下，连续6次进样测定混合对照品溶液。记录各化学成分的保留时间和峰面积，计算峰面积的相对标准偏差（RSD），以评估方法的精密度（重现性），计算公式如下：
    RSD% = 标准偏差（SD）/计算结果的算术平均值（X）× 100%
  7. 进行重现性试验：准确称取EF粉末，按照步骤1.2的方法平行制备6份供试品溶液。在步骤1.3所述色谱条件下进行HPLC分析。记录各化学成分的保留时间和峰面积，根据标准曲线（峰面积与浓度关系）计算各化合物的含量，并按上述方法计算RSD%。
  8. 进行稳定性试验：将供试品溶液于室温下放置，分别在配制后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h时，按步骤1.3所述HPLC方法测定其含量，以评估溶液的稳定性。记录各化学成分的保留时间和峰面积，并按上述方法计算峰面积的RSD%。
  9. 进行加样回收率试验：取0.2 g EF粉末，共6份，分别置于带塞锥形瓶中。加入适量对照品溶液（所加对照品量相当于样品中已知含量的100%），按照步骤1.2所述方法制备供试品溶液。
  10. 将样品注入色谱仪，按照步骤1.3的色谱条件进行分析。记录峰面积，并按以下公式计算平均回收率和RSD%：
    加样回收率 = （加标样品测得量 − 原样品含量）/ 加标量 × 100%

2. 采用 Box-Behnken 设计-响应面法优化 EF 羊油加工工艺

  1. 选择影响 EF 炮制的关键参数作为影响因素，如羊油用量（A；15%–35%）、羊油温度（B；50–120 °C）和炒制温度（C；80–300 °C）；以淫羊藿苷、EA、EB、EC 和 BI 含量的综合评分为评价指标。此处羊油的百分比为质量百分比。
  2. 使用响应面分析软件（见材料表）设计 Box-Behnken 响应面实验，探索二次响应面，并建立二阶多项式模型。选择新建 Box-Behnken 设计，将“数值因子”选项设为 3，设定因子 A、B 和 C，点击继续；将“响应值”选项设为 1（即综合评分），再次点击继续完成设计，共规划 17 次实验（见表 1）。
    注：自变量与因变量及其低、中、高水平详见表 2。
  3. 按照表 1中的具体参数进行 EF 炮制；例如，1 号实验：称取精炼羊油，用量为 15% v/v，加热至 50 °C 使其熔化；将粗制 EF 加入熔化的羊油中，于文火（190 °C）下翻炒至表面均匀光亮，取出放凉。共进行 17 次实验操作，本研究共获得 17 组炮制品。
    注：羊油在室温（25 °C）下呈固态，加热后熔化为液态，液态羊油可用作辅料。
  4. 按照步骤 1.2 所述方法制备各炮制品的供试品溶液，然后依据步骤 1.3 所述色谱条件进行 HPLC 分析。记录各化学成分的保留时间和峰面积，采用外标法计算各供试品溶液中淫羊藿苷、EA、EB、EC 和 BI 的含量。利用以下综合评分计算公式，计算 17 个实验组的综合评分：
    综合评分 = Z/Zmax × 0.5 + BI/BImax × 0.5
    其中，Z 为淫羊藿苷、EA、EB 和 EC 含量之和；Zmax 为 17 个实验组中上述四者含量之和的最大值；BI 为 BI 含量；BImax 为 17 个实验组中 BI 含量的最大值。
  5. 将 17 组实验的综合评分结果导入数据分析软件（见材料表）进行实验数据分析。在评价项目中，选择“二次过程顺序”选项和“多项式模型类型”选项。

3. 检测加工处理对斑马鱼胚胎发育的影响

  1. 样品制备
    1. 将生制与炮制的 EF 分别过 3 号筛（见材料表）。取每种 EF 样品 100 g，加入 1,000 mL 超纯水，浸泡 0.5 小时，煎煮两次，每次 30 分钟，然后用滤纸过滤。
    2. 合并滤液，加热浓缩。加超纯水定容至 100 mL，得到炮制品（PEF，1 g/mL）和生品（CEF，1 g/mL）的储备液。测定各储备液中生药的含量。
    3. 分别取 1 mL、1.5 mL、2.5 mL、5 mL 和 7.5 mL 储备液置于 10 mL 容量瓶中，加超纯水定容，配制成浓度为 100 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL、250 mg/mL、500 mg/mL 和 750 mg/mL 的供试品溶液，用于斑马鱼胚胎毒性研究。
      注：供试品溶液的浓度参考相关文献20,21 并通过预实验确定，以获得毒理学研究中常用的 10 倍浓度梯度。CEF 为未经炮制的样品，PEF 为采用第 2 节所述最佳炮制工艺制备的样品。
  2. 斑马鱼饲养与胚胎处理21
    1. 将野生型斑马鱼（见材料表）在恒温条件下适应 2 天，饲养于 pH 7.0–7.4 的循环水族箱中，每日喂食两次。
      注：通过在培养基中添加 0.003%（质量/体积）的 1-苯基-2-硫脲抑制斑马鱼黑色素的形成，使其身体保持透明，便于形态学观察。
    2. 于傍晚选取健康的成年野生型斑马鱼，用隔板在交配盒中分隔雌雄。次日早晨移除隔板，让其自然产卵 30 分钟。每隔 15 分钟用移液器收集受精卵。共收集 520 枚健康野生型胚胎。将斑马鱼胚胎置于 28.5 °C 的培养箱中培养 24 小时。
    3. 将受精后 24 小时（hpf）的健康胚胎随机分为 13 组，另设 1 个对照组，分别置于培养皿中，每组加入 10 mL 下列溶液进行暴露处理：PEF：100 µg/mL、150 µg/mL、200 µg/mL、250 µg/mL、500 µg/mL、750 µg/mL；CEF：100 µg/mL、150 µg/mL、200 µg/mL、250 µg/mL、500 µg/mL、750 µg/mL。空白对照组仅使用培养液处理。本研究中每组包含 40 枚胚胎。
      注：培养液成分为 0.15 M NaCl、5 mM KCl、0.25 mM Na2HPO4、0.45 mM KH2PO4、1.3 mM CaCl2、1.0 mM MgSO4 和 4 mM NaHCO3。
    4. 将斑马鱼胚胎置于恒温培养箱中培养至 120 hpf。每日统计各组死胚数量，在体视显微镜下观察各实验组幼鱼主要器官的形态（比例尺 = 500 µm，见材料表），并利用数据分析软件（见材料表）计算 72 hpf 时斑马鱼的半数致死浓度（LC50）。

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结果

方法学考察结果
淫羊藿苷、EA、EB、EC 和 BI 的浓度与色谱峰面积之间呈良好的线性关系（见表3）。淫羊藿苷、EA、EB、EC 和 BI 的色谱峰面积的 RSD% 值（n = 6）分别为 0.28%、1.22%、0.65%、1.67% 和 1.06%，表明 HPLC 测定的精密度良好。淫羊藿苷、EA、EB、EC 和 BI 含量的 RSD% 值（n = 6）分别为 1.59%、1.46%、1.86%、2.29% 和 0.98%，表明该方法具有良好的重复性。样品中淫羊藿苷、EA、EB、EC 和 BI 峰面积的 RSD% 值（n = 6）分别为 1.49%、1.96%、1.42%、0.96% 和 0.81%，表明样品溶液在 24 小时内稳定。淫羊藿苷、EA、EB、EC 和 BI 的平均加样回收率分别为 99.98%、100.14%、100.09%、100.75% 和 100.94%，RSD% 值分别为 0.56%、0.78%、0.84%、1.10% 和 1.47%（见表4）。上述结果表明，该方法的准确度符合要求。

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讨论

自变量及其水平的确定
淫羊藿（EF）的炮制工艺仅在《中华人民共和国药典》2020年版以及全国26个省、直辖市和自治区发布的中药炮制规范中有描述1。其描述包括以下步骤：取羊油加热至熔化，加入淫羊藿饮片，用文火炒至均匀、显光泽，取出，放凉。此外，每100 kg淫羊藿用精制羊油20 kg（简称为20%）。然而，淫羊藿炮制工艺的具体参数并未明确。在本实验的自变量中，生产过程中可量化的三个关键因素为：羊油用量、羊油温度和炒制温度。其取值范围应依据上述描述设定。根据预试验结果可知，当羊油用量为15%时，淫羊藿叶片可被羊油均匀包裹；当用量超过35%时，羊油过多。因此，羊油用量的合理范围应为15%–35%。当温度达到50 °C时，羊油开始熔化；当温度达到>120 °C时，羊油开始冒烟，温度过高。因此，羊油的温度范围应设定为50 °C–120 °C。《中华人民共和国药典》2020年版规定淫羊藿应以文火炒制，文火温度不应超过200 °C，炒制温度范围应在80 °C–300 °C之间。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到重庆市中医院基本科研业务费项目（项目编号：jbky20200013）、重庆市科研机构绩效激励引导项目（项目编号：cstc2021jxjl 130025）以及重庆市卫生健康委员会中药炮制学重点学科建设项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈Fisher197164
宝藿苷 figure-materials-1（Bfigure-materials-2） 成都曼斯特生物科技有限公司MUST-20042402
色谱柱Waters CorporationSymmetry C18
Design Expert 软件Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN试用版 8.0.6.1
检测器Waters Corporation2998
粉碎机合肥荣事达小家电有限公司S-FS553
电子分析天平梅特勒-托利多国际有限公司MS205DU
淫羊藿次苷 A（EA）成都曼斯特生物科技有限公司MUST-21112118
淫羊藿次苷 B（EB）成都曼斯特生物科技有限公司MUST-20080403
淫羊藿次苷 C（EC）成都曼斯特生物科技有限公司MUST-20080310
乙醇重庆川东化工（集团）有限公司20180801
GraphPad 软件GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA6.02
高效液相色谱（HPLC）Waters Corporation2695
淫羊藿苷成都吉必生物技术有限公司21091401
甲醇重庆川东化工（集团）有限公司20171101
微孔滤膜天津津腾实验设备有限公司0.22μm
羊油阔山芝牛生鲜食品店20211106
Office Excel 办公软件MicrosoftOffice Excel 2021
药典筛绍兴上虞华丰五金仪器有限公司R40/3
纯水机重庆安德森环保设备有限公司AT Sro 10A
定性滤纸上海雷鼓仪器有限公司18cm
体视显微镜Carl Zeiss, Oberkochen, GermanyStemi 2000
超声波清洗器必能信超声（上海）有限公司BUG25-12
斑马鱼中国斑马鱼资源中心（CZRC）AB 品系

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