本方案概述了将目的基因转导至原代人T细胞的过程，确保符合药品生产质量管理规范（GMP）标准。
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摘要
摘要
过继性细胞治疗（Adoptive Cell Therapy, ACT）领域因基因改造细胞的发展而发生了革命性变化，特别是嵌合抗原受体（CAR）-T细胞。这些经过修饰的细胞在血液系统恶性肿瘤患者中已显示出显著的临床疗效。然而，这类疗法的生产成本高昂，且需要进行 extensive 的质量控制评估，限制了其在更广泛患者群体中的可及性。为解决这一问题，许多学术机构正在探索在符合国家和国际监管机构所制定指南的前提下，自行生产基因改造细胞的可行性。
大规模生产基因修饰T细胞产品面临诸多挑战，尤其是在机构生产能力以及满足输注剂量需求方面。其中一个主要挑战是在符合药品生产质量管理规范（GMP）的条件下大规模生产病毒载体，该步骤通常外包给外部公司。此外，简化T细胞转导流程有助于减少不同生产批次之间的差异性，降低成本，并便于人员培训。在本研究中，我们介绍了一种针对原代人T细胞的简化慢病毒转导流程，以荧光标记基因作为目标基因。整个流程遵循符合GMP标准的操作规范，并在本学术机构内部实施。
引言
过继性细胞疗法（Adoptive Cell Therapies, ACT）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）-T细胞的出现，为现代临床实践带来了革命性的变革，确立了个性化医疗的新范式。特别是靶向CD19的CAR-T细胞已展现出卓越的临床疗效，代表了B细胞恶性肿瘤中最先进的T细胞治疗手段1,2,3,4,5。然而，目前商业化基因修饰T细胞疗法在基因转移方面高度依赖病毒载体。在学术环境中，尤其是在符合药品生产质量管理规范（Good Manufacturing Practice, GMP）条件下应用病毒载体实施ACT，面临诸多重大挑战，包括扩增能力受限、需要专用设备、依赖高技能人员，以及需使用符合GMP标准的试剂进行质粒介导的病毒颗粒生产6,7,8。
因此，基因修饰T细胞疗法的制造过程十分复杂，通常始于从白细胞分离产物中分离外周血单个....
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方案
本研究获得了帕特雷大学伦理委员会和帕特雷大学综合医院机构审查委员会的批准。在获取生物样本之前，已从健康个体获得知情同意。参与者的资格评估根据机构程序进行，并符合JACIE关于白细胞单采术的标准。如果本方案将在临床细胞治疗（ACT）环境中实施，则所有操作必须遵守药品生产质量管理规范（GMP）指南，并在符合GMP标准的洁净室中进行。使用病毒载体时需采取特殊安全防护措施，相关操作应在专用的生物安全柜内进行。在本研究中，所描述的操作均在经过验证的H35 HEPA低氧工作站（见材料表）中进行，以确保环境受控且可监控。所有有害液体的去污应使用10%次氯酸钠溶液进行。
1. PBMC 的分离与 T 细胞激活（第 0 天）
- 根据初始体积，从供体单采袋（leukopaks，参见材料表）中收集细胞至50 mL离心管中。
- 使用15 mL完全造血培养基（含5% HSA的商用无血清造血培养基，参见材料表）对细胞袋进行两次冲洗。
- 进行基于多糖的密度梯度离心，按1:2（试剂:样本）比例稀释。在室温下以800 × g 离心30分钟，关闭刹车（A/D，9/0）。
- 使用微量移液器将外周血单个核细胞（PBMCs）收集至洁净的50 mL离心管中。
- 用1× PBS....
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结果
转导效率的评估
通过流式细胞术检测转导细胞中目的基因（GFP）的表达情况。代表性结果如图1所示。在第14天，超过95%的细胞为CD3+，表明T细胞成功激活并扩增。在CD3+细胞群中，转导效率为58.7%（TD，图1C），而未转导细胞（UNTD，图1B）的转导效率为0.51%。活率分析显示，在排除7-AAD+细胞后，超过95%的细胞存活（图1A）。数据分析使用FlowJo软件（见材料表）完成。
扩增特征的评估
从第4天至冷冻保存当天（第14天），转导后的细胞在含重组人IL-7（rhIL-7，155 U/mL）和重组人IL-15（rhIL-15，290 U/mL）的培养.......
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讨论
由于慢病毒载体能够转导分裂和非分裂细胞，因此作为基因递送工具，在细胞与基因治疗领域具有重要意义12。然而，使用符合GMP标准的方法大规模生产慢病毒载体仍面临诸多挑战，原因在于转染方法和纯化步骤等多种参数可能导致慢病毒批次间的差异。学术机构通常从慢病毒生产的生物技术公司获取病毒原液，这些公司会提供有关病毒功能性和安全性的文件，以满足放行标准13,14。
成功的转导方案不仅依赖于病毒原液的质量，还取决于靶细胞的状态。外周血单个核细胞（PBMCs）的有效刺激至关重要，因为激活步骤的失败可能导致转导效率低下。此外，启动子和包膜蛋白的选择也会影响转导方案的效率15,16。不同的转导增强剂具有独特的性质，可促进病毒颗粒成功进入靶细胞17,
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披露
N.S. 开发了实验方案并撰写了手稿，A.S. 对其进行了审阅和监督；K.S.、G.A. 进行了额外的实验；D.K.、M.L. 在实验过程中提供了重要支持，V.Z.、N.T. 参与了审稿过程。N.T. 是 ProtATonce Ltd. 的成员。其余作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由欧盟和希腊国家资金通过竞争力、创业和创新运行计划共同资助，项目属于“研究-创造-创新”计划（项目编号：T2EDK - 00474）。我们还要感谢生命选择基金会为细胞治疗研究所GMP实验室"Dimitris Lois"提供的持续支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔TC处理板 | Corning | 353047 | |
| 5 mL FACS管 | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon管 | Greiner biomedica | 227261 | |
| 6孔TC处理板 | Corning | 353046 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| BD FACS CANTO II | BD Biosciences | V96300084 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| 细胞计数仪 | Corning Cell Cytosmart | J21E0081 | |
| 冻存管 | Greiner biomedica | 122263 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（D-PBS） | Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS缓冲液（1× D-PBS，0.5% BSA，2 mM EDTA） | - | - | |
| FlowJo 软件 v10.6.2 | TreeStar Inc | - | |
| Gibco CTS Opti-MEM I 培养基 | ThermoFisher Scientific | A4124801 | |
| GMP级rhIL-15 | Miltenyi Biotec | 170-076-114 | |
| GMP级rhIL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-146 | |
| GMP级rhIL-7 | Miltenyi Biotec | 170-076-111 | |
| Hanks’s 平衡盐溶液（HBSS） | Life Technologies | 14175 | |
| HEPA Whitley H35 低氧工作站 | Don Whitley Scientific | HA0315172H | |
| 人血清白蛋白（HSA） | Baxter | B05AA01 | |
| Junior LB 9509 便携式发光仪 | Berthold Technologies | 6506 | |
| Lenti-X 前病毒定量试剂盒 | Takara Bio | 631239 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7811 | |
| MACS GMP T细胞激活试剂 | Miltenyi Biotec | 170-076-156 | |
| 小鼠抗人 CD3 抗体（克隆：UCHT-1） | BD Biosciences | 557706 | |
| MycoAlert Plus 支原体检测试剂盒 | Lonza Bioscience | LT07-703 | |
| Parafilm 可伸展密封膜胶带 5 cm × 75 m | D.Dutscher | 90261 | |
| PeriStem PS-650-DB（血细胞分离袋） | Biomed Device | SC00816 | |
| Planer Kryo10 Series III | Planer | ||
| T75 培养瓶 | Greiner biomedica | 658175 | |
| 台盼蓝 0.4% 溶液 | Invitrogen | T10282 | |
| Vectofusin-1 GMP | Miltenyi Biotec | 170-076-165 | |
| X-VIVO™ 15 无血清造血细胞培养基 | Lonza Bioscience | A1048501 |
参考文献
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Brentjens, R., et al.
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重印与许可
