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方法文章

一种符合药品生产质量管理规范的基因修饰T细胞制备流程

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DOI：

10.3791/65097

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2023年10月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cell Therapy, Bone Marrow Transplantation Lab, Department of Medicine, University of Patras, 2Protatonce Ltd, Demokritos Science Park

本文内容

摘要

本方案概述了将目的基因转导至原代人T细胞的过程，确保符合药品生产质量管理规范（GMP）标准。

摘要

过继性细胞治疗（Adoptive Cell Therapy, ACT）领域因基因改造细胞的发展而发生了革命性变化，特别是嵌合抗原受体（CAR）-T细胞。这些经过修饰的细胞在血液系统恶性肿瘤患者中已显示出显著的临床疗效。然而，这类疗法的生产成本高昂，且需要进行 extensive 的质量控制评估，限制了其在更广泛患者群体中的可及性。为解决这一问题，许多学术机构正在探索在符合国家和国际监管机构所制定指南的前提下，自行生产基因改造细胞的可行性。

大规模生产基因修饰T细胞产品面临诸多挑战，尤其是在机构生产能力以及满足输注剂量需求方面。其中一个主要挑战是在符合药品生产质量管理规范（GMP）的条件下大规模生产病毒载体，该步骤通常外包给外部公司。此外，简化T细胞转导流程有助于减少不同生产批次之间的差异性，降低成本，并便于人员培训。在本研究中，我们介绍了一种针对原代人T细胞的简化慢病毒转导流程，以荧光标记基因作为目标基因。整个流程遵循符合GMP标准的操作规范，并在本学术机构内部实施。

引言

过继性细胞疗法（Adoptive Cell Therapies, ACT）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）-T细胞的出现，为现代临床实践带来了革命性的变革，确立了个性化医疗的新范式。特别是靶向CD19的CAR-T细胞已展现出卓越的临床疗效，代表了B细胞恶性肿瘤中最先进的T细胞治疗手段1,2,3,4,5。然而，目前商业化基因修饰T细胞疗法在基因转移方面高度依赖病毒载体。在学术环境中，尤其是在符合药品生产质量管理规范（Good Manufacturing Practice, GMP）条件下应用病毒载体实施ACT，面临诸多重大挑战，包括扩增能力受限、需要专用设备、依赖高技能人员，以及需使用符合GMP标准的试剂进行质粒介导的病毒颗粒生产6,7,8。

因此，基因修饰T细胞疗法的制造过程十分复杂，通常始于从白细胞分离产物中分离外周血单个核细胞（PBMC）。通常从PBMC群体中富集T细胞，并使用抗CD3/CD28微复合物进行激活7,9。随后，通过病毒或非病毒载体对T细胞进行基因修饰，这些载体可在现场制备或外包生产。为了达到输注所需的细胞数量，需对基因修饰后的细胞进行扩增，然后进行最终制剂和/或冷冻保存。最后，细胞产品必须通过基于多项质量控制检测的放行标准9。

本方案介绍了一种利用简单技术在符合GMP条件的情况下对健康外周血单个核细胞（PBMCs）进行ex vivo操作，以制备基因修饰T细胞产品的综合性方法。该方案采用慢病毒载体，该载体可由病毒生产公司外包提供，并完成所有必要的定量/功能性、纯度及安全性检测（例如病毒滴度、宿主细胞DNA复制型慢病毒的检测）。在本研究中，所使用的载体为基于VSV-g（水疱性口炎病毒G蛋白）的第二代慢病毒载体，其中目的基因为绿色荧光蛋白（GFP），并实现组成型表达。

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方案

本研究获得了帕特雷大学伦理委员会和帕特雷大学综合医院机构审查委员会的批准。在获取生物样本之前，已从健康个体获得知情同意。参与者的资格评估根据机构程序进行，并符合JACIE关于白细胞单采术的标准。如果本方案将在临床细胞治疗（ACT）环境中实施，则所有操作必须遵守药品生产质量管理规范（GMP）指南，并在符合GMP标准的洁净室中进行。使用病毒载体时需采取特殊安全防护措施，相关操作应在专用的生物安全柜内进行。在本研究中，所描述的操作均在经过验证的H35 HEPA低氧工作站（见材料表）中进行，以确保环境受控且可监控。所有有害液体的去污应使用10%次氯酸钠溶液进行。

1. PBMC 的分离与 T 细胞激活（第 0 天）

  1. 根据初始体积，从供体单采袋（leukopaks，参见材料表）中收集细胞至50 mL离心管中。
  2. 使用15 mL完全造血培养基（含5% HSA的商用无血清造血培养基，参见材料表）对细胞袋进行两次冲洗。
  3. 进行基于多糖的密度梯度离心，按1:2（试剂:样本）比例稀释。在室温下以800 × g 离心30分钟，关闭刹车（A/D，9/0）。
  4. 使用微量移液器将外周血单个核细胞（PBMCs）收集至洁净的50 mL离心管中。
  5. 用1× PBS洗涤细胞两次，每次加至50 mL（400 × g，10分钟，室温）。将细胞重悬于5 mL完全培养基中。
  6. 使用台盼蓝染色，通过标准血细胞计数板或自动细胞计数仪（参见材料表）进行细胞计数。
  7. 用完全培养基稀释细胞，使细胞浓度达到2 × 106 个细胞/mL。
  8. 每2 × 106 起始细胞加入10 µL T细胞刺激试剂（参见材料表），激活20 × 106 PBMCs。
    注：本方案设计用于激活20 × 106 PBMCs，但可根据需要调整以适用于更多细胞数量。
  9. 加入重组人IL-2（rhIL-2，20 U/mL）（参见材料表），轻轻混匀，并将混合液转移至合适的容器中（例如6孔板）。
  10. 将细胞在37 °C、5% CO2 条件下孵育72小时。

2. 慢病毒T细胞转导（第3天）

  1. 将细胞培养物转移至合适的容器中，例如50 mL锥形管。充分混匀后，在300 x g 室温（RT）孵育10分钟，以去除活化试剂。小心彻底弃去上清液。 将沉淀重悬于1 mL完全培养基中。
    注意：在此阶段，可将病毒在冰上解冻。
  2. 使用台盼蓝对细胞进行计数。
  3. 将细胞重悬于完全培养基中 中等浓度，以达到可铺板 0.5 x 10 的浓度要求6 细胞置于24孔板中，每孔总体积为400 µL。加入rhIL-7（155 U/mL）和rhIL-15（290 U/mL）（参见 材料表).
    注意：需考虑所添加病毒的体积，参见步骤 2.4。
  4. 在另一管中，加入 Vectofusin-1（参见 材料表) 加入Opti-MEM培养基中，终浓度为10 µg/mL，体积与将使用的病毒液体积相等。
    注意：计算 Vectofusin-1 浓度时需考虑细胞培养的总体积。参见步骤 2.3。或者，可使用 GMP 级试剂 Vectofusin-1 GMP。
  5. 将浓缩的病毒以40的感染复数（MOI）与Vectofusin-1/Opti-MEM混合液（1:1比例）混合，充分混匀。将此混合液加入细胞培养物中，必要时用完全培养基调整每孔总体积至400 µL。
  6. 将盖子盖在培养板上，用石蜡膜密封，然后在1000 x g条件下离心 g 在32 °C下孵育2小时。随后，在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板2 过夜。

3. 病毒清除与T细胞扩增（第4天）

  1. 收集细胞，并将其汇集至合适的容器中，例如50 mL离心管。
  2. 在室温（RT）下以400 × g 离心5分钟。小心彻底去除上清液，并将沉淀重悬于1 mL完全培养基中。
  3. 使用台盼蓝对细胞进行计数。将细胞重悬于完全培养基中，调整浓度至1 × 106 个细胞/mL。加入rhIL-7（155 U/mL）和rhIL-15（290 U/mL）（参见材料表）。
  4. 将细胞以0.3–0.5 × 106 个细胞/cm2 的密度转移至合适的容器中，例如T25培养瓶，在37 °C、5% CO2 条件下培养2天。
    ​注意：若需要获得更大数量的细胞群体，可在含有rhIL-7和rhIL-15的条件下每2天进行一次传代（1:2），培养条件同上，直至达到所需细胞数量。

4. 冷冻保存（第14天）

注意：在此步骤中，转移冻存管至储存位置时需要使用冰。冻存的时机取决于所需的细胞数量。在本方案中，当细胞扩增至第14天并达到25倍扩增时进行冻存。

  1. 当达到所需细胞数量时，收集细胞并转移至50 mL离心管中（根据总体积调整离心管数量）。
  2. 在室温（RT）下以400 × g 离心5分钟。小心彻底去除上清液，并将沉淀重悬于10 mL培养基中。如有需要，可合并多个离心管中的细胞。
  3. 使用台盼蓝对细胞进行计数。为每项质量控制（QC）检测（参见第5节）保留一份1 × 106 细胞的等分试样，用于评估病毒载体拷贝数和转导效率。
  4. 在室温下以400 × g 离心10分钟。此时，相应标记冻存管。
  5. 彻底去除上清液，并将沉淀重悬于冻存液中，冻存液由50% HSA和40% HBSS组成，细胞浓度为每冻存管1 × 107 细胞/mL。将细胞悬液转移至相应数量的冻存管中，并向每管加入10%二甲基亚砜（DMSO）。
  6. 将冻存管置于冰上，并立即转移至程序降温仪中进行冷冻保存。冷冻保存完成后，将冻存管转移至受监控的液氮罐中长期保存。

5. 质量控制（第14天）

注意：在放行检测中，产品需经过多项测试，包括微生物生长的无菌检测和内毒素水平评估。这些检测在帕特雷大学综合医院和帕特雷大学的认证实验室中进行。支原体的存在由本实验室采用生化检测试剂盒进行检测，并按照制造商说明在发光仪上测定（见材料表）。细胞表型（图1）、细胞数量及活力分别由本实验室通过流式细胞术（见第5.1节）和自动细胞计数仪 （见材料表）进行评估。放行标准依据已发表的数据和关于GMP生产细胞产品的建议10,11制定（表1）。

  1. 进行转导效率-流式细胞术染色（第14天）
    注意：取1 × 106个细胞用于活率（7-AAD）和CD3标志物2染色，以评估转导效率（见材料表）。如果需要检测目的基因（例如CAR T细胞的情况），特异性抗体的颜色应与CD3标志物和7-AAD不同，以避免补偿问题。应设置适当的对照样本。
    1. 将样品放入FACS管中，并加入500 µL FACS缓冲液。
    2. 在室温下以400 × g离心5分钟。
    3. 用移液器完全弃去上清液，将沉淀重悬于1:5稀释的CD3:FACS缓冲液溶液中（见材料表）。
    4. 涡旋混匀样品，在冰上避光孵育30分钟。
    5. 加入500 µL FACS缓冲液，在400 × g离心5分钟（室温）。
    6. 完全弃去上清液，将沉淀重悬于1:20稀释的7-AAD:FACS缓冲液溶液中（见材料表）。
    7. 涡旋混匀样品，在冰上避光孵育10分钟。
    8. 加入200 µL FACS缓冲液，使用流式细胞仪分析样品（见材料表）。

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结果

转导效率的评估
通过流式细胞术检测转导细胞中目的基因（GFP）的表达情况。代表性结果如图1所示。在第14天，超过95%的细胞为CD3+，表明T细胞成功激活并扩增。在CD3+细胞群中，转导效率为58.7%（TD，图1C），而未转导细胞（UNTD，图1B）的转导效率为0.51%。活率分析显示，在排除7-AAD+细胞后，超过95%的细胞存活（图1A）。数据分析使用FlowJo软件（见材料表）完成。

扩增特征的评估
从第4天至冷冻保存当天（第14天），转导后的细胞在含重组人IL-7（rhIL-7，155 U/mL）和重组人IL-15（rhIL-15，290 U/mL）的培养...

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讨论

由于慢病毒载体能够转导分裂和非分裂细胞，因此作为基因递送工具，在细胞与基因治疗领域具有重要意义12。然而，使用符合GMP标准的方法大规模生产慢病毒载体仍面临诸多挑战，原因在于转染方法和纯化步骤等多种参数可能导致慢病毒批次间的差异。学术机构通常从慢病毒生产的生物技术公司获取病毒原液，这些公司会提供有关病毒功能性和安全性的文件，以满足放行标准13,14。

成功的转导方案不仅依赖于病毒原液的质量，还取决于靶细胞的状态。外周血单个核细胞（PBMCs）的有效刺激至关重要，因为激活步骤的失败可能导致转导效率低下。此外，启动子和包膜蛋白的选择也会影响转导方案的效率15,16。不同的转导增强剂具有独特的性质，可促进病毒颗粒成功进入靶细胞17,

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披露

N.S. 开发了实验方案并撰写了手稿，A.S. 对其进行了审阅和监督；K.S.、G.A. 进行了额外的实验；D.K.、M.L. 在实验过程中提供了重要支持，V.Z.、N.T. 参与了审稿过程。N.T. 是 ProtATonce Ltd. 的成员。其余作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由欧盟和希腊国家资金通过竞争力、创业和创新运行计划共同资助，项目属于“研究-创造-创新”计划（项目编号：T2EDK - 00474）。我们还要感谢生命选择基金会为细胞治疗研究所GMP实验室"Dimitris Lois"提供的持续支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔TC处理板Corning353047
5 mL FACS管 Corning352054
50 mL Falcon管Greiner biomedica227261
6孔TC处理板Corning353046
7-AADBD Biosciences559925
BD FACS CANTO IIBD BiosciencesV96300084
BSAApplichemA1391
细胞计数仪 Corning Cell CytosmartJ21E0081
冻存管Greiner biomedica122263
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD2438
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（D-PBS）Life Technologies14190
EDTAInvitrogen15575-038
FACS缓冲液（1× D-PBS，0.5% BSA，2 mM EDTA）--
FlowJo 软件 v10.6.2 TreeStar Inc-
Gibco CTS Opti-MEM I 培养基ThermoFisher ScientificA4124801
GMP级rhIL-15Miltenyi Biotec170-076-114
GMP级rhIL-2Miltenyi Biotec170-076-146
GMP级rhIL-7Miltenyi Biotec170-076-111
Hanks’s 平衡盐溶液（HBSS）Life Technologies14175
HEPA Whitley H35 低氧工作站Don Whitley ScientificHA0315172H
人血清白蛋白（HSA）BaxterB05AA01
Junior LB 9509 便携式发光仪Berthold Technologies6506
Lenti-X 前病毒定量试剂盒Takara Bio631239
LymphoprepStemcell Technologies7811
MACS GMP T细胞激活试剂Miltenyi Biotec170-076-156
小鼠抗人  CD3 抗体（克隆：UCHT-1）BD Biosciences557706
MycoAlert Plus 支原体检测试剂盒Lonza BioscienceLT07-703
Parafilm 可伸展密封膜胶带 5 cm × 75 mD.Dutscher90261
PeriStem PS-650-DB（血细胞分离袋）Biomed DeviceSC00816
Planer Kryo10 Series IIIPlaner
T75 培养瓶Greiner biomedica658175
台盼蓝 0.4% 溶液InvitrogenT10282
Vectofusin-1 GMPMiltenyi Biotec170-076-165
X-VIVO™ 15 无血清造血细胞培养基Lonza BioscienceA1048501

参考文献

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