需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

藏红花素对H9c2心肌细胞氧化应激的保护作用 通过 PINK1/Parkin 通路介导的线粒体自噬

2.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65105

⸱

2023年5月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

根据 体外 本研究通过实验揭示了藏红花酸通过影响线粒体自噬来修复心肌细胞氧化应激损伤的机制，其中PINK1/Parkin信号通路发挥了重要作用。

摘要

本研究旨在探讨藏红花酸对H2O2介导的H9c2心肌细胞通过 体外 实验，并进一步探究其机制是否与线粒体自噬的影响有关。本研究还旨在阐明红花酸对心肌细胞氧化应激的治疗作用，并探讨其机制是否与线粒体自噬的作用相关。此处，采用H2O2基于氧化应激的模型被构建，并通过检测乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）的水平，评估心肌细胞氧化应激损伤程度。采用活性氧（ROS）荧光探针DCFH-DA、JC-1染料和TUNEL染料检测线粒体损伤和细胞凋亡。通过转染Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒检测自噬流。随后检测线粒体自噬相关蛋白 通过 western blotting 和免疫荧光。然而，藏红花素（0.1–10 µM）可显著提高细胞活力，并减轻由 H 引起的细胞凋亡和氧化应激损伤2O2在自噬过度激活的细胞中，藏红花酸亦可降低自噬流以及线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin的表达，并逆转Parkin向线粒体的转位。藏红花酸可降低H2O2介导的氧化应激损伤及H9c2细胞凋亡，其机制与线粒体自噬密切相关。

引言

急性心肌梗死（AMI）是由于冠状动脉严重且持续的缺血和缺氧引起的心肌坏死，可危及生命1,2。经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是AMI的一线治疗策略之一，通常可保护心肌细胞免受缺血损伤3,4。若AMI发生后未能及时有效地治疗，远端心肌将缺乏血液和氧气供应，导致缺血性坏死及进一步的心血管并发症5,6。在错过PCI手术时机后，如何促进心肌细胞恢复并最大限度减少不可逆的心肌损伤，已成为研究热点。AMI发生后，心肌细胞处于缺血缺氧状态，导致线粒体氧化磷酸化受抑、NAD+还原为NADPH、单电子还原反应增加7。因此，氧的不完全还原反应产生过量的活性氧（ROS），最终导致心肌细胞的氧化应激损伤8。ROS的过度积累会触发脂质过氧化，进一步破坏线粒体膜的结构与功能，导致线粒体通透性转换孔持续开放、线粒体膜电位下降，从而诱导细胞凋亡和坏死。

血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂（ARBs）、β-肾上腺素能受体抑制剂、醛固酮拮抗剂以及其他急性心肌梗死（AMI）标准治疗药物，有助于改善心肌梗死后的心脏功能，并预防恶性事件（如心律失常和左心室重构）的发生9。然而，心肌梗死后患者的生存率和预后在很大程度上受梗死面积的影响，目前在减少心肌细胞凋亡方面尚未取得令人满意的效果10,11。因此，开发促进心肌梗死后心肌细胞恢复的药物已成为一项紧迫的任务。

多年来，传统医学一直是现代药物研究的灵感来源12,13,14,15。中医（TCM）在急性心肌梗死（AMI）治疗方面具有悠久的历史，近年来一系列随机对照试验证实，中医确实能够改善患者的预后16,17。根据中医理论，AMI 是由血瘀所致18,19，因此在急性期通常采用活血化瘀类药物治疗 AMI20。其中，藏红花被认为具有显著的活血化瘀作用，常用于 AMI 的急性期治疗。藏红花的主要成分藏红花素（crocetin）可能在保护心肌细胞方面发挥关键作用21。

本研究采用 H2O2 诱导 H9c2 心肌细胞，模拟心肌缺血/再灌注，从而造成急性心肌梗死（AMI）的心肌细胞损伤，并以藏红花酸作为干预手段，探讨其对氧化应激所致心肌损伤的保护作用。进一步通过线粒体自噬机制探究藏红花酸对心肌细胞的保护作用。更重要的是，本文为线粒体自噬研究的技术方法提供了参考，并详细描述了整个实验流程。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

实验在北京中医药大学生理学实验室进行。所有研究方法均遵循北京中医药大学的相关指南和规定。

1. 细胞培养

  1. 向基础培养基 DMEM（含 4.5 g/L D-葡萄糖、4.g.g/L L-谷氨酰胺和 110 mg/L 丙酮酸钠；参见材料表）中加入 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素，配制完全 DMEM 培养基。
  2. 将液氮冻存的 H9c2 心肌细胞（参见材料表）在 37 °C 温水中快速均匀振荡融化，直至冰完全溶解。
  3. 将细胞转移至离心管中，加入四倍体积的完全 DMEM 培养基，于室温下以 358 x g 离心 5 分钟，用移液器弃去上清液。
  4. 用培养基稀释所得细胞悬液，轻轻吹打混匀，接种于培养瓶中。置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。

2. 细胞活力的测定

  1. 将藏红花酸（见材料表）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成浓度分别为 0.05 mM、0.1 mM、0.5 mM、1 mM、5 mM、10 mM、50 mM、100 mM 和 200 mM 的溶液。
  2. 用胰蛋白酶消化 H9c2 心肌细胞，然后用 DMEM 完全培养基中和混合液。
  3. 将细胞转移至离心管中，在室温下以 179 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，通过轻柔吹打将细胞重悬于 DMEM 完全培养基中。
  4. 使用血细胞计数板22（见材料表）计数细胞，并用 DMEM 完全培养基稀释至 5 × 104 个细胞/mL。
  5. 将细胞均分为九份。对照组加入以 DMEM 完全培养基按 1:1,000 比例稀释的 DMSO，其余各组按 1:1,000 比例加入不同浓度的藏红花酸。
  6. 每孔加入 100 µL 细胞悬液接种于 96 孔板中。37°C 培养 24 小时后弃去上清液，并用 PBS 洗涤细胞 3 次。
  7. 每孔加入 100 µL DMEM 基础培养基，继续培养 4 小时后，每孔加入 20 µL MTS 溶液（见材料表）。
  8. 继续培养 2 小时后，于 490 nm 波长处测定吸光度，并计算细胞活力。
    ​注意：细胞活力 = (处理组 OD - 空白组 OD) / (对照组 OD - 空白组 OD) × 100%。

3. 乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）和过氧化氢酶（CAT）的测定

  1. 以每孔 1 × 105 个细胞的密度将 H9c2 细胞接种于 6 孔板中。干预后收集上清液，并根据试剂盒说明书检测乳酸脱氢酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）水平（参见材料表）。
  2. 收集上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。向培养皿中加入细胞裂解液，冰上静置 20 分钟。将培养皿中的液体转移至离心管中。
  3. 根据试剂盒说明书检测肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）水平23（参见材料表和补充文件 1）。
  4. 采用二辛可宁酸（BCA）法测定裂解液的总蛋白浓度，用于校正 CK、MDA、GSH-Px 和 CAT 的浓度24（参见材料表）。

4. 活性氧的检测

  1. 以每孔 5 × 103 个细胞的密度将 H9c2 细胞接种于 48 孔板中。用无血清培养基按 1:1,000 的比例稀释 DCFH-DA（见材料表）。弃去细胞上清液，并用无血清培养基洗涤细胞两次。
  2. 每孔加入 150 µL 稀释后的 DCFH-DA，于 37 °C 孵育 20 分钟。用无血清培养基洗涤细胞三次，然后在荧光显微镜下采集图像（见材料表）。

5. 线粒体膜电位的检测

  1. 使用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒25（参见材料表）检测线粒体膜电位。弃去培养基，用无血清培养基洗涤细胞一次。
  2. 向每管中加入JC-1工作液并充分混匀。37 °C孵育20分钟，用JC-1染色缓冲液洗涤细胞两次。向每个孔中加入完全培养基，并在荧光显微镜下拍照。

6. TUNEL 染色实验

  1. 使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（参见材料表）检测细胞凋亡率26。弃去上清液，用无血清培养基洗涤沉淀一次。
  2. 加入细胞固定液，室温孵育30分钟后，用PBS洗涤一次。
  3. 每孔加入0.3% Triton X-100，室温孵育5分钟，然后用PBS洗涤两次。加入TUNEL检测工作液，37 °C避光孵育60分钟。
  4. 加入含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂（参见材料表），在荧光显微镜下拍照观察。

7. 通过转染mCherry GFP-LC3B腺病毒监测自噬流

  1. 将每孔中的培养基更换一半，加入新鲜培养基。向培养基中加入 Ad-mCherry GFP-LC3B 腺病毒（感染复数 [MOI] 为 2），并加入 5 µg/mL 多聚素（见材料表）以提高感染效率。
  2. 24 小时后更换新鲜培养基，并在共聚焦显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。
  3. 在确认病毒感染成功后，按照第 1 节相同的条件继续培养细胞，并在共聚焦显微镜下采集图像27。
    ​注意：超过 20% 的细胞显示出绿色荧光蛋白（GFP）荧光，表明病毒感染成功。

8. 蛋白质印迹分析

  1. 收集细胞用于全蛋白提取，并进行裂解（RIPA、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂 = 100:1:1；参见 材料表) 冰上孵育 30 分钟。
  2. 蛋白定量后，向蛋白样品中加入5倍体积的蛋白上样缓冲液，沸水浴中煮沸10分钟。
  3. 使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对含有等量蛋白质的样品进行电泳分离28然后，将样品转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
  4. 用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1小时，然后与一抗（PINK1、Parkin；参见 材料表4 °C 条件下孵育过夜，室温下孵育二抗 1 小时。
  5. 使用增强型化学发光（ECL）溶液和化学发光检测系统检测目标条带。采用Image J软件对条带进行定量分析 通过 密度测定法28.

9. 通过免疫荧光检测 Parkin 的线粒体转位

  1. 通过双免疫荧光染色观察Parkin与线粒体的共定位。弃去各组细胞的上清液，并用PBS洗涤三次。
  2. 用4%多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟，并加入含0.1% Triton X-100的PBS溶液。
  3. 使用无动物成分的封闭液（见材料表）封闭1小时，以防止蛋白质与抗体之间的非特异性结合，并降低荧光背景。
  4. 加入一抗（Parkin和Tom20；见材料表），在4 °C下孵育过夜。
  5. 加入荧光标记的二抗（见材料表），避光孵育1小时。
  6. 加入含DAPI的抗荧光淬灭封片剂，于共聚焦显微镜下采集图像。

10. 统计分析

  1. 使用绘图和分析软件进行统计分析（参见材料表）。
  2. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较组间连续变量。p < 0.05 被认为具有统计学显著性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

藏红花素对细胞活力的影响
0.1 µM、0.5 µM、1 µM、5 µM、10 µM、50 µM 和 100 µM 的藏红花素对细胞具有显著的促增殖作用，而浓度高于 200 µM 时，藏红花素显著抑制 H9c2 细胞的增殖（图 1A）。经 400 µM H2O2 处理 4 小时后，细胞活力显著降低，而藏红花素可在一定程度上逆转这一变化（图 1B）。由于 10 µM 与 100 µM 藏红花素在对抗 H2O2 诱导的 H9c2 细胞活力下降方面无显著差异，因此选择 10 µM 藏红花素作为高剂量组，1 µM 和 0.1 µM 分别作为中剂量和低剂量组。

藏红花酸对H9c2细胞中LDH、CK、MDA、SOD、GSH-Px和CAT的影响
经400 µM H2O2

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

通过先进技术探索天然药物复杂组分中的有效成分一直是中医药研究的热点29，并可在验证后为未来药物开发提供实验依据。红花是治疗中的代表性药物 "促进血液循环，减少血液淤滞" 并广泛用于心肌梗死的治疗30,31藏红花的功效被认为与红花相似，但其活血化瘀的作用显著优于红花31,32藏红花素是藏红花的主要活性成分之一33因此，它被用于本实验的研究中。

H2O2 可导致心肌细胞氧化应激损伤，并模拟心肌细胞的心肌梗死状态，由此建立心肌梗死模型 体外34在本研究中，低浓度藏红花素可促进心肌细胞的活力，这可能与线粒体能量代谢的激活密切相关。藏红花素能...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由北京市自然科学基金（编号：7202119）和国家自然科学基金（编号：82274380）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶Gibco2323363
1% 青霉素-链霉素SigmaV900929
5x 蛋白上样缓冲液北京普利莱基因技术有限公司B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B 腺病毒碧云天C3011
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG (H+L) 中杉金桥生物科技有限公司ZF-0514
Alexa Fluor 594 标记的山羊抗小鼠 IgG (H+L)中杉金桥生物科技有限公司ZF-0513
无动物成分封闭液CST15019s
抗 Parkin 抗体Santa Cruzsc-32282
抗 PINK1 抗体ABclonalA11435
抗 TOM20 抗体ABclonalA19403
抗β-肌动蛋白 抗体ABclonalAC026
BCA 蛋白检测试剂盒凯基生物KGP902
血细胞计数板ServicebioWG607
CAT 检测试剂盒南京建成生物工程研究所A007-1-1
化学发光检测系统上海勤襄科学仪器厂ChemiScope 6100
CK 检测试剂盒南京建成生物工程研究所A032-1-1
辅酶 Q10 (CoQ 10)MacklinC6129
藏红花素成都瑞芬思生物科技有限公司RFS-Z01802006012
含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂中杉金桥生物科技有限公司ZLI-9557
DCFH-DA碧云天S0033S
DMSO索莱宝D8371
杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)Gibco8122091
增强型化学发光 (ECL) 溶液NCM 生物科技P10100
胎牛血清 (FBS)Corning-Cellgro35-081-CV
GraphPad Prism 7.0 https://www.graphpad.com/
GSH-Px 检测试剂盒南京建成生物工程研究所A005-1-2
H9c2 心肌细胞北京鼎国昌盛生物技术有限公司CS0062
辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗山羊 IgG (H+L) 中杉金桥生物科技有限公司ZB-2305
辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗小鼠 IgG (H+L) 中杉金桥生物科技有限公司ZB-2301
JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒LABLEADJ22202
LDH 检测试剂盒南京建成生物工程研究所A020-2-2
MDA 检测试剂盒南京建成生物工程研究所A003-2-2
甲醇阿拉丁A2114057
MTS 检测普洛麦格G3581
过氧化氢溶液G-cloneCS7730
磷酸酶抑制剂中生华美CW2383
聚凝胺碧云天C0351
聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜MilliporeISEQ00010
放射免疫沉淀分析 (RIPA) 裂解缓冲液索莱宝R0010
SDS-PAGE 凝胶上海翌圣生物科技有限公司PG112
SDS-PAGE 电泳缓冲液粉末ServicebioG2018-1L
SDS-PAGE 转膜缓冲液粉末ServicebioG2017-1L
SOD 检测试剂盒南京建成生物工程研究所A001-2-2
Tris 缓冲盐溶液粉末ServicebioG0001-2L
Triton X-100SigmaSLCC9172
TUNEL 凋亡检测试剂盒碧云天C1086
Tween-20索莱宝T8220

参考文献

  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
  3. Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
  4. Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
  5. Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
  6. Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079(2018).
  7. Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
  8. La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
  9. De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
  10. Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
  11. Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002(2019).
  12. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  13. Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748(2023).
  14. Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749(2023).
  15. Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515(2022).
  16. Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394(2021).
  17. Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  18. Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
  19. Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010(2019).
  20. Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
  21. Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
  23. Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473(2022).
  24. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  25. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  26. Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032(2022).
  27. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  28. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837(2021).
  29. Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
  30. Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
  31. Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253(2020).
  32. Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
  33. Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271(2021).
  34. Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462(2021).
  35. Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
  36. Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
  37. Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
  38. Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
  39. Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
  40. Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
  41. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1(2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

藏红花素处理线粒体自噬调控线粒体膜电位活性氧自噬流蛋白质印迹共聚焦显微镜
藏红花素对H9c2心肌细胞氧化应激的保护作用 通过 PINK1/Parkin 通路介导的线粒体自噬
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。