通过PINK1 / Parkin途径介导的线粒体自噬 保护 H9c2心肌细胞免受藏红花素氧化应激

Summary

本研究在体外实验的基础上揭示了藏红花素通过影响线粒 体 自噬修复心肌细胞氧化应激损伤的机制，其中PINK1/Parkin信号通路起重要作用。

Abstract

本研究旨在通过体外实验探讨藏红花素对H₂O₂介导的H9c2心肌细胞的氧化应激保护作用，并进一步探讨其机制是否与线粒体自噬的影响有关。本研究还旨在证明红花酸对心肌细胞氧化应激的治疗作用，并探讨其机制是否与线粒体自噬的作用有关。本文构建了基于H₂O₂的氧化应激模型，通过检测乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）的水平，评估了心肌细胞的氧化应激损伤程度。采用活性氧（ROS）检测荧光染料DCFH-DA、JC-1染料和TUNEL染料评估线粒体损伤和凋亡。通过转染Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒测量自噬通量。然后通过蛋白质印迹和免疫荧光检测线粒体自噬相关蛋白。然而，藏红花素（0.1-10μM）可以显着提高细胞活力，减少由H₂O₂引起的细胞凋亡和氧化应激损伤。在自噬过度激活的细胞中，藏红花素还可以减少自噬流量和线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin的表达，并逆转Parkin向线粒体的转移。藏红花素可减少H₂O₂介导的氧化应激损伤和H9c2细胞凋亡，其机制与线粒体自噬密切相关。

Introduction

急性心肌梗死（AMI）是一种危及生命的心肌坏死，由冠状动脉严重和持续的缺血和缺氧引起^1,2。经皮冠状动脉介入治疗 （PCI） 是 AMI 的一线治疗策略之一，通常可保护心肌细胞免受缺血性损伤 ^3,4。如果AMI后不及时有效治疗，远端心肌将缺乏血液和氧气供应，从而导致缺血性坏死和进一步的心血管并发症^5,6。在错过PCI手术机会后，促进心肌细胞恢复并尽量减少不可逆的心肌损伤一直是研究热点。AMI后心肌细胞处于缺血缺氧状态，导致线粒体氧化磷酸化受到抑制，NAD+还原为NADPH，单电子还原增加⁷。结果，氧气的不完全还原反应产生过量的活性氧（ROS），并最终导致心肌细胞的氧化应激损伤⁸。ROS的过度积累会引发脂质过氧化，进一步破坏线粒体膜的结构和功能。结果是线粒体通透性过渡孔的持续打开和线粒体膜电位的降低，诱导细胞凋亡和坏死。

血管紧张素转换酶 （ACE） 抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂 （ARB）、β肾上腺素受体抑制剂、醛固酮拮抗剂和其他 AMI 标准药物有助于增强心肌梗死后的心脏功能，预防恶性事件的发生，如心律失常和左心室重塑⁹.然而，梗死后的生存率和预后受梗死大小的影响很大，降低心肌细胞凋亡尚未取得满意的结果^10,11。因此，开发促进心肌梗死后心肌细胞恢复的药物已成为一个紧迫的问题。

多年来，传统医学一直是现代药物研究的灵感来源12,13,14,15。中医（TCM）在AMI的治疗方面有着悠久的历史，近年来的一系列随机对照试验证实，中医确实可以改善患者的预后^16,17。根据中医理论，AMI是由血瘀^{引起的18,19，}因此促进血液循环的药物通常用于急性期²⁰的AMI的治疗。其中，藏红花被认为对血液活化和瘀滞有强大的作用，常用于AMI的急性治疗。藏红花素是藏红花的主要成分，可能在保护心肌细胞方面发挥关键作用²¹。

本研究以H₂O₂ 诱导H9c2心肌细胞模拟AMI心肌细胞损伤的心肌缺血/再灌注，以藏红花素为干预措施，研究其对氧化应激诱发心肌损伤的保护作用。通过线粒体自噬进一步探索藏红花素保护心肌细胞的机制。更重要的是，本文为线粒体自噬研究的技术方法提供了参考，并详细描述了整个实验过程。

Protocol

实验在中国北京中医药大学生理学实验室进行。所有研究方法均按照北京大学的相关指导方针和规定进行。

1. 细胞培养

1. 在Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）碱性培养基（含4.5 g/L D-葡萄糖、4.g.g/L L-谷氨酰胺和110 mg/L丙酮酸钠;见 材料表）中加入10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素，制备DMEM完全培养基。
2. 在37°C的温水中解冻液氮冷冻的H9c2心肌细胞（见 材料表），快速均匀搅拌直至冰融化。
3. 将细胞转移到离心管中，并加入四倍于DMEM完全培养基体积的药物。在室温下以358× g 离心5分钟，并使用移液管弃去上清液。
4. 用培养基稀释获得的细胞悬液，轻轻吹气，然后将细胞接种在培养瓶中。在37°C的培养箱中用5%CO₂培养。

2. 细胞活力的测定

1. 将藏红花素（见 材料表）溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，浓度为0.05mM，0.1mM，0.5mM，1mM，5mM，10mM，50mM，100mM和200mM。
2. 通过胰蛋白酶解离H9c2心肌细胞，然后用DMEM完全培养基中和混合物。
3. 将细胞转移到离心管中，并在室温下以179× g 离心5分钟。弃去上清液，轻轻吹气将细胞混合在DMEM完全培养基中。
4. 使用血细胞计数板²² （参见 材料表）计数细胞，并用DMEM完全培养基将其稀释至5×10⁴ 个细胞/ mL。
5. 将细胞分成九个相等的部分。向对照组加入DMSO（用DMEM完全培养基以1:1,000的比例稀释），并以1:1,000的比例向其余组添加不同浓度的藏红花素。
6. 将细胞接种在 96 孔板中，每孔 100 μL。孵育24小时后弃去上清液，并用PBS洗涤细胞三次。
7. 加入 100 μL DMEM 基础培养基后，将细胞孵育 4 小时并加入 20 μL MTS（参见 材料表）。
8. 将细胞再孵育2小时，测量490nm波长处的吸光度，并计算细胞活力。
   注意:细胞活力=（OD处理 - OD空白）/（OD对照 - OD空白）×100。

3. 乳酸脱氢酶 （LDH）、肌酸激酶 （CK）、丙二醛 （MDA）、超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶 （GSH Px） 和过氧化氢酶 （CAT） 的测定

1. 将H9c2细胞接种在密度为1×10⁵ 细胞的6孔板中。根据制造商的说明，在干预后收集上清液并检测LDH和SOD水平（见 材料表）。
2. 收集上清液并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次。将细胞裂解物加入培养皿中，使其在冰上静置20分钟。将培养皿中的液体收集到离心管中。
3. 根据制造商的说明²³ 检测 CK、MDA、GSH-PX 和 CAT 水平（参见 材料表 和 补充文件 1）。
4. 通过二辛可宁酸（BCA）方法检测裂解液的总蛋白质浓度，以校正CK，MDA，GSH-Px和CAT²⁴的浓度（参见 材料表）。

4. 活性氧的测定

1. 将H9c2细胞接种在48孔板中，密度为5×10³ 细胞。用无血清培养基以1:1,000的比例稀释DCFH-DA（见 材料表）。弃去细胞上清液并用无血清培养基洗涤细胞两次。
2. 向每个孔中加入 150 μL 稀释的 DCFH-DA，并在 37 °C 下孵育 20 分钟。用无血清培养基洗涤细胞三次，并在荧光显微镜下捕获图像（参见 材料表）。

5. 线粒体膜电位检测

1. 使用JC-1线粒体膜电位测定试剂盒²⁵ 检测线粒体膜电位（参见 材料表）。丢弃培养基并用无血清培养基洗涤一次。
2. 将JC-1工作溶液加入每个试管中并充分混合。在37°C孵育20分钟，并用JC-1染色缓冲液洗涤细胞两次。向每个孔中加入完整的培养基，并在荧光显微镜下捕获照片。

6. TUNEL 染色测定

1. 使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（见 材料表）测定细胞凋亡率²⁶。弃去上清液并用无血清培养基洗涤沉淀一次。
2. 加入细胞固定溶液，并在室温下孵育30分钟后用PBS洗涤一次。
3. 向每个孔中加入0.3%Triton-100，并在室温下孵育5分钟。用PBS洗涤细胞两次。加入TUNEL检测工作溶液，并在37°C黑暗中孵育60分钟。
4. 加入含有4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI;见 材料表）的抗荧光猝灭密封片，并在荧光显微镜下拍摄照片。

7. 通过转染mCherry GFP-LC3B腺病毒监测自噬血流

1. 用新鲜培养基替换每个孔中的一半培养基。向培养基中加入Ad-mCherry GFP-LC3B腺病毒（感染多重性[MOI]，共2），并加入5μg/mL聚溴乙烯（参见 材料表）以提高感染效率。
2. 24小时后更换新鲜培养基，并在共聚焦显微镜下观察荧光蛋白的表达。
3. 确认成功病毒感染后，以与第1部分相同的条件培养细胞，并在共聚焦显微镜下捕获图像²⁷。
   注意:超过20%的细胞显示绿色荧光蛋白（GFP）荧光，表明感染成功。

8. 蛋白质印迹分析

1. 收集用于全蛋白提取的细胞并在冰上裂解它们（RIPA，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂= 100:1:1;参见 材料表）30分钟。
2. 蛋白质定量后，向蛋白质样品中加入5x蛋白质上样缓冲液，并将样品煮沸10分钟。
3. 用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶²⁸对含有等量蛋白质的样品进行电泳。然后，将样品转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
4. 用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1小时，并与一抗（PINK1，Parkin;参见 材料表）在4°C孵育过夜，二抗在室温下孵育1小时。
5. 使用增强型化学发光 （ECL） 溶液和化学发光检测系统检测目标条带。使用图像J软件通过密度计28量化条带。

9.免疫荧光检测帕金线粒体易位

1. 通过双重免疫荧光染色观察帕金与线粒体的共定位。从每组中弃去细胞上清液，并用PBS洗涤三次。
2. 在室温下用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，并在PBS中加入0.1%的Triton-100。
3. 用无动物阻断溶液（参见 材料表）封闭1小时，以防止蛋白质和抗体之间的非特异性结合并降低荧光背景。
4. 与一抗（Parkin和Tom20;参见 材料表）在4°C孵育过夜。
5. 加入荧光二抗（参见 材料表）并在黑暗中孵育1小时。
6. 加入含DAPI的抗荧光淬灭片，并在共聚焦显微镜下捕获图像。

10. 统计分析

1. 使用图形和分析软件进行统计分析（参见 材料表）。
2. 使用单因子方差分析比较组之间的连续变量。 p < 0.05被认为具有统计学意义。

Results

藏红花素对细胞活力的影响
0.1 μM、0.5 μM、1 μM、5 μM、10 μM、50 μM 和 100 μM 的藏红花素对细胞有显着的增殖作用，而浓度高于 200 μM 的藏红花素显着抑制 H9c2 细胞的增殖（图 1A）。用400μM H 2 O₂处理4小时后，细胞活力大大降低，藏红花素可以在一定程度上逆转这种变化（图1B）。由于在H₂O₂诱导的H9c2细胞活力上未观察到10μM和100μM藏花素之间的显着差异，因此选择10μM藏花素作为高浓度，分别使用1μM和0.1μM作为中低剂量组。

藏红花素对H9c2细胞LDH、CK、MDA、SOD、GSH-Px和CAT的影响
用400μM H 2 O₂处理4 h后，LDH，CK和MDA水平显着增加，而SOD...

Discussion

通过先进技术从天然药物的复杂化合物中探索有效成分一直是中医药研究的热点²⁹，验证后可为未来的药物开发提供实验室证据。红花是治疗"促进血液循环，减少血瘀"的代表药物，广泛用于治疗心肌梗塞^30,31。藏红花被认为具有与红花相似的功效，其促进血液循环和祛血瘀的效果明显优于红花^31,32。藏红花素是藏红花³³的主要活性成分之一，因此用于本实验的研究。

H₂O₂可引起心肌细胞氧化应激损伤，模拟心肌细胞心肌梗死状态，被确立为体外心肌梗死模型³⁴。本研究低浓度藏红花素可促进心肌细胞的细胞活力，这可能与线粒体能量代谢的激活密切相关。藏红花素可恢复H₂

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% 胰蛋白酶	Gibco	2323363
1% 青霉素-链霉素	Sigma	V900929
5x 蛋白上样缓冲液	北京普利莱基因科技	B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B 腺病毒	Beyotime	C3011
Alexa Fluor 488 偶联的山羊抗兔 IgG （H+L）	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co.， Ltd. 中山金桥生物科技有限公司	ZF-0514
Alexa Fluor 594偶联的山羊抗小鼠IgG（H+L）	中山金桥生物科技有限公司	ZF-0513
无动物封闭液	CST	15019s
抗 Parkin 抗体	Santa Cruz	sc-32282
抗 PINK1 抗体	AB克隆	型 A11435
抗 TOM20 抗体	AB克隆	型 A19403
抗 β;-肌动蛋白  抗体	AB克隆型	AC026
BCA 蛋白检测试剂盒	KeyGEN Biotech	KGP902
血细胞计数板	Servicebio	WG607
CAT 检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A007-1-1
化学发光检测系统	上海秦乡科学仪器厂	ChemiScope 6100
CK 检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A032-1-1
辅酶Q10 （CoQ 10）	Macklin	C6129
藏红花素	成都瑞芬斯生物科技有限公司	RFS-Z01802006012
含 DAPI 的抗荧光淬灭片	中山金桥生物科技有限公司	ZLI-9557
DCFH-DA	Beyotime	S0033S
DMSO	Solarbio	D8371
Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM）	Gibco	8122091
增强化学发光 （ECL） 溶液	NCM Biotech	P10100
胎牛血清 （FBS）	Corning-Cellgro	35-081-CV
GraphPad 棱镜 7.0	https://www.graphpad.com/
GSH-Px 检测试剂盒	南京剑城生物工程研究所	A005-1-2
H9c2 心肌细胞	北京鼎国昌盛生物科技有限公司	CS0062
辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的山羊抗山羊 IgG （H+L）	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co.， Ltd. 中山金桥生物科技有限公司	ZB-2305
辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的山羊抗小鼠 IgG （H+L）	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co.， Ltd. 中山金桥生物科技有限公司	ZB-2301
JC-1 线粒体膜电位测定试剂盒	LABLEAD	J22202
LDH 测定试剂盒	南京建成生物工程研究所	A020-2-2
MDA 测定试剂盒	南京建成生物工程研究所	A003-2-2
甲醇	阿拉丁	A2114057
MTS 测定	Promega	G3581
全水醇	G 克隆	CS7730
磷酸酶抑制剂	CWBIO	CW2383
聚凝胺	Beyotime	C0351
聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜	Millipore	ISEQ00010
放射免疫沉淀测定 （RIPA） 裂解缓冲液	Solarbio	R0010
SDS-PAGE 凝胶	上海 Epizyme 生物医药科技	PG112
SDS-PAGE 运行缓冲粉	Servicebio	G2018-1L
SDS-PAGE 转移缓冲粉	Servicebio	G2017-1L
SOD 检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A001-2-2
Tris 缓冲盐水粉	Servicebio	G0001-2L
Triton X-100	Sigma	SLCC9172
TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒	Beyotime	C1086
Tween-20	Solarbio	T8220