藏红花素对H9c2心肌细胞氧化应激的保护作用 通过 PINK1/Parkin 通路介导的线粒体自噬

摘要

根据 体外 本研究通过实验揭示了藏红花酸通过影响线粒体自噬来修复心肌细胞氧化应激损伤的机制，其中PINK1/Parkin信号通路发挥了重要作用。

摘要

本研究旨在探讨藏红花酸对H₂O₂介导的H9c2心肌细胞通过 体外 实验，并进一步探究其机制是否与线粒体自噬的影响有关。本研究还旨在阐明红花酸对心肌细胞氧化应激的治疗作用，并探讨其机制是否与线粒体自噬的作用相关。此处，采用H₂O₂基于氧化应激的模型被构建，并通过检测乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）的水平，评估心肌细胞氧化应激损伤程度。采用活性氧（ROS）荧光探针DCFH-DA、JC-1染料和TUNEL染料检测线粒体损伤和细胞凋亡。通过转染Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒检测自噬流。随后检测线粒体自噬相关蛋白 通过 western blotting 和免疫荧光。然而，藏红花素（0.1–10 µM）可显著提高细胞活力，并减轻由 H 引起的细胞凋亡和氧化应激损伤₂O₂在自噬过度激活的细胞中，藏红花酸亦可降低自噬流以及线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin的表达，并逆转Parkin向线粒体的转位。藏红花酸可降低H₂O₂介导的氧化应激损伤及H9c2细胞凋亡，其机制与线粒体自噬密切相关。

引言

急性心肌梗死（AMI）是由于冠状动脉严重且持续的缺血和缺氧引起的心肌坏死，可危及生命^1,2。经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是AMI的一线治疗策略之一，通常可保护心肌细胞免受缺血损伤^3,4。若AMI发生后未能及时有效地治疗，远端心肌将缺乏血液和氧气供应，导致缺血性坏死及进一步的心血管并发症^5,6。在错过PCI手术时机后，如何促进心肌细胞恢复并最大限度减少不可逆的心肌损伤，已成为研究热点。AMI发生后，心肌细胞处于缺血缺氧状态，导致线粒体氧化磷酸化受抑、NAD+还原为NADPH、单电子还原反应增加⁷。因此，氧的不完全还原反应产生过量的活性氧（ROS），最终导致心肌细胞的氧化应激损伤⁸。ROS的过度积累会触发脂质过氧化，进一步破坏线粒体膜的结构与功能，导致线粒体通透性转换孔持续开放、线粒体膜电位下降，从而诱导细胞凋亡和坏死。

血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂（ARBs）、β-肾上腺素能受体抑制剂、醛固酮拮抗剂以及其他急....

方案

实验在北京中医药大学生理学实验室进行。所有研究方法均遵循北京中医药大学的相关指南和规定。

1. 细胞培养

1. 向基础培养基 DMEM（含 4.5 g/L D-葡萄糖、4.g.g/L L-谷氨酰胺和 110 mg/L 丙酮酸钠；参见材料表）中加入 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素，配制完全 DMEM 培养基。
2. 将液氮冻存的 H9c2 心肌细胞（参见材料表）在 37 °C 温水中快速均匀振荡融化，直至冰完全溶解。
3. 将细胞转移至离心管中，加入四倍体积的完全 DMEM 培养基，于室温下以 358 x g 离心 5 分钟，用移液器弃去上清液。
4. 用培养基稀释所得细胞悬液，轻轻吹打混匀，接种于培养瓶中。置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。

2. 细胞活力的测定

1. 将藏红花酸（见材料表）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成浓度分别为 0.05 mM、0.1 mM、0.5 mM、1 mM、5 mM、10 mM、50 mM、100 mM 和 200 mM 的溶液。
2. 用胰蛋白酶消化 ....

结果

藏红花素对细胞活力的影响
0.1 µM、0.5 µM、1 µM、5 µM、10 µM、50 µM 和 100 µM 的藏红花素对细胞具有显著的促增殖作用，而浓度高于 200 µM 时，藏红花素显著抑制 H9c2 细胞的增殖（图 1A）。经 400 µM H₂O₂ 处理 4 小时后，细胞活力显著降低，而藏红花素可在一定程度上逆转这一变化（图 1B）。由于 10 µM 与 100 µM 藏红花素在对抗 H₂O₂ 诱导的 H9c2 细胞活力下降方面无显著差异，因此选择 10 µM 藏红花素作为高剂量组，1 µM 和 0.1 µM 分别作为中剂量和低剂量组。

藏红花酸对H9c2细胞中LDH、CK、MDA、SOD、GSH-Px和CAT的影响
经400 µM H₂O₂

讨论

通过先进技术探索天然药物复杂组分中的有效成分一直是中医药研究的热点²⁹，并可在验证后为未来药物开发提供实验依据。红花是治疗中的代表性药物 "促进血液循环，减少血液淤滞" 并广泛用于心肌梗死的治疗^30,31藏红花的功效被认为与红花相似，但其活血化瘀的作用显著优于红花^31,32藏红花素是藏红花的主要活性成分之一³³因此，它被用于本实验的研究中。

H₂O₂ 可导致心肌细胞氧化应激损伤，并模拟心肌细胞的心肌梗死状态，由此建立心肌梗死模型 体外³⁴在本研究中，低浓度藏红花素可促进心肌细胞的活力，这可能与线粒体能量代谢的激活密切相关。藏红花素能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	Gibco	2323363
1% 青霉素-链霉素	Sigma	V900929
5x 蛋白上样缓冲液	北京普利莱基因技术有限公司	B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B 腺病毒	碧云天	C3011
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG (H+L)	中杉金桥生物科技有限公司	ZF-0514
Alexa Fluor 594 标记的山羊抗小鼠 IgG (H+L)	中杉金桥生物科技有限公司	ZF-0513
无动物成分封闭液	CST	15019s
抗 Parkin 抗体	Santa Cruz	sc-32282
抗 PINK1 抗体	ABclonal	A11435
抗 TOM20 抗体	ABclonal	A19403
抗β-肌动蛋白 抗体	ABclonal	AC026
BCA 蛋白检测试剂盒	凯基生物	KGP902
血细胞计数板	Servicebio	WG607
CAT 检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A007-1-1
化学发光检测系统	上海勤襄科学仪器厂	ChemiScope 6100
CK 检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A032-1-1
辅酶 Q10 (CoQ 10)	Macklin	C6129
藏红花素	成都瑞芬思生物科技有限公司	RFS-Z01802006012
含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂	中杉金桥生物科技有限公司	ZLI-9557
DCFH-DA	碧云天	S0033S
DMSO	索莱宝	D8371
杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)	Gibco	8122091
增强型化学发光 (ECL) 溶液	NCM 生物科技	P10100
胎牛血清 (FBS)	Corning-Cellgro	35-081-CV
GraphPad Prism 7.0	https://www.graphpad.com/
GSH-Px 检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A005-1-2
H9c2 心肌细胞	北京鼎国昌盛生物技术有限公司	CS0062
辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗山羊 IgG (H+L)	中杉金桥生物科技有限公司	ZB-2305
辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗小鼠 IgG (H+L)	中杉金桥生物科技有限公司	ZB-2301
JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒	LABLEAD	J22202
LDH 检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A020-2-2
MDA 检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A003-2-2
甲醇	阿拉丁	A2114057
MTS 检测	普洛麦格	G3581
过氧化氢溶液	G-clone	CS7730
磷酸酶抑制剂	中生华美	CW2383
聚凝胺	碧云天	C0351
聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜	Millipore	ISEQ00010
放射免疫沉淀分析 (RIPA) 裂解缓冲液	索莱宝	R0010
SDS-PAGE 凝胶	上海翌圣生物科技有限公司	PG112
SDS-PAGE 电泳缓冲液粉末	Servicebio	G2018-1L
SDS-PAGE 转膜缓冲液粉末	Servicebio	G2017-1L
SOD 检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A001-2-2
Tris 缓冲盐溶液粉末	Servicebio	G0001-2L
Triton X-100	Sigma	SLCC9172
TUNEL 凋亡检测试剂盒	碧云天	C1086
Tween-20	索莱宝	T8220