测量脂解速率 离体 小鼠脂肪组织及分化后的原代前脂肪细胞 体外

摘要

脂肪细胞中的甘油三酯脂肪分解是一种重要的代谢过程，可释放出游离脂肪酸和甘油。本文提供了一种详细的实验方案，用于检测脂肪细胞的基础脂肪分解和刺激诱导的脂肪分解。 离体 小鼠脂肪组织

摘要

脂肪细胞以脂滴中的甘油三酯形式储存能量。这种能量可以被动员利用。 通过 脂解作用，即脂肪酸侧链从甘油骨架上依次断裂，从而释放出游离脂肪酸和甘油。由于白色脂肪细胞中甘油激酶表达水平较低，甘油的再摄取速率可忽略不计，而脂肪酸的再摄取则取决于培养基成分（如白蛋白）对脂肪酸的结合能力。通过比色法检测培养基中甘油和脂肪酸的释放量，可定量测定脂解速率。通过在多个时间点测量这些指标，可高置信度地确定脂解的线性速率。本文提供了一种详细测定脂解作用的实验方案 体外 分化后的脂肪细胞和 离体 小鼠的脂肪组织。该方案也可针对其他前脂肪细胞系或其他生物体的脂肪组织进行优化；文中讨论了相关注意事项及优化参数。本方案旨在用于确定和比较不同小鼠模型及处理之间的脂肪细胞脂解速率。

引言

过量的营养物质以甘油三酯的形式储存在白色脂肪组织中，这些甘油三酯位于脂滴的中性脂质核心内。甘油三酯储存随后被动员利用 通过 脂解作用，即脂肪组织中的甘油三酯在脂肪组织甘油三酯脂肪酶（ATGL）、激素敏感性脂肪酶（HSL）和单酰甘油脂肪酶（MGL）的作用下，逐步水解其脂肪酸侧链，最终释放出游离脂肪酸（FFAs）和甘油骨架的过程^1,2脂解作用由脂肪组织中的儿茶酚胺信号通路激活。交感神经末梢局部释放儿茶酚胺，与脂肪细胞质膜上的β-肾上腺素能受体结合。配体结合后，这些G蛋白偶联受体（GPCRs）激活腺苷酸环化酶。 通过 G_αs随后，cAMP 激活蛋白激酶 A（PKA），导致 ATGL 和 HSL 的表达上调。PKA 对 perilipin-1 的磷酸化引起 ABHD5（亦称为 CGI-58）的解离，后者可结合并共激活 ATGL。³PKA 直接磷酸化 HSL，促进其从胞质溶胶转位至脂滴，在脂滴上与磷酸化的 perilipin-1 相互作用，进一步增强其脂肪酶活性^4,5,6,7

方案

所有动物的使用均经康奈尔大学威尔康奈尔医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 缓冲液和收集板的准备

1. 通过将 5 g 牛血清白蛋白（BSA）溶解于 100 mL 无酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中配制 5% BSA 溶液。轻轻搅拌使 BSA 溶解（避免震荡，因其不利于溶解）。待 BSA 完全溶解后，使用 0.2 µm 滤器过滤除菌。将配制好的 BSA 培养基于 4 °C 保存，最长可保存 1 个月。
2. 配制对照组和刺激组的工作浓度培养基。对照组培养基：含溶剂对照的 5% BSA 培养基。刺激组培养基：含 0.5 µM CL-316,243 的 5% BSA 培养基。每次实验均需新鲜配制刺激组培养基。
3. 将待用培养基预热至 37 °C。标记一块 96 孔板用于收集培养基。

2. 样品制备

1. 按照以下说明进行细胞培养。所有细胞操作均应在无菌通风橱中进行，以尽量减少外部污染。
   1. 分离并诱导原代前脂肪细胞分化，方法见文献^73,74。
      1. 将原代前脂肪细胞以高密度接种，例如在24孔板中....

结果

我们测定了基础状态和刺激状态下的脂解速率 体外 分化后的脂肪细胞。通过使用诱导剂处理汇合的细胞，将来自腹股沟白色脂肪组织的原代前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞。 5 µM 地塞米松，0.5 mM IBMX 1 µg/mL 胰岛素，以及 1 µM 曲格列酮处理4天，随后再进行3天的额外处理 1 µg/mL 胰岛素。在进行脂解实验前，细胞在不含胰岛素的培养基中孵育24小时。在时间=0小时时，细胞用PBS洗涤一次，然后加入含2% BSA且不含酚红的DMEM，培养基中或含有 10 µM CL-316,243 或对照溶剂被加入至12孔板的每孔中。在给药后1 h、2 h、3 h和4 h，收集50%的培养基，并更换为含2% BSA的酚红-free DMEM。检测所收集培养基中的游离脂肪酸（FFA）和甘油水平，并计算各时间点分泌至培养基中的FFA和甘油的摩尔数。图2A，B）。游离脂肪酸和甘油的生成在4小时测定中呈线性，其R² 0.98 及以上。4 小时的游离脂肪酸（FFA）水平略低，表明脂解速率可能正在减缓；然而，无论是否包.......

讨论

在此，我们提供一种用于测定脂肪细胞脂解速率的基本实验方案 离体 脂肪组织。为了定量测定脂解作用，重要的是在脂解的线性相内测量其速率。我们采用连续取样技术，即在固定时间间隔收集大部分培养基并补充新鲜培养基。这种半保守方法可不断添加具有游离脂肪酸缓冲能力的新鲜牛血清白蛋白（BSA），延缓反馈抑制，从而延长线性脂解的持续时间。该实验设计旨在模拟脂肪组织的血管化环境。 体内，可提供新鲜的白蛋白以结合释放的游离脂肪酸⁷⁵. 本方案已优化用于检测小鼠中的脂解作用 离体 白色脂肪组织和腹股沟脂肪组织原代前脂肪细胞分化 体外该方案有望经过优化后适用于棕色和米色脂肪组织库，以及来自其他生物体和具有高脂肪生成潜能的永生化细胞系的脂肪组织。在收集脂肪组织之前，该方案对小鼠的年龄、性别和饮食具有灵活性。 离体 检测方法。某些操作（如禁食）可能影响基础脂解速率，而其他干预措施（如饮食诱导的肥胖）也会影响刺激性脂解的速率。

该方案需针对每个实验系统进行优化，具体取决于脂肪分.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔组织培养处理板	Corning Inc	3527	必须经过组织培养处理，适用于脂肪细胞分化
48孔平底带盖板	Corning Inc	353078	可使用组织培养处理板
6孔平底带盖板	Corning Inc	353046	可使用组织培养处理板
96孔PCR板	USA sceintific	1402-9100	任何0.2 mL锥形PCR板均可使用
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A9418	无游离脂肪酸的BSA（如A8806）也常被使用。BSA中不应含有可检测的游离脂肪酸，且不同批次BSA的差异可能影响脂解速率的观测结果
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4，也可从其他供应商获取
CO2培养箱	PHCBI	MCO-170AICUVH	脂肪组织培养时CO2浓度理想设置为10%，但5% CO2也可使用
DMEM低糖培养基，不含酚红	Thermofischer	11054020	任何不含酚红的培养基均可使用，如DMEM/F12、RPMI，但应具备挥发性缓冲能力，即含有碳酸氢盐
无游离脂肪酸牛血清白蛋白	Equitech-Bio, Inc,	BAH66
游离甘油检测试剂	Sigma Aldrich	F6428
甘油标准溶液	Sigma Aldrich	G7793	也可通过将甘油稀释至所需浓度自行配制
HR系列NEFA标准溶液	Fujifilm	276-76491
HR系列NEFA-HR (2) 显色试剂A	Fujifilm	999-34691
HR系列NEFA-HR (2) 显色试剂B	Fujifilm	991-34891
HR系列NEFA-HR (2) 溶剂A	Fujifilm	995-34791
HR系列NEFA-HR (2) 溶剂B	Fujifilm	993-35191
微生物培养箱	Fischer Scientific	S28668	任何可在37°C下运行的培养箱均可使用
Nunc MicroWell 96孔板	Thermo Scientific	269620	任何光学透明、平底的96孔板均可使用
硅胶实验室台面垫	VWR	76045-300	也可使用玻璃板。不推荐使用吸水性表面
分光光度计/微孔板读板仪	Molecular devices	SpectraMax i3x	任何可在540 nm、550 nm和660 nm波长下读数的微孔板读板仪均可使用
牛血清白蛋白 V	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70擦拭纸	Kimberly-Clark	41200	任何高质量的纸巾均可使用