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铁蛋白吞噬作用：评估人成纤维细胞中通过自噬选择性降解铁的过程

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DOI：

10.3791/65110

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2024年2月23日

 , 
1Interfaculty Institute of Cell Biology, Eberhard Karls University Tübingen

本文内容

摘要

本方案提供了在原代皮肤来源的人成纤维细胞中进行高通量、基于免疫荧光的铁蛋白自噬检测的详细操作步骤。

摘要

自噬基因 WDR45/WIPI4 的突变是β-螺旋桨相关性神经退行性疾病（BPAN）的致病原因，BPAN 是一类被称为“伴脑铁沉积的神经退行性疾病”（NBIA）的人类疾病的亚型，其特征为患者脑组织中存在铁沉积。细胞内铁水平受到多种细胞机制的严格调控，其中铁蛋白自噬（ferritinophagy）是关键机制之一。本文描述了如何在原代皮肤来源的人成纤维细胞中评估铁蛋白自噬。在本实验方案中，我们采用可调节铁水平的处理条件，在细胞水平上诱导或抑制铁蛋白自噬，例如使用巴佛洛霉素 A1（bafilomycin A1）抑制溶酶体功能，或分别使用柠檬酸铁铵（FAC）和地拉罗司（deferasiox, DFX）处理以实现铁过载或铁耗竭。经上述处理的成纤维细胞随后进行高通量成像，并利用 CellProfiler 软件对内源性铁蛋白以及自噬小体/溶酶体标志物（此处为 LAMP2）进行定量定位分析。根据自噬小体/溶酶体中铁蛋白的水平，可推断铁蛋白自噬的程度。该方案可用于评估 BPAN 患者来源的原代成纤维细胞或其他类型的哺乳动物细胞中的铁蛋白自噬活性。

引言

WIPI（WD重复序列与磷脂酰肌醇相互作用蛋白）是一类在进化上保守的PI3P效应蛋白，在自噬过程中具有不同的功能1。人类的四种WIPI蛋白（WIPI1至WIPI4）折叠形成七叶片β-螺旋桨结构，其中包含两个进化上保守的区域，同源且不变的氨基酸分别聚集在螺旋桨结构的相对两侧。其中一个位点与位于第5和第6叶片的磷脂酰肌醇结合区域相对应；另一个位点则与蛋白质-蛋白质相互作用区域相对应，WIPI蛋白通过该区域与自噬机制中的不同组分或自噬调控因子特异性结合2。

WIPI4 在调控能量依赖性自噬以及控制新生自噬体生长大小的层面上发挥功能3。在 WIPI4 基因（亦称为 WDR45）中发生的突变，是导致β-螺旋桨蛋白相关性神经退行性疾病（BPAN）的原因，该病属于人类患者中伴有脑铁沉积的神经退行性疾病（NBIA）亚型，其特征是在黑质和苍白球出现低信号铁环4。BPAN 患者体内异常铁沉积会引发神经元损伤，进而表现为脑病、全面发育迟缓、癫痫发作，最终发展为帕金森综合征、痴呆和痉挛状态5。

铁稳态受到多种细胞机制的严格调控，胞质铁浓度由铁载体、铁转运蛋白和铁储存蛋白的表达水平及功能状态所控制6。而胞质铁浓度又决定了是否启动铁蛋白自噬7等降解途径或蛋白酶体清除氧化铁蛋白8的过程。

在铁蛋白自噬过程中，当细胞内铁水平较低时，货物受体 NCOA4 会特异性地将铁蛋白招募至自噬体，并靶向运送至溶酶体进行降解7。鉴于 WIPI4 在调控自噬体膜大小方面的作用3，可以合理推测，该特定功能的缺失可能会影响铁蛋白在自噬体中的选择性包裹，从而影响铁蛋白自噬。研究铁代谢中的这一关键步骤可能为 BPAN 患者带来新的治疗策略；然而，目前针对人类细胞中铁蛋白自噬的研究仍缺乏成熟通用的实验方案。

本文介绍了一种基于荧光的高通量方法，用于评估人细胞中的铁蛋白自噬。将该检测方法应用于患者来源的BPAN细胞，可深入了解铁蛋白自噬与健康人细胞之间的差异，并可作为理解这种罕见人类疾病分子机制的基准。

方案

1. 原代细胞的培养与接种

  1. 从液氮罐中取出冻存细胞的小瓶，置于冰上保存，直至到达细胞培养室。在预先灭菌的超净工作台内，用手握住小瓶，使细胞悬液融化。重悬细胞后，将其转移至含9 mL预热的DMEM培养基（含10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素（P/S））的10 cm细胞培养皿中。轻轻摇晃使细胞在培养皿中均匀分布，并在37 °C、5% CO2条件下培养过夜。
  2. 次日早晨，观察细胞以确认其已贴壁。更换为新鲜的DMEM + 10% FCS + 1% P/S培养基，继续培养细胞至其达到80%融合度。
  3. 移除培养基，用DPBS洗涤两次，向培养皿中加入1 mL胰蛋白酶，于37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟。向培养皿中加入9 mL DMEM + 10% FCS，重悬细胞。
  4. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中。使用血球计数板（Neubauer计数室）手动测定细胞数量，并用DMEM + 10% FCS稀释细胞悬液，直至细胞浓度达到40,000个细胞/mL。
  5. 在玻璃底96孔板中，每孔接种100 µL细胞悬液。于37 °C、5% CO2条件下孵育16小时。

2. 处理方法

  1. 根据材料表配制以下处理溶液：对照培养基、用于铁螯合的对照培养基加去铁胺（DFX），或用于铁过载的对照培养基加柠檬酸铁铵（FAC）。为评估铁蛋白自噬流，每种处理均需在有或无溶酶体抑制剂（巴佛洛霉素 A1）的条件下进行。
  2. 移除培养板中的培养基，更换为相应的处理溶液（100 µL/孔）。
  3. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 6 小时。

3. 固定与染色

  1. 吸去处理液，用 DPBS 洗涤 2 次（材料表）。
  2. 每孔加入 100 µL 3.7% 多聚甲醛（PFA，材料表），于室温避光固定细胞 20 分钟。
  3. 去除 PFA，用 PBS/T 洗涤细胞 2 次（材料表）。
  4. 用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS/T 在 4 °C 下封闭 1 小时。
  5. 在 PBS/T 中配制一抗（材料表）混合液（铁蛋白抗体 1:50，LAMP2 抗体 1:50）。
  6. 用 PBS/T 洗涤细胞 2 次，每孔加入 50 µL 抗体混合液。用封口膜包裹培养板，4 °C 过夜孵育。
  7. 次日早晨，在 PBS/T 中配制二抗（材料表）混合液（1:200）。
  8. 用 PBS/T 洗涤细胞 2 次，每孔加入 50 µL 二抗混合液。4 °C 避光孵育 1 小时。
  9. 用室温 PBS 配制 5 µg/µL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，材料表）溶液。
  10. 用 PBS/T 洗涤细胞 2 次，每孔加入 100 µL DAPI 染液。室温避光孵育 20 分钟。
  11. 用 PBS 洗涤细胞 2 次，每孔加入 50 µL PBS。用封口膜包裹培养板，于 4 °C 避光保存。

4. 使用共聚焦激光扫描显微镜进行自动成像

  1. 将孔板中的 PBS 替换为 50 µL 室温的新鲜 PBS。
  2. 用铝箔包裹孔板，并将其送至显微镜室。
  3. 打开共聚焦激光扫描显微镜，将适用于 96 孔板的样品架安装在显微镜载物台上，并选择合适的物镜（此处为 40x）。详细信息请参见表 1。
  4. 调整成像设置（表 1）。
    1. 在Smart Setup中，选择激光器和滤光片，并将其分配至轨道（轨道 1-3），以获得最佳图像质量和速度（表 1）。
    2. 在选择实验类型时，点击Tiles以启用选择和保存孔板上确定的X,Y 位置的选项。
    3. 在Imaging Setup模块中，查看采集通道、分配给它们的轨道以及各自的激发和发射波长（表 1）。
    4. 在Acquisition Mode 模块中，选择以下参数：扫描速度：6；方向：双向；平均次数：2x；每像素位数：8。
    5. 在Channels模块中，针对每个通道单独调整激光功率、针孔和主增益（表 2）。微调这些参数，以获得曝光适当的图像，避免过饱和。
    6. 点击Focus strategy模块。
      1. 选择Combine Software Autofocus和Definite Focus。
      2. 在Reference Channel and Offsets下，选择最稳定/最亮的通道作为参考通道（通常为 DAPI 或 488 nm）。
      3. 在Stabilization Event Repetitions and Frequency下，选择Standard。
    7. 在Software Autofocus模块中，选择以下参数：模式 | 强度；搜索 | 智能；采样 | 精细；相对范围。
    8. 点击Tiles模块。
      1. 选择位置 | 单个位置。
      2. 在Advanced Setup下，浏览孔板，确定一个成像位置，并点击Position Setup标签下的+按钮。
      3. 使用将记录在图像元数据中的附加信息为每个位置添加标签。操作方法为：打开Properties标签，点击Category下拉菜单旁的齿轮图标，然后点击New以打开一个新的对话框，在其中输入新类别名称。要为特定位置分配类别，请选择该位置，点击Properties标签，进入Categories下拉菜单，并选择相应的标签。
        ​注意：建议为每种处理方式创建一个类别，以便用细胞所接受的处理方式标记每个位置。
      4. 在Sample Carrier下，选择Multiwell 96-Cellvis glass bottom #0。点击Calibrate以校准显微镜至孔板表面。根据系统规格选择1 点或7 点校准。
      5. 在Options下，选择10%的图像拼接重叠率。在Travel in Tile Regions下，选择Comb。勾选以下选项：使用载物台控制中的载物台速度、使用载物台控制中的载物台加速度以及采集期间生成图像金字塔。
  5. 运行图像采集，并将图像结果（czi 文件）和图像元数据（csv 文件）保存至便携式硬盘。
  6. 将图像导出为 TIFF 文件。

5. 高通量图像分析

  1. 创建一个独立的元数据电子表格文件，包含以下列：位置、孔位、条件、系列和组。这些列所需的数据来自共聚焦激光扫描显微镜附带的原始元数据文件。
  2. 下载开源软件 CellProfiler 4.2.4（https://cellprofiler.org/previous-releases）。
  3. 通过双击启动 CellProfiler 4.2.4，并通过拖放操作导入 CellProfiler 分析流程（补充文件 1）。
    注意：以下为构建 CellProfiler 分析流程（补充文件 1）的步骤，用于通过 DAPI 染色自动识别成纤维细胞（模块 1，细胞核识别，见 表 2）以及来源于 AF488 的单个细胞背景荧光（模块 2，细胞识别，见 表 2）。斑点（称为“对象”）的识别由斑点大小及斑点相对于背景的荧光强度决定（模块 3，斑点识别，见 表 2）。最后，根据细胞边界，软件将识别出的斑点分配至相应细胞（分配关系）。此前已有文献详细描述如何为自噬研究构建 CellProfiler 分析流程9。此外，表 2 列出了本研究中使用的 CellProfiler 设置参数。同时，补充文件 2 展示了 CellProfiler 分析流程（补充文件 1），并按顺序提供了截图，对应 表 2 中详述的各个模块。
  4. 在调整 CellProfiler 分析流程（补充文件 1）之前，将单个 .czi 图像文件或包含多个 .czi 图像文件的文件夹 通过拖放方式添加至图像模块。
  5. 自定义图像识别流程。在名称与类型模块中，将c1-c3 代码替换为可使软件识别并分类待分析单通道图像的新代码。
  6. 通过优化识别初级对象和识别次级对象模块中的数值参数，调整分析流程设置。本研究中使用的具体数值见表 2。
  7. 为跟踪调整效果，点击启动测试模式按钮，进入测试模式。然后点击各模块之间的步骤按钮 。等待弹出窗口显示原始输入图像、叠加在原始图像上的识别轮廓以及分析结果，以查看当前设置下图像的分析效果。
  8. 当分析流程优化完成后，退出测试模式。点击退出测试模式，然后点击分析图像按钮，执行正式分析。
  9. 分析完成后，通过比较输入图像与 CellProfiler 生成的叠加输出图像（细胞边界、斑点）来验证细胞和斑点检测的准确性。若结果不理想，需调整不同模块中的数值参数（见表 2），直至分析结果达到足够高的准确度。

6. 数据分析

  1. 运行分析后，等待软件生成一组包含结果的表格文本文件。如果使用提供的 CellProfiler 流程（补充文件 1），请查找以下输出文件：
    1. CellProfilerOutputCells 文件，其中列出软件分配的图像编号、分配给单个细胞的细胞编号、原始文件名以及文件存储路径、每个细胞中的点状结构数量（铁蛋白、LAMP2）以及每个细胞中点状结构的平均面积（铁蛋白、LAMP2）。
    2. CellProfilerOutputExperiment 文件，其中提供与实验相关的技术细节信息（例如软件版本、图像通道、元数据标签）。
  2. 将这些文件作为电子表格打开。
  3. 使用首选的统计分析软件（材料表）对点状结构计数和点状结构共定位数量进行统计分析。

结果

来自健康供体的人皮肤来源的原代成纤维细胞（F-CO-60）（图1A）经巴佛洛霉素A1处理后，用于铁蛋白自噬评估，随后进行内源性铁蛋白和LAMP2的免疫染色、自动图像分析以及基于CellProfiler的分析（图1B）。

在加入巴佛洛霉素 A1 阻断铁蛋白的溶酶体降解后，内源性铁蛋白与 LAMP2 的共定位增加，这与其抑制溶酶体 V-ATPase 酶的能力一致，从而阻断铁蛋白吞噬作用7（图 2）。此外，基于软件的细胞识别以及铁蛋白和 LAMP2 的识别也作为示例展示（图 2）。

在这方面，需要注意的是，此处介绍的 CellProfiler 分析流程具有极高的灵活性，可根据需要调整以适用于其他和（或）替代性的检测指标，例如用于评估特定 BPAN 突变在功能性单细胞标志物系统背景下对细胞生长、线粒体或其他细胞器的影响。

铁蛋白自噬过程示意图及铁循环；皮肤活检成纤维细胞培养流程图。
图1：实验概览。 图示（A）铁蛋白自噬过程及（B）本实验方案中用于评估原代皮肤来源人成纤维细胞中铁蛋白自噬的实验流程。 请点击此处查看该图的放大版本。

在喂养条件和巴佛洛霉素 A1 处理条件下，铁蛋白-AF488 和 LAMP2-AF546 的荧光显微镜图像。
图 2：代表性图像。 在对照培养基（喂养条件）中培养的原代皮肤来源人成纤维细胞，在（A）无或（B）有巴佛洛霉素 A1 存在的情况下，进行间接免疫荧光分析，所用抗体为抗铁蛋白抗体和抗LAMP2抗体，细胞核则用DAPI染色。展示了通过共聚焦激光扫描显微镜自动化系统获取的典型荧光图像（比例尺：10 μm）。在给予巴佛洛霉素 A1 抑制溶酶体功能后，可观察到铁蛋白与LAMP2的表达水平及其共定位的变化。同时展示了基于CellProfiler的分析结果，图中显示了软件生成的图像叠加效果，包括细胞识别区域（紫色）、细胞核（蓝色）、铁蛋白（绿色）、LAMP2（红色）以及共定位的铁蛋白/LAMP2（黄色）点状结构。（C）放大图像区域（比例尺 = 10 µm）。请点击此处查看该图的高清版本。

表1：本研究中使用的共聚焦激光扫描显微镜设置。 请点击此处下载该表格。

表2：本研究中使用的CellProfiler数值设置。 请点击此处下载该表格。

补充文件1：本研究中使用的CellProfiler分析流程。 请点击此处下载该文件。

补充文件2：按顺序截取的CellProfiler流程图展示（参见补充文件1）（见表2）。 请点击此处下载该文件。

讨论

该方法采用自动荧光显微镜结合基于开放获取软件CellProfiler的图像分析9 为评估关键铁蛋白自噬因子的细胞内定位，该实验设计旨在提供有关溶酶体清除铁蛋白效率的重要信息 通过 选择性自噬，称为铁蛋白自噬7该方案可同时处理包含多种细胞系和处理条件的大样本量，并评估所需的检测指标，例如铁蛋白点状结构的数量以及与溶酶体标志物LAMP2共定位的铁蛋白点状结构数量，后者常用于评估铁蛋白自噬流。然而需要强调的是，准确的自动化图像分析依赖于图像质量，而图像质量又取决于抗体的特异性和最佳成像条件。因此，基于软件的图像分析仅应在高质量图像上进行。

细胞内铁水平的调节可为了解疾病背景下调控铁稳态的机制提供重要信息。本文描述了一种在经铁负荷和铁螯合剂处理的患者来源细胞中研究BPAN疾病的方法。Deferasiox（DFX）是一种在该领域广泛使用的已知铁螯合剂。10施加后，它可螯合细胞质中的游离铁，并触发细胞对铁缺乏的应答。由于本研究旨在评估铁蛋白自噬，通过剥夺细胞铁元素来促进铁蛋白降解是一种直接有效的方法。 通过 自噬作为一种代偿机制，用于补充细胞内的铁池。相反，柠檬酸铁铵（FAC）则用于向细胞加载铁。当胞质铁浓度过高并产生毒性时，细胞会激活铁蛋白的合成以应对。11因此，柠檬酸铁铵可促进铁蛋白的合成以及铁在铁蛋白异源多聚体内的滞留，进而激活铁蛋白自噬。

为了研究铁蛋白自噬流，在本实验方案中，我们选择性地对过程中的关键组分——铁蛋白和溶酶体（此处以LAMP2标记）——进行染色，并评估它们的共定位情况。共定位点状结构所占比例较高，表明铁蛋白被溶酶体有效降解。为了从此类实验中获取尽可能多的信息，可同时使用其他染料或标记抗体。

值得注意的是，该方法本身存在一些技术挑战。来自不同人类供体的原代成纤维细胞在体外（in vitro）的增殖和生长情况可能有所不同。因此，为了获得可比较的结果，不同细胞应在相同的传代次数下接种。建议在正式开展本方案前，先进行预实验，以检测所用细胞或细胞系的倍增时间。

该方法不仅限于铁蛋白自噬的研究；通过简单更换所使用的处理方法和抗体，即可重新用于评估其他多种选择性自噬通路；例如，可使用CCCP作为线粒体应激诱导剂，并采用optineurin、LC3和LAMP2抗体进行染色，以检测线粒体自噬12。

总体而言，自动图像采集与CellProfiler分析相结合，构成了对单个人类成纤维细胞进行高通量功能评估的强大工具。这对于研究人类疾病尤其重要，因为分析和比较大量来源于患者的细胞与健康供体来源的细胞具有重要意义。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）资助，项目编号 259130777 - SFB 1177（项目 E03）。图 1 使用 BioRender 制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>细胞系
原代皮肤来源的人成纤维细胞 皮肤活检，健康人类供体，大学诊所生物样本库 Tü宾根，伦理批准编号 389/2019BO2F-CO-60，第9代
<强>细胞培养处理<强>终浓度（化合物）
对照培养基DMEM 10% FCS（仅 DMSO）
对照培养基 + 巴佛洛霉素A1DMEM 10% FCS100 nM 巴佛洛霉素 A1
对照培养基 + 去铁胺（DFX）DMEM 10%FCS30 µM DFX
对照培养基 + DFX + 巴佛洛霉素A1DMEM 10%FCS30 µM DFX，100 nM 巴佛洛霉素 A1
对照培养基 + 枸橼酸铁铵（FAC）DMEM 10% FCS0.05 mg/mL FAC
对照培养基 + FAC + 巴佛洛霉素A1DMEM 10% FCS0.05 mg/mL FAC，100 nM 巴佛洛霉素 A1
<强>材料
牛血清白蛋白（BSA）第五组分AppliChemA1391
Alexa 488 标记的驴抗兔抗体Life TechnologiesA-11008
Alexa 546 标记的山羊抗小鼠抗体Life TechnologiesA-11003
Bafilomycin A1Sigma Aldrich196000
BioLite 细胞培养处理 10 cm 培养皿赛默飞世尔科技130182
DAPIAppliChemA4099
Deferasiox (ICL-670)SelleckchemS1712
DMEM GlutamaxGibco31966
DMSO AppliChemA3672
不含钙和镁的DPBSGibco14190094
胎牛血清（FCS）Gibco10437-028
柠檬酸铁铵（FAC）默克F5879
抗铁蛋白（人脾脏）Rockland200-401-090-0100
LAMP2（H4B4）圣克鲁斯Sc-18822
多聚甲醛（PFA）Sigma-Aldrich441244
PBS 10x Dulbecco’sAppliChemA0965
青霉素-链霉素溶液（1,000 U/mL 青霉素，100 mg/mL 链霉素）Life Technologies15140-122
含酚红的0.05%胰蛋白酶-EDTAGibco25300
Tween20AppliChemA4974
96孔玻璃底#0板CellvisP96-0-N
<强>溶液
3.7% 多聚甲醛（PFA）PFA 溶于 PBS，pH 7.5 
Bafilomycin A1 100 mM 储存液Bafilomycin A1 溶于 DMSO
柠檬酸铁铵（FAC）100 mg/mL 储存液FAC 溶于高压灭菌的双蒸水中
PBS/TPBS，添加10% Tween20 
PBS/T + BSAPBS，添加10% Tween20和1% BSA 
<强>软件
CellProfiler 4.2.4https://cellprofiler.org/
GraphPad PrismDotmatics
Microsoft Excel 版本 16.50Microsoft Office Plus 365

参考文献

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