用于过敏性接触性皮炎评估的小鼠耳模型

过敏性接触性皮炎（ACD）是一种常见的皮肤病，其特征是接触部位出现湿疹样症状，中度病例出现水肿和红斑，^{严重病例出现}丘疹、糜烂、渗出甚至大面积疤痕1。它影响多达 20% 的人口，并且可以影响任何年龄的人²。ACD通常发生在反复接触过敏原的个体中，可能是由个体对家中或工作场所的一种或多种过敏原的免疫反应引起的³。IV型迟发性超敏反应被认为是ACD⁴的主要免疫反应类型。在反复暴露于过敏原的皮肤区域，循环记忆T细胞大量积累并诱导免疫和炎症反应³，^5，6。这项工作的目的是提出一种可靠的实验室技术，用于进一步研究ACD发展中的免疫和炎症反应。

ACD 的发作通常是由于反复接触化学品引起的接触超敏反应。在过去的几十年中，许多研究人员在家鼠⁷，⁸，豚鼠⁹，¹⁰和其他动物中开发了各种ACD动物模型^，以模拟疾病的发作。大多数实验方法包括两个阶段:腹部致敏（诱导）和在背部或耳垂上提供刺激（刺激）。常用化学物质主要有1-氟-2，4-二硝基苯（DNFB）/1-氯-2，4-二硝基苯（DNCB）⁸，^9，11、噁唑啉酮12、漆酚¹³等。其中，DNFB和DNCB应用最广泛，首次报道于1958年10月¹⁰。镍敏化模型¹⁴和光过敏性接触性皮炎模型¹⁵也经常使用。

我们提出了一种构建ACD模型的实验方法。该方法在前人研究的基础上，与多个实验进行了对比，对该方法进行了总结和优化。与其他ACD模型相比，该模型具有一些优点，如个体差异小，实验周期短，化学刺激量小等。此外，本研究适用于小鼠，不仅经济，而且在基因敲除或转基因小鼠制备方面有更多的选择¹⁶。我们还描述了用于监测实验中ACD进展的各种方法，例如测量耳朵厚度，使用埃文斯蓝染料测量炎症渗出等。该模型不仅可以通过实验室手段分析小鼠耳朵、血液、脾脏等样本，探索ACD的发病机制，而且适用于新治疗方法的临床前评价，具有一定的推广意义。

小鼠的所有护理和治疗均符合扬州大学机构动物护理和使用委员会制定的指导方针，并经机构动物护理和使用委员会批准，项目许可证为SYXK（SU）2022-0044。本研究使用6-8周龄的BALB / c雄性和雌性小鼠。每组由六只小鼠组成（见 材料表）。将笼子放置在温度受控室（22±2°C，12小时光照/黑暗循环）中，自由获取食物和水。实验流程图如图 1所示。

1. 动物制备

1. 适应环境 1 周后开始建模。
2. 在操纵小鼠之前，使用紫外线灯和75%酒精消毒剂清洁和消毒环境和台面。
   注意:为避免外界因素的影响，不能在鼠标耳朵上对小鼠进行标记以进行识别;背部或尾部染色可用作替代方法。
3. 使用小棉签将肥皂水涂抹在小鼠的腹部（约1-2cm²大小）。在建模开始时（第0天;图2A）。
   注意:使用直剃须刀片脱毛需要熟练的操作人员。如果操作不正确，可能会引起皮肤刺激。考虑使用脱毛膏、剪刀或安全剃须刀脱毛。
4. 称量鼠标并比较每组之间的重量变化。

2.腹部致敏刺激

1. 确保剃须引起的腹部皮肤任何轻微损伤完全恢复。剃须后 2 天（第 2 天）进行腹部致敏。
2. 制备0.5%DNFB溶液:用丙酮:橄榄油混合物以4:1的比例稀释DNFB（例如，400μL丙酮与100μL橄榄油混合;见 材料表）。使用移液枪吹气并混合20次，以彻底混合DNFB溶液。在每次向小鼠施用DNFB溶液之前，吹气并混合三到五次。
   注意:使用前准备溶液并将其包裹在铝箔中，以防止阳光直射。
3. 用移液器将25μL的0.5%DNFB溶液涂在小鼠腹部剃光区域的皮肤上（图2B）。
4. 将DNFB溶液滴在腹部剃须区域的中间，并用移液器吸头的光滑侧轻轻涂抹以均匀分散。
5. 在DNFB刺激后30秒，将小鼠放在没有垫料的空笼子中，以防止它们擦掉DNFB溶液。当DNFB溶液完全干燥（约2分钟）时，将小鼠放回原来的笼子。
6. 处理DNFB溶液时戴手套，因为它对人体皮肤有强烈刺激性。

3.耳敏化刺激

1. 如上所述制备0.2%DNFB溶液，载体溶液（丙酮和橄榄油的4:1混合物）和纯水。
2. 在整个手术过程中，定向小鼠身体并使耳廓的外缘朝下，以防止溶液在DNFB刺激期间进入耳道。
3. 在第 4、6、8 和 10 天，使用移液器将 20 μL 的 0.2% DNFB 溶液或载体溶液缓慢均匀地涂在小鼠左耳廓的内表面上。为避免DNFB溶液进入耳道，请在给药期间使用移液器吸头的光滑侧轻轻分配DNFB溶液。让右耳未经治疗（图2C）。
4. 等到DNFB溶液干燥，将小鼠放回笼中（约30秒）。
5. 处理DNFB溶液时戴手套。

4.记录小鼠体重和ACD症状

1. 每天称量小鼠，从第1天开始，并在第0天与其相应的重量进行比较;评估ACD对小鼠体重的影响，作为体重变化（g）±平均值的标准误差（SEM）。
2. 从第1天开始，每2天拍摄小鼠耳朵的高分辨率照片以记录ACD临床症状。

5. 耳廓厚度的测量

1. 从第 1 天开始，每 2 天测量一次耳廓厚度。详细测量和记录双耳。
2. 使用游标卡尺（见 材料表）每天在同一时间测量耳廓厚度以获得准确的结果（图3A）。当有轻微堵塞时，停止游标卡尺继续向内夹紧，以防止组织对小鼠耳朵造成损害。保持位置固定并记录数据。
3. 从每个耳廓上的三个不同位置收集厚度（图3B）。将三个数据的平均值记录为有效值。以微米 （μm） 为单位评估耳朵肿胀±平均值的标准误差 （SEM）。

6.炎症肿胀程度的评估

1. 制备0.5%埃文斯蓝染料（见 材料表）溶液:在第11天用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释埃文斯蓝染料。始终穿上实验室外套和手套，因为埃文斯的蓝色染料对人体有轻微毒性。
2. 用固定器固定小鼠:打开固定器的盖子（见 材料表），握住鼠标尾巴，使鼠标的头部面向固定器，使鼠标本能地爬进固定器。盖上盖子，使鼠标尾巴从盖子上的孔中出来，并调整固定器的长度以露出整个鼠标尾巴。
3. 用酒精棉球反复擦拭尾巴或用温水浸泡30秒，轻轻捏住尾巴根部，填充和扩张两侧静脉。在冷光源的照射下进行注射。
4. 使用1毫米胰岛素针将埃文斯蓝色染料溶液缓慢注射到小鼠尾静脉中。等待15分钟，然后拍摄鼠标耳朵的照片。
   注意:将鼠标放在桌子上并轻轻握住它以暴露耳朵区域以进行图像采集。注射埃文斯蓝染料溶液并观察相应适应症后不久，使用颈椎脱位对小鼠实施安乐死。

在反复的DNFB刺激下，DNFB组小鼠耳朵表现出与ACD相当的明显临床症状，敏感区域表现出发红、干燥甚至侵蚀渗出的典型症状。然而，耳部给予纯水（对照组）或溶剂对照（载体组）没有产生类似的症状（图4）。

同时，在DNFB组中，与未经治疗的右耳相比，DNFB刺激后左耳的厚度显着增加（图5A），而对照组和载体组没有显着差异（图5B）。DNFB组小鼠的左耳在建模第11天注射Evans蓝色染料后明显变为深蓝色，与右耳在视觉上有所不同。然而，对照组和载体组中小鼠的左耳和右耳颜色大致相同（图5C）。

此外，还分析了小鼠的体重变化。DNFB或简单的载体刺激使小鼠体重增加略有减慢（图6A），但没有导致显着的体重减轻（图6B）。同时，在处死小鼠后立即分离脾脏。根据小鼠体重和脾脏重量计算脾脏指数;计算公式如下:

脾脏指数=脾脏重量（g）/体重（g）×100

结果表明，小鼠耳朵中重复DNFB刺激导致脾脏肿大（图6C）和脾脏指数升高（图6D），而载体组中小鼠的脾脏指数没有显着变化。证明在DNFB刺激下，DNFB组小鼠免疫应答功能亢进。

图1:ACD成型时间轴示意图。 箭头表示在相应时间执行的操作。涉及的相关操作包括剃须、敏化、耳廓测量、称重、拍照和埃文斯蓝染料应用。缩写:DNFB = 1-氟-2，4-二硝基苯。 请点击此处查看此图的大图。

图2:ACD模型建立的操作方法 。 （A）腹部剃须的操作。（B）腹部致敏刺激的操作。（C）操纵耳敏化刺激。 请点击此处查看此图的大图。

图3:耳肿胀的评估方法 。 （A）操纵小鼠的耳朵厚度测量。（B）小鼠耳厚测量部位。 请点击此处查看此图的大图。

图4:DNFB给药随时间对小鼠耳朵影响的代表性图片 。 （A）对照组。（二）车辆组。（C） DNFB集团。 请点击此处查看此图的大图。

图5:DNFB给药对小鼠耳肿胀的影响 。 （A）建模期间小鼠左耳和右耳之间的耳朵厚度差异。（B）建模结束时各组小鼠左耳和右耳厚度比较。（C）DNFB给药对小鼠耳血管通透性的影响。（n = 6. ***p < 0.001，右耳和左耳的比较;N.S. = 无显著性）。所有数据均表示为SEM±平均值。 使用未配对学生的t检验或邓内特检验的单因素方差分析来分析组间不同的治疗分析。 小于 0.05 的 p 值被认为具有统计学意义。 请点击此处查看此图的大图。

图6:DNFB给药对小鼠体重和脾脏指数的影响 。 （A）建模过程中各组小鼠的体重变化。（B）比较第11天每组小鼠的体重变化。（C）每组小鼠脾脏大小的比较。（D）小鼠组间脾脏指数比较。（n = 6.*p < 0.05，与对照组相比;N.S. = 无显著性）。所有数据均表示为SEM±平均值。 使用未配对学生的t检验或邓内特检验的单因素方差分析来分析组间不同的治疗分析。 小于 0.05 的 p 值被认为具有统计学意义。 请点击此处查看此图的大图。

作者报告这项工作没有利益冲突。