我们介绍一种利用氘代水（重水 D2O）探针结合受激拉曼散射（DO-SRS）显微技术直接可视化氨基酸调控的细胞代谢活性的实验方案，该技术与双光子激发荧光显微技术（2PEF）相整合。
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本文内容
摘要
摘要
必需芳香族氨基酸（AAAs）是细胞合成新生物量和维持正常生物学功能的基本组成单元。例如，充足的AAAs供应对于癌细胞维持其快速生长和分裂至关重要。因此，人们越来越需要一种高度特异、非侵入性且样品前处理最少的成像方法，以直接观察细胞如何利用AAAs进行代谢活动 原位. 此处，我们开发了一种光学成像平台，该平台结合了重水（D₂O）2O）探测结合受激拉曼散射（DO-SRS），并将DO-SRS与双光子激发荧光（2PEF）集成于同一显微镜系统，以直接可视化AAA调控下HeLa细胞的代谢活性。总体而言，DO-SRS平台可在单个HeLa细胞水平上实现新合成蛋白质和脂质的高空间分辨率与高特异性成像。此外，2PEF模态能够以无标记方式检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素的自发荧光信号。此处描述的成像系统同时兼容 体外 和 体内 模型，适用于多种实验。本方案的通用工作流程包括细胞培养、培养基制备、细胞同步化、细胞固定，以及使用DO-SRS和2PEF模式进行样本成像。
引言
苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Tryp）是重要的芳香族氨基酸（AAAs），可被人体吸收用于合成新的分子，以维持正常的生物学功能1。Phe 是合成蛋白质、黑色素和酪氨酸所必需的，而 Tryp 则是合成褪黑素、5-羟色胺和烟酸所必需的2,3。然而，过量摄入这些 AAAs 可以上调雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，抑制 AMP 激活的蛋白激酶，并干扰线粒体代谢，从而共同改变大分子生物合成，导致在健康细胞中产生如活性氧（ROS）等恶性前体物质4,5,6。在过量 AAAs 调控下，对代谢动态变化进行直接可视化观察，对于理解 AAAs 在促进癌症发展以及健康细胞生长中的作用至关重要7,8,9。
传统的氨基酸分析（AAA）研究依赖于气相色谱法（GC）10。其他方法，如磁共振成像（MRI），空间分辨率有限，难以对生物....
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方案
1. 培养基制备
- 在含有50% D2O的杜贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中制备10 mL的对照组和过量芳香族氨基酸（AAAs）溶液。
- 对于对照培养基，取10 mg DMEM粉末与4.7 mL双蒸水（ddH2O）在15 mL锥形管中混合。DMEM粉末含有标准浓度的所有氨基酸。充分涡旋并颠倒混匀，确保溶液均匀。加入4.7 mL D2O、0.5 mL胎牛血清（5% FBS）和0.1 mL青霉素/链霉素（1%），再次充分涡旋并颠倒混匀，确保溶液完全混合。
- 对于15倍苯丙氨酸（Phe）处理组培养基，在15 mL锥形管中取10 mg DMEM粉末与4.7 mL ddH2O、0.5 mL FBS（5%）和0.1 mL青霉素/链霉素（1%）混合。充分涡旋并颠倒混匀，确保溶液均匀。向培养基中加入过量苯丙氨酸粉末，终浓度为924 mg/L。再次充分涡旋并颠倒混匀，确保溶液完全混合。
- 对于15倍色氨酸（Tryp）处理组培养基，在15 mL锥形管中取10 mg DMEM粉末与4.7 mL ddH2O、0.5 mL FBS（5%）和0.1 mL青霉素/链霉素（1%）混合。充分涡旋并颠倒混匀，确保溶液均匀。向培养基中加入过量色氨酸粉末，终浓度为224 mg/L。再次充分涡旋并颠倒混匀，确保溶液完全混合。
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结果
在含有50% D2O的细胞培养基中添加15倍浓度的过量芳香族氨基酸（AAAs），可在HeLa细胞中产生新合成脂质和蛋白质特有的C-D拉曼谱带（图2B）。此前的实验曾使用不同浓度（如2倍和5倍）进行，尽管相关数据未予展示，但15倍浓度产生的新合成脂质和蛋白质的C-D拉曼谱带最为明显。具体而言，在研究脂滴（LDs）时，我们发现15倍苯丙氨酸（Phe）和15倍色氨酸（Tryp）分别在2,143 cm-1和2,172 cm-1处诱导出新合成脂质和蛋白质的信号。随后采用去强化拉曼散射（DO-SRS）对单个细胞中C-D信号的空间分布进行成像（图3）。使用ImageJ对单个细胞的像素强度进行手动分割和计算，如图3A中白色虚线边框所示。对照组细胞显示出中等强度的C-D脂质和蛋白质谱带，而15倍Phe和15倍Tryp处理组则显示出更强的C-D脂质和蛋白质谱带。定量分析表明，过量AAAs可能使脂质合成上调10%-1.......
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讨论
DO-SRS 和 2PEF 成像已被用于研究多种体系中的代谢动态 离体 模型，包括果蝇和人类组织21,22,23,24,26,27,33本研究采用的成像技术结合了双偏振受激拉曼散射（DO-SRS）和双光子激发荧光（2PEF）显微技术，相较于其他分子特异性成像方法具有更快的成像速度，无需进行分子提取或使用细胞毒性试剂标记，且样品制备步骤极少。具体而言，DO-SRS显微技术使我们能够探测 从头合成 动物和细胞中的脂质生成与蛋白质合成及其代谢动态的可视化 原位23,
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披露
作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
感谢李雅娟博士和Anthony Fung提供的技术支持，以及Fraley实验室提供的细胞系。本研究得到了加州大学圣地亚哥分校（UCSD）的启动资金、美国国立卫生研究院（NIH）U54CA132378、NIH 5R01NS111039、NIH R21NS125395、NIHU54DK134301、NIHU54 HL165443以及Hellman Fellow奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 血清移液管 | Avantor（由 VWR） | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL 圆锥形离心管 | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% 甲醛，无甲醇 | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24孔板 | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm 注射器滤器， 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm滤光立方体 | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC适配器，用于LD OBIS 6激光远程电源供应 | Olympus | 为激光器供电 | |
| 带通滤光片 | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 欧姆终端器 | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC 电缆 | Thorlabs | 2249-C | 同轴电缆，BNC公头/公头 |
| 宽带介电镜 | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| 离心 | |||
| 聚光镜 | Olympus | ||
| 盖玻片 | 康宁 | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning® Square #1½ Cover Glass/p/2850-25 |
| 直流电源 | TopWard | 6302D | |
| 二向色镜支架 | Thorlabs | KM100CL | |
| 二甲基亚砜细胞培养试剂 | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-二甲基亚砜-cf |
| 杜尔贝科改良伊格尔’不含甲硫氨酸、苏氨酸和丙酮酸钠的 s 培养基 | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder 含碳酸氢钠，不含甲硫氨酸、苏氨酸和丙酮酸钠 |
| 杜尔贝科’改良型伊格尔’s 培养基 | 康宁 | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | 版本 1.53t 2022年8月24日 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| 重水（氘代水） | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| HeLa 细胞 | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| 血细胞计数板 | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| 高光密度带通滤光片 | Chroma Technology | ET890/220m | 滤除斯托克斯光束，透射泵浦光束 |
| HyClone 胎牛血清（FBS） | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone 胰蛋白酶 0.25% (1x) 溶液 | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| 集成的受激拉曼散射激光系统 | 应用物理 & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD 输出波长为 1031 nm、脉宽为 6 ps、重复频率为 80 MHz 的脉冲，用作斯托克斯光束。 532 nm 的倍频光束用于同步泵浦一台皮秒光学参量振荡器（OPO），以产生脉宽为五至六皮秒的锁模脉冲序列（OPO 的闲频光束被干涉滤光片阻断）。OPO 的输出波长可在 720–950 nm，作为泵浦光束。1031 nm的斯托克斯光束通过picoEMERALD内置的电光调制器（EOM）以8 MHz频率进行正弦调制，调制深度超过90%。泵浦光束与斯托克斯光束通过picoEMERALD内部的二向色镜实现空间重叠。泵浦脉冲与斯托克斯脉冲之间的时间重叠通过内置延迟装置实现，并利用显微镜下纯D2O的受激拉曼散射（SRS）信号进行优化。 |
| 倒置激光扫描显微镜 | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH 控制箱 | Olympus | 控制激光扫描显微镜 | |
| 运动镜架 | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 个低剖面六角调节器 |
| L-苯丙氨酸 | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-色氨酸 | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| 锁相放大器 | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| 长通二向色镜分光器 | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm 激光 BrightLine 单边激光平面二向色镜分光器 |
| MATLAB | MathWorks | 版本：R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| 显微镜载玻片 | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-0-03 |
| 显微成像软件 | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x，Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| 奥林巴斯 MPLN 50x | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/zh-cn/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA油浸式聚光镜 | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| 指甲油 | 湿润的荒野 | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| 起源 | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1×（Dulbecco 磷酸盐缓冲液） | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| 青霉素/链霉素 | 赛默飞世尔 - 吉布科 | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| 潜望镜组件 | Thorlabs | RS99 | 包含上部和下部组件， Ø1" 后部及夹紧叉 |
| picoEmerald 系统 | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| 带BNC连接器的屏蔽箱 | Pomona Electronics | 2902 | 带盖铝盒，BNC 母/母 |
| Si光电二极管探测器 | 自制 | N/A | DYI 系列 |
| 硅片 | |||
| 垫片 | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| 自发拉曼光谱 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| 受激拉曼散射显微技术 | 自制 | N/A | |
| 触控 面板控制器 | Olympus | 控制激光扫描显微镜的 X-Y 方向 | |
| 0.4% 台盼蓝 (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/培养基与试剂/p/000000000000181876/台盼蓝，0.4% 溶液" |
| 镊子 | Kaverme - 亚马逊 | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| 双光子激发荧光显微镜 | 自制 | N/A | |
| 称量纸 | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| 苏黎世仪器 LabOneQ 软件 | Zurich Instruments | 控制苏黎世锁相放大器 |
参考文献
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).
- Parthasarathy, A., et al.
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