我们描述了一种分离和培养人隐静脉内皮细胞（hSVECs）的方案。同时提供了详细的方法，用于施加剪切应力和拉伸力，以研究hSVECs中的机械应力。
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方法文章
人隐静脉内皮细胞的分离及其在可控剪切应力与拉伸条件下的暴露
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
冠状动脉旁路移植术（CABG）是一种用于重建缺血心肌血供的手术。尽管与动脉移植物相比，大隐静脉移植物的长期通畅率较低，但其仍被广泛用作CABG的血管通路。移植物动脉化过程中血流动力学应力的急剧增加会导致血管损伤，尤其是内皮损伤，这可能是大隐静脉移植物（SVG）通畅率低的原因之一。本文描述了人源大隐静脉内皮细胞（hSVECs）的分离、鉴定与扩增方法。通过胶原酶消化法分离的细胞呈现典型的铺路石样形态，并表达内皮细胞标志物CD31和VE-钙黏蛋白。为评估机械应力的影响，本研究采用相关方案分别研究剪切应力和牵张力这两种主要物理刺激对动脉化SVG的作用。将hSVECs培养于平行板流动腔中以产生剪切应力，细胞会沿流动方向排列，并上调KLF2、KLF4和NOS3的表达。此外，hSVECs也可培养于可伸展的硅胶膜上，以模拟静脉（低）和动脉（高）水平的牵张力。动脉水平的牵张力可相应地调节内皮细胞的F-肌动蛋白分布和一氧化氮（NO）的分泌。综上所述，我们提供了一种详细的hSVECs分离方法，可用于研究血流动力学机械应力对内皮细胞表型的影响。
引言
内皮细胞（EC）功能障碍是大隐静脉移植物失效的关键因素1,2,3,4持续增加的剪切应力和周期性拉伸可诱导人隐静脉内皮细胞（hSVECs）呈现促炎表型3,4,5,6其潜在的分子通路尚未被完全阐明，且目前尚无标准化的操作流程 体外 研究可利用这些努力在该领域获得新的见解。本文中，我们描述了一种简单的方法，用于分离、鉴定和扩增人源性小血管内皮细胞（hSVECs），并介绍如何将其暴露于不同水平的剪切应力和周期性拉伸，以模拟静脉和动脉的血流动力学条件。
人小静脉内皮细胞（hSVECs）通过胶原酶孵育法分离获得，可用于传代至第8代。与现有的其他方案相比，本方案对血管的操作更少7，从而减少了平滑肌细胞和成纤维细胞的污染。然而，该方法需要至少2 cm长的较大血管片段，以实现高效的内皮细胞提取。文献报道，大血管来源的内皮细....
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方案
大隐静脉的废弃段取自圣保罗大学医学院心脏病学研究所（InCor）接受主动脉冠状动脉旁路移植术的患者。所有个体均签署知情同意书，同意参与本研究，该研究已通过当地伦理委员会的审查和批准。
1. 人隐静脉内皮细胞（hSVECs）的原代分离、培养与鉴定
- 准备
- 高压灭菌一把直头或弯头镊子以及组织剪（7-8 cm）。
- 制备无菌明胶。将0.1 g（0.1% w/v）或3 g（3% w/v）猪皮明胶与100 mL超纯水混合，121 °C高压灭菌15 min，4 °C保存。使用前于37 °C温育使其液化，用于包被细胞培养皿和载玻片。
- 在超净工作台内制备无菌胶原酶（1 mg/mL）。用 PBS 稀释胶原酶，并使用 0.2 µm 滤器过滤除菌。
- 用0.1% w/v明胶在37 °C下孵育至少30分钟，包被一个60 mm细胞培养皿和一个8孔腔室载玻片。接种细胞前去除多余的明胶。
- 配制完全内皮细胞培养基：在内皮细胞生长基础培养基（EBM-2）中添加EGM2生长因子。
注意：EGM2 生长因子由文中所列公司以试剂盒形式提供 材料表. 公司未披露该因子的浓度。 - 配制2%和5%牛血清白蛋白（BSA）、4%多聚甲醛（PFA）以及0.1% Triton X-100溶液，均用磷....
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结果
通常在提取后3-4天可观察到贴壁的内皮细胞。人阴茎海绵体血管内皮细胞（hSVECs）最初形成细胞簇，并呈现典型的“鹅卵石”样形态（图1B）。这些细胞表达内皮细胞标志物CD31（图1C，D）和VE-钙黏蛋白（VE-cadherin）（图1D）。hSVECs可在未经包被处理的细胞培养皿中轻松传代培养，并可在体外培养中维持内皮细胞表型至第八代。
人小静脉内皮细胞（hSVECs）在剪切应力作用下培养时，会沿流动方向排列（图2A）。20 dyn/cm2的剪切应力作用72小时可诱导典型的机械敏感基因KLF2、KLF4和NOS3的表达，表明剪切刺激在hSVECs中具有有效性（图2B）12,.......
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讨论
大隐静脉节段应至少有2 cm，才能成功分离人小隐静脉内皮细胞（hSVECs）。过小的节段难以操作，且不易结扎血管两端以保留胶原酶溶液用于细胞分离。较小的管腔表面积无法获得足够数量的细胞以进行培养扩增。为最大限度降低非内皮细胞（non-ECs）污染的风险，整个操作过程中对大隐静脉节段的处理必须极为轻柔。将移液器尖端插入管腔表面以清除血液以及注入胶原酶溶液时，均需格外小心。酶溶液的孵育时间必须严格控制（不超过1小时），以减少非内皮细胞对培养物的污染。使用添加生长因子混合物的特异性内皮细胞培养基，对hSVEC的培养生长至关重要。在培养初期额外添加肝素，有助于减少静脉节段中残留的红细胞，并抑制平滑肌细胞增殖15。在将细胞传代用于实验或维持培养时，应确保接种细胞的融合度高于40%。内皮细胞需要一定的细胞间接触，以保证良好的增殖和存活。hSVECs可在未经包被（如明胶或纤连蛋白）的培养表面轻松培养。然而，在内皮细胞分离后的最初几天内进行表面包被，可增强内皮细胞的贴壁能力并提高收获量。hSVECs具有稳定的增殖速率，并可在连续传代至第八代时仍维持内皮细胞表型，且不表达间充质细胞标志物（如SM22和cal.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
JEK 获得圣保罗研究基金会 [FAPESP-INCT-20214/50889-7 和 2013/17368-0] 以及国家科学技术发展委员会-CNPq（INCT-465586/2014-7 和 309179/2013-0）资助项目的支持。AAM 获得圣保罗研究基金会（FAPESP 2015/11139-5）以及国家科学技术发展委员会-CNPq（Universal - 407911/2021-9）资助项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA 溶液 | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚双乳酸盐（DAPI） | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 25 mm 6孔等双轴加载站 | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8孔可拆卸小室载玻片 | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| 冰醋酸 | Millipore | 100063 | |
| 1 cm 厚丙烯酸板 | Plexiglass | ||
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab24590 | |
| 抗CD31 FITC抗体 | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| 抗VE-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling | 2500 | |
| I型胶原Bioflex培养板 | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| 牛血清白蛋白溶液 | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| 棉线缝合线 EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| 亲环素正向引物 | Thermo Fisher Scientific | 定制设计 | |
| 亲环素反向引物 | Thermo Fisher Scientific | 定制设计 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2基础培养基 | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots添加剂 | Lonza | CC4176 | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000张力系统 | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount水溶性封片介质 | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| 猪皮来源明胶 | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| 山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| 猪肠黏膜来源肝素钠 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi泵系统（泵 + 流体单元） | Ibidi | 10902 | |
| KLF2正向引物 | Thermo Fisher Scientific | 定制设计 | |
| KLF2反向引物 | Thermo Fisher Scientific | 定制设计 | |
| KLF4正向引物 | Thermo Fisher Scientific | 定制设计 | |
| KLF4反向引物 | Thermo Fisher Scientific | 定制设计 | |
| NOA 280一氧化氮分析仪 | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3正向引物 | Thermo Fisher Scientific | 定制设计 | |
| NOS3反向引物 | Thermo Fisher Scientific | 定制设计 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 灌注套装 15 cm，内径1.6 mm，红色，10 mL储液器 | Ibidi | 10962 | |
| 鬼笔环肽-Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| 鬼笔环肽-Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| 碘化钾 | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR Green PCR试剂盒 | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex平台 | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy微量试剂盒 | Quiagen | 74004 | |
| 载玻片（24 mm x 60 mm） | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| 亚硝酸钠 | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV 第一链合成系统 | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| 吐温X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 0.4% 台盼蓝染液 | Gibco | 15250-061 | |
| 产气荚膜梭菌来源II型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C6885 |
参考文献
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechani....
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