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基于卵黄抗体的流式微球阵列检测标准化

DOI：

10.3791/65123

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2023年5月19日

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1Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, 2Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia – Universidade Estadual do Amazonas/Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, 5Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种用于制备乳胶微球的方法，该微球可用于基于IgY抗体的抗原检测实验。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

免疫测定是检测多种分子靶标的重要方法。在目前可用的技术中，流式微球阵列法（cytometric bead assay）在近几十年来备受关注。仪器读取的每个微球均代表一次对被测分子间相互作用能力的分析事件。单次检测可读取数千次此类事件，从而确保了检测的高准确性和可重复性。该方法还可用于验证新的检测原料，例如用于疾病诊断的IgY抗体。这些抗体通过用目标抗原免疫鸡只，随后从其蛋黄中提取免疫球蛋白而获得；因此，这是一种无痛且高效的抗体获取方法。本文除提供一种高精度验证该检测中抗体识别能力的方法外，还介绍了抗体提取方法、抗体与乳胶微球最佳偶联条件的确定方法，以及检测灵敏度的评估方法。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在旨在诊断疾病的免疫测定技术中，流式微球阵列法（cytometric bead assay）已成为一种高度敏感且可靠的检测方法，因为它能够在单次检测中分析数千个微粒1。该技术除了具有高通量和可使用较小样本体积的优点外，还具备高度灵活性，能够同时检测多种分子，如细胞因子、黏附分子、抗体亚型以及蛋白质等2,3。

在这些检测方法的开发中使用了不同的颗粒，其中包括乳胶微球，这是一种高效且低成本的原料。这些微球表面可进行修饰，例如引入功能基团或蛋白质，从而实现特定分子的共价或非共价偶联3,4,5。

这些免疫测定使用抗原和抗体等组分来检测疾病标志物，通常需要来自小鼠、兔子和山羊等哺乳动物的抗体。这会引发伦理问题，因为哺乳动物免疫通常需要使用大量动物才能获得足够的产量，同时频繁的操作会导致动物遭受痛苦6,7。一种替代方案是使用从免疫鸡所产蛋的蛋黄中分离的IgY抗体，因为蛋黄中含有针对接种抗原的高浓度特异性抗体；在一年时间内，一只鸡产生的抗体产量相当于4.3只兔子的产量6,7。

因此，本实验方案的目的是提供一种利用乳胶微球通过流式细胞术评估鸡蛋黄中提取的IgY抗体的方法。为此，我们提出了一种基于乳胶微球的夹心式流式细胞微球免疫分析法的标准化方法。作为模型，我们使用了针对 恶性疟原虫 组氨酸富集蛋白II抗原（IgY-PfHRP2）。我们描述了一种抗体提取方法，讨论了将这些抗体与乳胶微球偶联时确定偶联浓度的关键步骤，并评估了该抗原的检测限。流式细胞术具有高准确性，加之乳胶微球成本低廉，使该技术适用于免疫分析工具（如抗体和抗原）的分析。该方法可用于多种不同目标物的检测。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. 从蛋黄中提取IgY

  1. 卵的消毒处理
    1. 将卵（新鲜产出或产出后不超过4天的 Gallus gallus Dekalb White 品系卵）浸入0.2%稀释的次氯酸钠溶液中，用流动水快速冲洗，然后轻轻擦干，以备后续使用或立即使用。
      注意：若不立即使用，请在4 °C下保存，最长可保存15天。
  2. 卵黄的分离
    1. 小心打破卵壳，使用卵黄分离器将卵黄与卵白分离。
    2. 用滤纸吸除多余的卵白。刺破卵黄，将其内容物收集至50 mL锥形管中。使用前于−20 °C至少保存24小时。
      注意：在这些实验中（数据未显示），观察到使用未经冷冻的卵黄会阻碍从卵黄脂质部分中分离免疫球蛋白。
  3. 卵黄的酸化处理
    1. 将储存的卵黄解冻，并以1:10的比例用1 mM PBS稀释。用1 N HCl将溶液pH调节至5，在4 °C下孵育6–24小时。
    2. 在3,000 × g下离心40分钟，收集上清液，并使用0.7 mm纤维素滤膜过滤。
  4. 辛酸沉淀脂质
    1. 将上清液的pH重新调节至5，在4 °C下持续搅拌30分钟，同时加入辛酸（初始浓度≥98%），使其终浓度达到8.7%。
      注意：上清液体积可能因步骤1.3.2中沉淀的脂质质量不同而有所变化。例如，对于过滤后获得的35 mL上清液，应加入3.107 mL辛酸。
    2. 在18,600 × g下离心15分钟，分离上清液与沉淀物质。
    3. 使用1 M NaOH将溶液pH重新调节至7.4，采用Bradford法测定抗体浓度8，并将抗体于−20 °C保存至使用时。
      注意：所获得的抗体浓度为1 µg/µL，通过12% SDS-PAGE凝胶验证。

2. IgY 抗体与乳胶微球结合的饱和曲线

  1. 将微珠与IgY抗体偶联
    1. 向21 µL 4% (w/v) 乳胶微珠中加入21 µL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC，初始浓度为367 mM）和21 µL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，初始浓度为50 mM），并用过滤后的10 mM PBS缓冲液定容至终体积2.1 mL。
      注意：PBS溶液的pH范围应在7.2至7.4之间，因为在本研究中观察到，使用超出此范围的溶液会导致偶联及其他步骤出现负面影响。
    2. 在22 °C下剧烈振荡孵育3小时。
    3. 将先前提取的捕获抗体IgY-PfHRP2（见步骤1.4.3）分别取4 µg、2 µg、1 µg、0.5 µg、0.25 µg、0.125 µg和0 µg，加入含有100 µL步骤2.1.1所述溶液（微珠终浓度为0.04%）的不同微量离心管中，并在与步骤2.1.2相同的条件下孵育16小时。
    4. 在15 °C下以857 × g离心5分钟，弃去上清液，然后使用离心和重悬循环，用500 µL过滤后的10 mM PBS缓冲液（微珠终浓度为0.008%）洗涤乳胶微珠两次。
      注意：离心力不得超过857 × g，因为在本研究中观察到，超过此速度会导致微珠发生形变，从而对检测结果产生不利影响。
  2. 封闭微珠
    1. 将样品重悬于1 mL封闭缓冲液（微珠终浓度为0.004%）（过滤后的10 mM PBS + 5%牛血清白蛋白BSA）中，并在与步骤2.1.2相同的条件下孵育2小时。
    2. 封闭完成后，按步骤2.1.4所述方法进行洗涤，并重悬于10 mM PBS缓冲液中。
  3. 与Alexa Fluor 488标记的抗鸡二抗孵育
    1. 按照步骤2.1.3的方法，向各微量离心管中加入100 µL荧光标记抗鸡抗体（2 mg/mL），用含0.5% BSA的10 mM PBS缓冲液按1:2,000稀释后使用。
    2. 在与步骤2.1.2相同的条件下孵育样品，本次需避光孵育30分钟。
    3. 按步骤2.1.4所述方法洗涤微珠，并用250 µL过滤后的10 mM PBS缓冲液（微珠终浓度为0.016%）重悬。按照第5节所述方法进行流式细胞仪检测。
      注意：根据获得的荧光百分比数据，观察荧光平台期的起始点（本研究中为1 µg）。建议在后续步骤中采用平台期的第二个点（本研究中为2 µg）（图1）。

IgY-anti-PfHRP2 结合曲线；Y轴：抗鸡 IgY 百分比；使用 Alexa Fluor 488 检测的实验。
图1：流式细胞术分析图，用于确定 IgY-PfHRP2 抗体与乳胶微球偶联的饱和点。 横轴表示抗体浓度，纵轴表示获得的荧光百分比。Kruskal-Wallis 检验，p < 0.0033。 请点击此处查看此图的放大版本。

基于乳胶微球的流式细胞术抗原检测方法

  1. 在确定IgY抗体对乳胶珠的饱和点后，根据步骤2.1.1再次进行珠子活化过程。
    1. 按照观察到的饱和浓度（如步骤2.1.3所述）将珠子偶联，并按照步骤2.1.2进行孵育。
      注：在使用IgY-PfHRP2抗体进行的实验中，每1 µL乳胶珠对应的饱和条件为2 µg。
  2. 按照步骤2.2对珠子进行封闭和洗涤。
  3. 与抗原孵育
    1. 为确定检测下限，将封闭后的珠子悬液各100 µL等分至若干管中，每管分别加入不同量的重组蛋白PfHRP2（1 µg/mL）（rPfHRP2，分别为10 µg、1 µg、0.1 µg、0.01 µg、0.001 µg、0.0001 µg和0 µg），每组设三个重复，用含0.5% BSA的10 mM PBS稀释。
      注：该重组蛋白由Sousa等人的研究工作开发9。
    2. 按照步骤2.1.2所述条件，将珠子悬液与rPfHRP2蛋白在37 °C孵育1小时。
    3. 按照步骤2.1.4所述进行洗涤，离心后弃去上清液。
  4. 与一抗孵育
    1. 向每个样品中加入2 µg针对rPfHRP2蛋白的小鼠IgG抗体，用含0.5% BSA的10 mM PBS稀释至终体积100 µL。按照步骤2.1.2所述条件孵育样品，最后一次离心后弃去上清液。
      注：该抗体由Sousa等人的研究工作开发9。
  5. 与二抗孵育
    1. 向每个样品中加入100 µL荧光标记抗小鼠抗体（2 mg/mL），用含0.5% BSA的10 mM PBS按1:2,000稀释。按照步骤2.1.2所述条件孵育，离心后将沉淀重悬于250 µL过滤后的10 mM PBS中（珠子终浓度为0.016%）。按照第5节所述方法进行检测。

4. 样品的流式细胞仪检测

  1. 流式细胞仪设置：将流式细胞仪的光学参数与计算机进行校准
    1. 打开计算机和流式细胞仪，等待数分钟，使设备与计算机建立连接。
    2. 点击计算机上安装的流式细胞仪软件并登录。在软件工作界面中，选择 细胞仪 | 启动 | 清洗模式 | SIT 液体。
      注意：在开始采集样本前，应在流式细胞仪启动过程中清除气泡和堵塞物。
  2. 质量控制
    1. 使用质量控制试剂检查光电倍增管的电压，并评估流式细胞仪的灵敏度。
    2. 将质量控制试剂和追踪微球加入一个 12 mm × 75 mm 带盖聚苯乙烯管中。
    3. 通过涡旋轻轻混匀该管。
  3. 悬浮微球的制备
    1. 为定义基线，向一个 12 mm × 75 mm 带盖聚苯乙烯管中加入 0.5 mL 稀释液（10 mM 过滤 PBS，pH 7）和三滴微球。使用前轻轻涡旋混匀。
    2. 在流式细胞仪软件工作界面中，选择 细胞仪 | CST，等待流式细胞仪从细胞仪软件界面断开并连接至 CS&T 界面。观察屏幕底部软件 状态栏 中出现的以下提示：细胞仪已断开。
    3. 取含有质量控制试剂的 12 mm × 75 mm 带盖聚苯乙烯管，将其连接至流式细胞仪探针。
  4. 流式细胞仪配置的验证
    1. 在 系统摘要 窗口中，确认流式细胞仪的配置适用于本实验。
  5. 性能检测的设置
    1. 选择与 CS&T 研究用微球批次相对应的设置微球 ID。
  6. 性能检测
    1. 将试管连接至流式细胞仪探针，点击 设置控制 窗口。选择 检查性能，然后点击 运行。
    2. 性能检测完成后，等待对话框弹出。执行以下操作之一：
      1. 如需查看 流式细胞仪性能 报告，点击 查看报告。
      2. 如需完成性能检测并返回工作区的设置界面，点击 完成。
      3. 在 系统摘要 | 流式细胞仪性能结果 中查看形态学和荧光灵敏度分析的最终结果，其状态应为 通过。
      4. 从流式细胞仪上取下试管。检查 系统摘要 窗口中显示的流式细胞仪性能结果。

5. 使用流式细胞术进行样品分析

  1. 登录流式细胞仪软件。
    1. 从流式细胞仪软件工作区中选择 流式细胞仪 | 清洁模式 | SIT 液体.
    2. 调整至软件工作区。
    3. 根据阴性对照颗粒（无荧光的微珠）的形态学和荧光特征定义设门策略。
    4. 为了确定细胞形态计量学，选择 点状图 图形 用于分析 FSC-A 参数使用 SSC-A (补充图 1A).
    5. 使用SSC确定单细胞 点图 图形 用于分析 SSC-H 在 y 轴上 SSC-W x轴补充图1B），并通过FSC确定单细胞 点状图 图形 用于分析 FSC-H 在 y 轴上 FSC-W x轴补充图1C).
    6. 进行荧光分析时，选择 FL1 点图图谱 使用 FCS-A使用一个12 mm × 75 mm带塞聚苯乙烯管，管内含有未标记样品以及先前用单色Alexa Fluor 488标记的样品补充图 1D、E).
  2. 通过流式细胞术获取样本。
    1. 使用含有先前标记样品的12 mm × 75 mm 带塞聚苯乙烯管。轻轻混匀管内物质，将试管连接至流式细胞仪探针，然后左键单击“Acquire”。
    2. 设置 功率 的 激光器，点击 参数，以及下方的选项中， 调整 的 FSC 的电压 至 182 V 以及 SSC 的电压 到 236 V. 设置阈值时，点击 流式细胞仪 | 阈值，以及下方的选项中， 调整 的 FSC 到 500 V.
    3. 设置分析门，以根据颗粒的大小和复杂性进行表征，并进行单细胞分析。
    4. 为消除自发荧光，分析仅含乳胶微球的无染料样品，并进行调整 电压 检测器的：在以下选项中， 调节 的 FL1（FITC）的电压 到 332 V.
    5. 在点图中从阴性点位置设置四边形格式的荧光分析门。
    6. 在完成形态测量和荧光分析的调整后，将设备设置为采集 50,000 个事件：在 采集，点击 记录.

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结果

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图2 提供了IgY抗体提取过程的图示说明 通过 酸化，随后使用辛酸进行分离图2).

显示离心步骤和使用辛酸进行抗体分离的蛋白质纯化示意图。
图 2：IgY 抗体提取步骤及利用辛酸进行分离的示意图。（A）卵黄分离，收集于锥形管中并冷冻。（B）卵黄稀释，pH 调整至 5。（C）溶液离心及上清液过滤。（D

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过降低pH值沉淀IgY抗体，随后使用辛酸进行脂质分离的方法，在不损失抗体功能性的前提下高效地分离了总抗体。本文提出的方法比Redwan等人11报道的方法更为简便且成本更低，后者同样采用了酸沉淀和辛酸处理，但其操作流程更为复杂且耗时。与目前常用的从蛋黄中分离IgY的方法相比，本方法也具有优势，例如聚乙二醇（PEG）沉淀法12,13、硫酸钠法14,15以及氯仿法16等，因为这些方法涉及使用有毒试剂或难以从样品中完全去除的试剂。在本研究中，使用辛酸进行脂质分离前后所提取的抗体样品的电泳图谱相似，并呈现相同的结果。然而，在使用辛酸分离后，抗体在一步操作中实现了浓缩，该步骤能高效去除脂质，同时对样品中污染性蛋白质的去除无任何不利影响。

将IgY抗体与乳胶微球偶联的...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明，对于本文的研究、署名及发表不存在任何潜在的利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会（FIOCRUZ）（"亚马逊州伊雷昂尼达斯和玛丽亚·迪亚斯研究所（ILMD/Fiocruz Amazônia）基础与应用健康研究卓越计划 - PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"）、亚马孙联邦大学（UFAM）生物技术研究生项目（PPGBIOTEC）、高等人员进修协调机构（CAPES）以及亚马孙州研究支持基金会（FAPEAM）提供的奖学金支持。图2 和图4 使用biorender.com制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
驴抗鸡 IgY（H+L）抗体，高度交叉吸附，CF 488A，产自驴Sigma-AldrichSAB4600031
鼠 IgG（H+L）抗体，F(ab′)2 片段Sigma-AldrichSAB4600388
BD FACSCanto IIBD BiosciencesBF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T 研究微球（CS&T 研究微球）BD Biosciences655050
BD FACSDiva 软件 7.0BD Biosciences655677
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液Bio-Rad#5000006
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA4503
辛酸Sigma-AldrichO3907
Centrifuge 5702 R 离心机EppendorfZ606936
氯化氢 37% 酸，分子级NEON02618 NEON
CML 乳胶微球，4% w/vInvitrogenC37253
Megafuge 8R 离心机Thermo ScientificTS-HM8R
N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐粉末（EDC）Sigma-AldrichE7750-1G
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）Sigma-Aldrich130672-25G
磷酸盐缓冲液Sigma-Aldrich1003335620
氢氧化钠Acs CientificaP.10.0594.024.00.27
次氯酸钠Acs CientificaR09211000
Thermo Mixer Heat/Cool 恒温混匀仪KASVIK80-120R

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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标签

IgY

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