基于卵黄抗体的流式微球阵列检测标准化

Juliane Corrêa Glória; Yury Oliveira Chaves; Adélia Marques de Figueiredo; Caio Coutinho de Souza; Eliza Raquel Duarte da Silva; Jeniffer Clorives Lopes Batista; Paulo Afonso Nogueira; Luis André Morais Mariúba

doi:10.3791/65123

方法文章

基于卵黄抗体的流式微球阵列检测标准化

DOI：

10.3791/65123

⸱

2023年5月19日

Juliane Corrêa Glória¹^,²^,³ , Yury Oliveira Chaves²^,³^,⁴ , Adélia Marques de Figueiredo¹ , Caio Coutinho de Souza² , Eliza Raquel Duarte da Silva² , Jeniffer Clorives Lopes Batista²^,⁵ , Paulo Afonso Nogueira²^,³^,⁵ , Luis André Morais Mariúba¹^,²^,³^,⁵

¹Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, ²Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), ³Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), ⁴Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia – Universidade Estadual do Amazonas/Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, ⁵Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种用于制备乳胶微球的方法，该微球可用于基于IgY抗体的抗原检测实验。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

免疫测定是检测多种分子靶标的重要方法。在目前可用的技术中，流式微球阵列法（cytometric bead assay）在近几十年来备受关注。仪器读取的每个微球均代表一次对被测分子间相互作用能力的分析事件。单次检测可读取数千次此类事件，从而确保了检测的高准确性和可重复性。该方法还可用于验证新的检测原料，例如用于疾病诊断的IgY抗体。这些抗体通过用目标抗原免疫鸡只，随后从其蛋黄中提取免疫球蛋白而获得；因此，这是一种无痛且高效的抗体获取方法。本文除提供一种高精度验证该检测中抗体识别能力的方法外，还介绍了抗体提取方法、抗体与乳胶微球最佳偶联条件的确定方法，以及检测灵敏度的评估方法。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在旨在诊断疾病的免疫测定技术中，流式微球阵列法（cytometric bead assay）已成为一种高度敏感且可靠的检测方法，因为它能够在单次检测中分析数千个微粒¹。该技术除了具有高通量和可使用较小样本体积的优点外，还具备高度灵活性，能够同时检测多种分子，如细胞因子、黏附分子、抗体亚型以及蛋白质等²^,³。

在这些检测方法的开发中使用了不同的颗粒，其中包括乳胶微球，这是一种高效且低成本的原料。这些微球表面可进行修饰，例如引入功能基团或蛋白质，从而实现特定分子的共价或非共价偶联³^,⁴^,⁵。

这些免疫测定使用抗原和抗体等组分来检测疾病标志物，通常需要来自小鼠、兔子和山羊等哺乳动物的抗体。这会引发伦理问题，因为哺乳动物免疫通常需要使用大量动物才能获得足够的产量，同时频繁的操作会导致动物遭受痛苦⁶^,⁷。一种替代方案是使用从....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. 从蛋黄中提取IgY

卵的消毒处理
1. 将卵（新鲜产出或产出后不超过4天的 Gallus gallus Dekalb White 品系卵）浸入0.2%稀释的次氯酸钠溶液中，用流动水快速冲洗，然后轻轻擦干，以备后续使用或立即使用。
  注意：若不立即使用，请在4 °C下保存，最长可保存15天。
卵黄的分离
1. 小心打破卵壳，使用卵黄分离器将卵黄与卵白分离。
2. 用滤纸吸除多余的卵白。刺破卵黄，将其内容物收集至50 mL锥形管中。使用前于−20 °C至少保存24小时。
  注意：在这些实验中（数据未显示），观察到使用未经冷冻的卵黄会阻碍从卵黄脂质部分中分离免疫球蛋白。
卵黄的酸化处理
1. 将储存的卵黄解冻，并以1:10的比例用1 mM PBS稀释。用1 N HCl将溶液pH调节至5，在4 °C下孵育6–24小时。
2. 在3,000 × g下离心40分钟，收集上清液，并使用0.7 mm纤维素滤膜过滤。
辛酸沉淀脂质

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图2 提供了IgY抗体提取过程的图示说明通过酸化，随后使用辛酸进行分离图2).

显示离心步骤和使用辛酸进行抗体分离的蛋白质纯化示意图。
图 2：IgY 抗体提取步骤及利用辛酸进行分离的示意图。（A）卵黄分离，收集于锥形管中并冷冻。（B）卵黄稀释，pH 调整至 5。（C）溶液离心及上清液过滤。（D

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过降低pH值沉淀IgY抗体，随后使用辛酸进行脂质分离的方法，在不损失抗体功能性的前提下高效地分离了总抗体。本文提出的方法比Redwan等人¹¹报道的方法更为简便且成本更低，后者同样采用了酸沉淀和辛酸处理，但其操作流程更为复杂且耗时。与目前常用的从蛋黄中分离IgY的方法相比，本方法也具有优势，例如聚乙二醇（PEG）沉淀法¹²^,¹³、硫酸钠法¹⁴^,¹⁵以及氯仿法¹⁶等，因为这些方法涉及使用有毒试剂或难以从样品中完全去除的试剂。在本研究中，使用辛酸进行脂质分离前后所提取的抗体样品的电泳图谱相似，并呈现相同的结果。然而，在使用辛酸分离后，抗体在一步操作中实现了浓缩，该步骤能高效去除脂质，同时对样品中污染性蛋白质的去除无任何不利影响。

将IgY抗体与乳胶微球偶联的.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明，对于本文的研究、署名及发表不存在任何潜在的利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会（FIOCRUZ）（"亚马逊州伊雷昂尼达斯和玛丽亚·迪亚斯研究所（ILMD/Fiocruz Amazônia）基础与应用健康研究卓越计划 - PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"）、亚马孙联邦大学（UFAM）生物技术研究生项目（PPGBIOTEC）、高等人员进修协调机构（CAPES）以及亚马孙州研究支持基金会（FAPEAM）提供的奖学金支持。图2 和图4 使用biorender.com制作。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
驴抗鸡 IgY（H+L）抗体，高度交叉吸附，CF 488A，产自驴	Sigma-Aldrich	SAB4600031
鼠 IgG（H+L）抗体，F(ab′)2 片段	Sigma-Aldrich	SAB4600388
BD FACSCanto II	BD Biosciences	BF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T 研究微球（CS&T 研究微球）	BD Biosciences	655050
BD FACSDiva 软件 7.0	BD Biosciences	655677
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液	Bio-Rad	#5000006
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4503
辛酸	Sigma-Aldrich	O3907
Centrifuge 5702 R 离心机	Eppendorf	Z606936
氯化氢 37% 酸，分子级	NEON	02618 NEON
CML 乳胶微球，4% w/v	Invitrogen	C37253
Megafuge 8R 离心机	Thermo Scientific	TS-HM8R
N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐粉末（EDC）	Sigma-Aldrich	E7750-1G
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）	Sigma-Aldrich	130672-25G
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	1003335620
氢氧化钠	Acs Cientifica	P.10.0594.024.00.27
次氯酸钠	Acs Cientifica	R09211000
Thermo Mixer Heat/Cool 恒温混匀仪	KASVI	K80-120R

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407(2019).
de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

基于卵黄抗体的流式微球阵列检测标准化

本文内容

摘要

摘要

引言

方案

结果

讨论

披露

致谢

材料

参考文献

重印与许可

标签

相关文章