反义寡核苷酸作为人细胞系中延长敲低核 lncRNA 的工具

摘要

为了分析 lncRNA 在时间依赖性过程（如染色体不稳定）中的功能，必须实现延长的敲低效应。为此，这里介绍了一种方案，该方案使用修饰的反义寡核苷酸在细胞系中实现 21 天的有效敲低。

摘要

长链非编码 RNA （lncRNAs） 在转录水平的基因表达中起关键调节作用。实验证据表明，很大一部分 lncRNA 优先在细胞核中积累。为了分析核 lncRNA 的功能，在细胞核内实现这些转录物的有效敲低非常重要。与使用 RNA 干扰（一种依赖于细胞质沉默机制的技术）相反，反义寡核苷酸 （ASO） 技术可以通过将 RNase H 募集到 RNA-DNA 双链体进行核 RNA 切割来实现 RNA 敲低。与使用 CRISPR-Cas 工具进行基因组工程不同，在基因组工程中，染色质状态可能会发生改变，而 ASO 允许在不修改基因组的情况下有效敲低核转录本。然而，ASO 介导的敲低的主要障碍之一是其短暂效应。为了研究 lncRNA 沉默的长期影响，需要长时间保持有效的敲低。在这项研究中，开发了一种方案来实现超过 21 天的敲低效果。目的是评估 lncRNA 敲低对相邻编码基因 RFC4 的顺式调节作用，这与染色体不稳定性有关，这种情况只能通过时间和细胞衰老观察到。使用了两种不同的人细胞系:PrEC（正常原代前列腺上皮细胞）和 HCT116（一种从结直肠癌中分离的上皮细胞系），在测定的细胞系中成功敲低。

引言

人类基因组的绝大多数被转录，从而产生各种各样的转录本，包括 lncRNA，其数量超过了人类转录组中注释编码基因的数量¹。LncRNA 是长度超过 200 个核苷酸的转录本，不编码蛋白质 ^2,3，最近检查了它们在细胞中的重要调节功能⁴。它们的功能已被证明取决于它们的亚细胞定位⁵，例如细胞核，其中很大一部分 lncRNA 积累并积极参与转录调节⁶ 和核结构维持⁷ ，以及其他生物过程 ^8,9,10。

对于核 lncRNA 的功能表征，必须使用能够在细胞核中诱导敲低 （KD） 的方法，而 ASO 是沉默核转录本的有力工具。一般来说，ASO 是长度为 ~20 个碱基对的单链 DNA 序列，通过 Watson-Crick 碱基对 ^11,12,13 与互补 RNA 结合，并且可以通过取决于其化学结构和修饰的机制来改变 RNA 的功能 ^13,14。ASO 化学修饰可分为 2 大类:骨架修饰和 2' 糖环修饰¹⁵，这两种修饰都旨在通过赋予对核酸酶的高抗性来提高稳定性，同时也增强预期的生物学效应^13,16。在骨架修饰中，磷酸酰胺吗啉代 （PMO）、硫代磷酸酰胺和吗啉键广泛用于干扰剪接^17,18 等目的，用作空间阻断剂¹⁹，但不诱导转录本降解。另一种主链修饰是硫代磷酸酯 （PS） 键，这是 ASO 中最常用的修饰之一。与前面提到的修饰相反，PS 键不会干扰 RNase H 募集^12,20，因此允许 RNA 敲低。然而，也有各种各样的 2' 糖环修饰²¹;然而，为了 RNA 敲低，诱导有效沉默效果的修饰包括锁核酸 （LNA） ^22、23 和 2'-O-甲基修饰²⁴。尽管与其他修饰相比，LNA 已被证明对敲低非常有效²⁵，但它们会在体内和体外诱导肝毒性²⁶ 和细胞凋亡诱导等不良影响 ²⁷。

为了敲低 RNA，前面提到的经过适当修饰的 ASO 可以募集 RNase H1 和 H2^20,28，这些酶被募集到 DNA-RNA 杂交体中并切割靶 RNA，释放 ASO¹³。然后，这种切割的 RNA 产物由 RNA 监测机制处理，导致 RNA 降解²⁹，而不修饰感兴趣的基因组区域，这与 CRISPR-Cas 系统等其他技术相反，在 CRISPR-Cas 系统中，染色质状态的修饰会产生不需要的生物学效应³⁰。尽管 ASO 技术具有优势，但在研究染色体不稳定性 （CIN） 等时间依赖性过程时，由于细胞分裂或 ASO 降解而导致的暂时沉默效应是一个需要克服的障碍³¹。

特别是，CIN 被定义为与正常细胞相比，染色体数量和结构的变化率增加³²，并且是由于有丝分裂期间染色体分离的错误引起的，导致随着时间的推移产生肿瘤内异质性的遗传改变³³。因此，不能仅通过找到非整倍体核型来评估 CIN。为了正确研究和评估细胞培养中的 CIN，监测细胞随时间的变化非常重要。为了研究 lncRNA KD 对 CIN 的影响，需要一种允许延长 KD 效应的方法。为此，在该方案中使用了 ASO，其中 lncRNA-RFC4 在人细胞系 HCT115 和 PrEC 中分别成功沉默 18 天和 21 天。该转录本是长度为 1.2 kb 的未表征 lncRNA，其基因组位置在 3 号染色体 （q27.3） 上。它与蛋白质编码基因 RFC4 相邻，RFC4 是与不同类型人类癌症中的 CIN 相关的基因 34,35,36。

方案

注意:本方案只能由具有实验室安全程序经验的实验室人员执行。在开始处理危险材料和设备之前，必须正确阅读本协议中使用的所有试剂和材料的安全数据表。阅读、理解并满足您所在机构的实验室安全手册中指示的整个方案中的所有安全要求至关重要。所有生物和化学废物的处置必须按照机构的废物管理和处置手册进行。如果不小心处理并按照安全的实验室实践，本协议中使用的材料和设备可能会造成严重伤害。始终遵循机构的安全实验室手册和安全程序。

1. ASO 的设计

1. 如下所述手动设计 ASO。
   1. 获取目标转录本的完整序列，并在 RNAfold WebServer， University of Vienna³⁷ （材料表）中进行分析，使用网站上的默认参数获得最小自由能 （MFE） 二级结构。
   2. 结果准备好后，转到 MFE plain structure drawing 并单击 View In Forna 在网站上打开 MFE 二级结构，软件将显示分析的转录本的预测二级结构。
   3. 从预测的 MFE 二级结构中，在 RNA 中选择一个长度为 20 bp 的区域，在设计寡核苷酸时避免使用 G 串（连续 3 个鸟嘌呤序列）。为了选择 ASO 的最佳目标区域，使用预测具有较低内部碱基配对概率的区域（图 1）。
   4. 从选定的 20 bp 区域，创建反向补体序列。手动创建反向补码或使用反向补码在线工具（材料表）。反向补体序列将是必须为实验合成的 ASO。
   5. 使用人类核苷酸爆炸 NCBI （blastn） 和 UCSC 基因组浏览器 （GRCh38/hg38） 分析 ASO 序列。确保 ASO 不显示与人类基因组中的其他转录本或其他基因组区域的同源性。
      注:ASO 合成和纯化由一家商业公司进行（材料表）。
2. 确保合成的寡核苷酸具有以下特性。
   1. 确保 PS 沿寡核苷酸³⁸ 的整个序列键合（图 2A）。确保 ASO 是嵌合的，5 个核苷酸位于 5' 和 3' 末端的两侧，带有用 2'-O-甲基修饰的糖环（图 2B）。
   2. 确保中间的 10 个核苷酸具有未修饰的糖环以支持 RNase H 结合（图 2C）。
   3. 要求该公司使用标准脱盐和反相 （RP） HPLC³⁹ 进行纯化。
   4. 订购冻干格式的 ASO 送货。
3. 将冻干的ASO溶解在不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中，最终浓度为200μM。储存在-20°C。
4. 通过将浓缩原液稀释至 20 μM 的浓度来制备 ASO 的工作溶液。使用 DPBS 制备稀释液。储存在 -20 °C。
   注意:在本研究中，设计了两种靶向 lncRNA-RFC4 的 ASO。为了优化转染和效率的 ASO 浓度，遵循 Zong 等人 ⁴⁰ 的方案。根据 Zong 的方案设计了两种 ASO 并进行了实验优化:ASO-lncRFC4 和 ASO-lncRFC4-2。优化后，选择一种靶向 lncRNA-RFC4 的有效 ASO-lncRFC4 用于延长敲低方案（补充图 1）。作为阳性对照，使用先前证实的靶向 lncRNA MALAT1⁸ 的有效 ASO:ASO-MALAT1。对于阴性对照，设计了一种靶向 大肠杆菌 lacZ 基因 ASO-lacZ （NCBI 登录号:FN297865） 的 ASO。

2. 细胞的制备

注:每次处理细胞系、溶液、材料或细胞培养作过程中使用的任何产品时，都应在细胞培养通风橱内工作。处理用于细胞培养的液体时，请始终使用经过灭菌的血清移液器或带有灭菌吸头的微量移液器。在整个协议期间，始终满足并遵守机构实验室安全手册中指示的所有安全要求。

1. 如下所述，为每种细胞系制备完整的细胞培养基。
   1. 对于 HCT116，用 10% 的胎牛血清 （FBS） 制备 McCoy's 5A 培养基。
   2. 对于 PrEC，使用前列腺上皮细胞生长试剂盒制备前列腺上皮细胞基础培养基。
2. 使用三个 100 mm 培养板（55 cm² 表面积）进行 KD 实验，每个要使用的寡核苷酸一个:靶向 lncRNA 的 ASO，用作阳性对照 （ASO-MALAT1） 的 ASO，用作阴性对照的 ASO （ASO-lacZ）。
3. 使用两个 35 mm 培养板（表面积 9 cm² ）作为细胞传代之间 KD 的检查点，其中一个将用 ASO-lncRFC4 的完全转染培养基转染，另一个将用 ASO-lacZ 的完全转染培养基转染。
   注:根据先前报道的基于脂质体的转染试剂（参见材料表）制造商的程序和方案^41,42 计划转染。
4. 在细胞培养皿中将细胞接种至 1 x 10⁴ 个细胞/cm² 的密度。在 37 °C 的培养箱中使用 5% CO₂ 在空气中孵育，直到细胞达到 50% 汇合（当 50% 的表面被细胞单层覆盖时）。汇合度为 50% 时，细胞即可直接用于该方案的转染。
   注:对于ASO-lncRFC4和ASO-lacZ的转染，接种一个100 mm培养皿和一个35 mm培养皿。对于ASO-MALAT1的转染，仅接种100 mm培养皿（图3A）。

3. 转染

1. 在程序开始前将还原血清培养基预热至 37 °C。
2. 要使用 ASO-lacZ 和 ASO-lncRFC4 进行转染，请按照以下步骤作。
   注:计划对表面积为 55 cm² 的细胞进行 ASO-lacZ 和 ASO-lncRFC4 转染;当使用不同的区域时，可以相应地调整体积。必须对在相同条件下使用的每个 ASO 执行此过程。
   1. 将 43.75 μL ASO （20 μM） 溶解在 15 mL 锥形离心管中的 1.4 mL 温热还原血清培养基中，在细胞培养罩内制备试管 1。
   2. 通过在 1.5 mL 不含 RNase 的微量离心管中混合 18.66 μL 脂质转染试剂与 1.4 mL 温热的还原血清培养基，在细胞培养通风橱内制备试管 2。
   3. 在室温下将管 1 和 2 放入细胞培养罩内孵育 10 分钟。
   4. 将试管 2 中包含的溶液（转染试剂 + 减血清）直接缓慢滴加到试管 1（ASO + 减血清）中，以避免试剂散布在试管表面。
   5. 将管 1 中包含的混合物在室温下在培养罩内孵育 20 分钟。
   6. 将温热的还原血清培养基加入到试管 1 中，最终体积为 8.75 mL。
      注:最终转染培养基含有浓度为 100 nM 的 ASO。
   7. 从含有待转染细胞的细胞培养皿中取出培养基，将 7.5 mL 转染培养基直接添加到 100 mm 培养板中，将 1 mL 转染培养基直接添加到细胞单层中的 35 mm 培养板中。轻轻摇动培养皿，确保培养基沿整个表面均匀分布。
   8. 在 37 °C 的培养箱中用 5% CO₂ 的空气孵育 6 小时。
   9. 在转染培养基中孵育 6 小时后，向 100 mm 培养板中的细胞中加入 7.5 mL 完全培养基，向 35 mm 培养板中的细胞中加入 1 mL 完全培养基。在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。
3. 对于用 ASO-MALAT1 转染，请按如下所述进行实验。
   注:计划对表面积为 55 cm² 的细胞进行 ASO-MALAT1 转染。
   1. 将 37.5 μL ASO （20 μM） 溶解在 15 mL 锥形离心管中的 1.2 mL 温热还原血清培养基中，在细胞培养通风橱内制备试管 1。
   2. 通过将 16 μL 脂质转染试剂与 1.2 mL 温热的还原血清培养基混合来制备试管 2。
   3. 在室温下将管 1 和 2 在细胞培养罩内孵育 10 分钟。
   4. 将试管 2 中包含的溶液（基于脂质的转染试剂 + 减毒血清）直接缓慢、逐滴地添加到试管 1（ASO + 减毒血清）中，以避免试剂散布在试管表面。
   5. 将管 1 中包含的混合物在室温下在培养罩内孵育 20 分钟。
   6. 将温热的还原血清培养基添加到试管 1 中，最终体积为 7.5 mL。最终的转染培养基含有浓度为 100 nM 的 ASO。
   7. 从含有待转染细胞的细胞培养皿中取出培养基，并将 7.5 mL 转染培养基直接滴加到细胞单层中，以确保培养基通过轻轻摇动培养皿沿整个表面均匀分布。
   8. 在 37 °C 下，在培养箱中使用 5% CO₂ 的空气溶液孵育 6 小时。
   9. 与转染培养基孵育 6 小时后，向细胞中加入 7.5 mL 完全培养基，并在 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中孵育。
4. 每 12-24 小时一次显微镜评估细胞，直到细胞准备好进行下一轮转染。
   注:接下来，当细胞达到 70% 的汇合度时，必须进行转染。如果需要，更换培养基，更换为完全培养基。
5. 当细胞在细胞培养皿中达到 70% 汇合时，重复该过程（步骤 3.1 至 3.4）并执行下一轮转染。
   注:第二次转染后，应每 12-24 小时对细胞进行一次显微镜评估。当细胞达到 80%-85% 的汇合度时，必须进行细胞收获和传代。如果需要，更换培养基，更换为完全培养基。

4. 细胞收获和传代

注:在每 2 轮转染后以及第 2^轮、第 4^{轮和第 6 轮转}染后进行细胞收获和传代。HCT116 细胞的平均收获时间为第 1 、 3 和 5^次转染后 6 天，而 PrEC 细胞的平均收获时间为第 1 、 3 和 5^次转染后 7 天。本实验步骤中使用的两种细胞系的转染时间点不同。对于 HCT116，分别在第一次转染后 3、6、9、12 和 15 天进行^{第 2 次}、第 3^次、第 4^次、第 5^次和第 6^次转染。对于 PrEC，分别在第一次转染后 3、7、10、14 和 18 天进行第 2^次、第 3^次、第 4^次、第 5^次和第 6 次转染。参考图 3 中的时间线检查转染、传代和收获的时间点。

1. 如下所述，在 100 mm 培养板中为 KD 实验进行细胞收获和传代。
   1. 当细胞达到 80%-85% 的汇合时，继续收获细胞并传代。
   2. 加热完全培养基并将溶液洗涤至 37 °C。 将解离试剂加热至室温。将解离试剂的中和溶液加热至室温。
      注:本实验步骤中使用的两种细胞系的洗涤溶液、解离试剂和中和溶液不同。用 PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤 HCT116 细胞，并用胰蛋白酶-EDTA 溶液解离。使用 HCT116 细胞的完全培养基中和解离试剂。对于 PrEC，使用 HEPES 缓冲盐水溶液作为洗涤溶液。胰蛋白酶-EDTA 用作解离试剂。为了中和解离试剂，使用胰蛋白酶中和溶液。
   3. 在培养罩内，从细胞培养皿中取出培养基，用 3 mL 洗涤液轻轻洗涤，然后丢弃洗涤液。重复此步骤 2 次。
   4. 根据细胞系向细胞单层中加入 2 mL 解离试剂，并在 37 °C 下孵育 3-5 分钟。每 2 分钟评估一次细胞，直到解离完成。
   5. 根据细胞系加入 2 mL 中和溶液，并将细胞悬液的全部体积从细胞培养皿转移到 15 mL 锥形离心管中。
   6. 对于 RNA 提取，取 500 μL 细胞悬液并将其转移到 1.5 mL 离心管中。将试管放在冰上，然后继续进行 RNA 提取和 RT-qPCR 的步骤 5.1。
   7. 在室温下以 120 x g 离心其余的细胞悬液 5 分钟，然后弃去上清液。
   8. 将细胞沉淀重悬于 2 mL 完全培养基中，并根据标准程序进行细胞计数。
   9. 对于核型分析，将细胞接种至密度为 1 x 10⁴ 个细胞/cm² 的细胞培养皿中直径为 35 mm（表面积为 9 cm²），在 37 °C 的培养箱中以 5% CO₂ 在空气中孵育 24 小时，然后根据标准程序进行核型分析。
   10. 为了在下一次细胞传代中继续 KD 实验，将细胞接种至密度为 1 x 10⁴ 个细胞/cm² 的直径为 100 mm 的新细胞培养皿中。这道菜将是实验的第 2 代。在 37 °C 的培养箱中使用 5% CO₂ 的空气孵育，直到细胞达到 50% 的汇合度。
       注:如果需要，可根据标准程序将剩余的细胞用于蛋白质提取和/或冷冻。
   11. 重复步骤 3.1 至 4.1.10 从第 2 代和第 3 代进行转染和收获。
2. 按照下一个程序在 35 mm 培养皿中进行 KD 实验的检查点的细胞收获。
   注:KD 实验中第一个检查点的收获在^{第 2 次} 和^{第 4 次} 转染程序后 2 天进行。
   1. 将完全培养基和洗涤溶液加热至 37 °C。 将解离试剂加热至室温。将解离试剂的中和溶液加热至室温。
   2. 在培养罩内，从细胞培养皿中取出培养基，用 0.5 mL 洗涤液轻轻洗涤，然后丢弃洗涤液。重复此步骤 2 次。
   3. 弃去洗涤液后，根据细胞系加入 0.5 mL 解离试剂，并在 37 °C 下孵育 3-5 分钟。每 2 分钟评估一次细胞，直到解离完成。
   4. 根据细胞系加入 0.5 mL 中和溶液，将细胞悬液的全部体积从细胞培养皿转移到 1.5 mL 微量离心管中，并将其置于冰上。
   5. 继续执行 RNA 提取和 qPCR 的步骤 5.1。

5. RNA 提取和 RT-PCR

1. 将细胞悬液在 4 °C 下以 200 x g 离心 2 分钟，然后弃去上清液。用 600 μL 冷 PBS （4 °C） 洗涤细胞沉淀。
2. 将细胞悬液在 4 °C 下以 200 x g 离心 2 分钟，然后弃去上清液。
   根据标准程序使用细胞沉淀进行 RNA 提取。
3. 根据实验室遵循的标准程序对纯化的 RNA 进行 DNase 处理。在暂停点，将纯化的 RNA 在 -80 °C 下长时间储存。
4. 使用 RNA 对获得的每个 RNA 样品进行标准 cDNA 合成。在暂停点，将 cDNA 在 -20 °C 下长期储存。
5. 按照下面描述的步骤执行标准 qPCR。
   1. 对于 qPCR，寡核苷酸扩增以下转录本:感兴趣的 lncRNA、MALAT1 和作为内部对照的组成型表达基因（表 1）。对于该协议，表达 RPS28 用作内部对照。
   2. 使用 ASO-LacZ 样品中的 cDNA 进行 qPCR 反应，扩增内部对照、目标 lncRNA 和 MALAT1。此示例将用于标准化其他样本的表达式。
   3. 使用 ASO-lncRNA 样品中的 cDNA 进行 qPCR 反应以扩增内部对照 RPS28 和目标 lncRNA。
   4. 使用 ASO-MALAT1 样品中的 cDNA 进行 qPCR 反应以扩增内部对照 RPS28 和 MALAT1。遵循 表 2 中描述的反应设置和热循环仪条件。
   5. 通过对目标转录本的表达进行 ΔΔCt 对内部对照的表达进行归一化来分析 qPCR 数据，然后，根据 ASO-LacZ 样品中相同转录本的表达对目标转录本（lncRNA 或 MALAT1）的表达进行标准化，以获得转录本的相对表达水平。

结果

在本方案中，ASO 的使用在人类细胞系 PrEC 和 HCT116 中长时间适应核 lncRNA 的 KD。

当然，KD 实验在细胞系 PrEC 中成功了 21 天的实验，如图 4 所示。为了证实这一说法，除了分析细胞传代期间的表达（图 4 A-C）外，我们还分析了在第 1 代和第 2 代之间以及第 2 代和第 3 代之间建立的检查点;共 5 次（图 4-D）。每次收获细胞时都观察到 lncRNA-RFC4 的成功 KD，并且 lncRNA-RFC4 的表达在用 ASO-lncRFC4 处理的细胞中显着低于对照 ASO-lacZ 细胞。检查点收获的时间经过精心选择，以便在没有细胞转染的较长时间之间进行。该方案中使用的 ASO 的化学性质已被证明可赋予对核酸酶的抗性并保持 ASO 的稳定性超过 120 小时（5 天）

讨论

如前所述，lncRNA 在细胞中具有关键的调节功能;因此，这些转录本的失调可能与疾病有关。癌症就是这样一种以 lncRNA 失调为特征的疾病^43,44。在这种疾病中，已知 lncRNA 作为癌基因⁴⁵ 或肿瘤抑制因子⁴⁶ 发挥重要的调节作用。其中一些参与癌症标志物的发展，它们可以调节，例如增殖 47,48,49、临床进展、转移 ^{48、50、51、}<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 ml 离心管 - 15 ml 锥形管	Thermo Fisher Scientific	339650
Corning 100 mm TC 处理培养皿	Corning	430167	表面积：55 cm2
康宁 35 mm TC 处理培养皿	康宁	430165	表面积：9 cm2
DPBS，无钙、无镁	Thermo Fisher Scientific	14190144
胎牛血清 （FBS）	ATCC	30-2020
HCT 116 细胞系	ATCC	CCL-247
HEPES，1M 缓冲溶液	Thermo Fisher Scientific	15630122
Integrated DNA Technologies	NA	NA	https://www.idtdna.com/
Lipofectamine RNAiMAX 试剂	Thermo Fisher Scientific	13778150
McCoy's 5A 培养基	ATCC	30-2007
正常人原代前列腺上皮细胞 （HPrEC）	ATCC	PCS-440-010
核苷酸原始细胞 NCBI	NA	NA	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM 减血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985070
PBS （10X），pH 7.4	Thermo Fisher Scientific
前列腺上皮细胞基础培养基	ATCC	PCS-440-030
前列腺上皮细胞生长试剂盒	ATCC	PCS-440-040
反向补体在线工具	NA	NA	https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServer	NA	NA	http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
不含 RNase 的微量离心管，1.5 mL	Thermo Fisher Scientific	AM12400
TrypLE Express 酶 （1X），无酚红	Thermo Fisher Scientific	12604013	胰蛋白酶-EDTA 溶液
胰蛋白酶中和溶液	ATCC	PCS-999-004
用于原代细胞的胰蛋白酶-EDTA	ATCC	PCS-999-003
UCSC 基因组浏览器，人 （GRCh38/hg38）	NA	NA	https://genome.ucsc.edu/