本文展示了一种构建三维肿瘤球体的标准化方法。同时介绍了一种利用自动化成像系统对球体进行观察及基于图像的深度学习分析的策略。
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本文内容
摘要
摘要
近几十年来，除了单层培养的细胞外，三维肿瘤球体也被开发为一种潜在的强大工具，用于评估抗癌药物。然而，传统的培养方法无法在三维层面上以均一的方式操控肿瘤球体。为解决这一局限性，本文介绍了一种构建大小均一的肿瘤球体的简便且有效的方法。此外，我们还描述了一种基于人工智能分析软件的图像分析方法，该方法能够扫描整块培养板并获取三维球体的数据。我们研究了多个参数。通过采用标准化的肿瘤球体构建方法以及高通量成像与分析系统，可显著提高在三维球体上进行药物测试的有效性和准确性。
引言
癌症是人类最恐惧的疾病之一，主要因其高死亡率1近年来，随着新疗法的引入，癌症治疗的可能性已显著增加2,3,4,5二维（2D）和三维（3D） 体外 模型被用于在实验室环境中研究癌症。然而，二维模型无法即时且准确地评估所有能够指示抗肿瘤敏感性的重要参数；因此，它们无法充分模拟 体内 药物治疗测试中的相互作用6.
自2020年以来，全球三维（3D）培养市场得到显著推动。根据纳斯达克OMX的一份报告，到2025年底，全球3D细胞培养市场的价值将超过27亿美元。与二维（2D）培养方法相比，3D细胞培养具有诸多优势特性，不仅可在增殖和分化方面进行优化，还可实现长期存活7,8通过这些方法， 体内 可以模拟细胞微环境，以获得更准确的肿瘤特征描述以及代谢谱型，从而更深入地理解基因组和蛋白质的改变。因此，三维检测系统应被纳入主流药物研发流程，特别是针对新型抗肿瘤药物的筛选与评价。....
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方案
1. 类球体构建
- 培养板的防粘附处理
- 将100 µL防粘附试剂加入48孔U型底培养板的每个孔中，静置10分钟。10分钟后吸除包被试剂，并用无菌PBS洗涤两次。
- 将培养板置于培养箱中（37 °C，含5% CO2的湿润空气中）备用。
- 细胞准备、收集与计数
- 使用适用于目标细胞的培养基在细胞培养瓶中进行细胞培养（补充表2）。例如，NCI-H23和CT-26细胞使用RPMI 1640培养基，HT-29细胞使用McCoy's 5A培养基。上述两种培养基分别添加10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液（P/S）。
- 在增殖期间，将所有细胞维持于标准培养条件（37 °C，含5% CO2的湿润空气中）。以下步骤以NCI-H23细胞系为例进行说明。
- 用1×PBS洗涤T25培养瓶中的细胞两次，以去除培养基（建议选择处于对数生长期的细胞，并在细胞融合度达到80%–90%时进行传代）。
- 在37 °C、5% CO2的培养箱中，用1 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA处理扩增后的细胞1–2分钟。在显微镜下观察细胞形态（通常此时细胞呈圆形），随后终止胰酶消化反应。操作时，吸除T25培养瓶中的胰酶/EDTA悬液，并用....
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结果
图1A,B 展示了本研究中构建肿瘤球体的过程。我们首先将细胞接种于48孔U型底培养板中。此步骤与二维细胞培养所用方法几乎相同。将培养板置于普通培养箱中，并在孔周围保留水以维持湿度，使贴壁细胞开始通过自组装过程形成球体。在常规操作条件下，当使用特定培养基时，大多数类型的肿瘤球体在5天后即可完全形成（补充表 2）。我们使用数码显微镜在5天内检查了球状体构建的情况（图1D）。生长过程结束后，向每个孔中的单个球体加入凝胶包裹，从而形成一个 体内类细胞外基质（ECM）以包裹每个球状体。随后进行药物测试。由于我们采用了配备深度学习分析软件的高内涵成像系统（图1C），我们可以清楚地观察到单个球状体的生长（图1E）并获取合适的参数值，以确定药物治疗期间的特性，包括活力、直径和粗糙度。
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讨论
微环境在肿瘤生长中起着重要作用。它可能影响细胞外基质的提供、氧浓度梯度、营养供应以及机械相互作用，从而影响肿瘤细胞的基因表达、信号通路及多种功能19,20,21。在许多情况下，二维（2D）细胞培养无法产生此类效应，甚至可能产生相反的效果，从而影响对药物治疗的评估。然而，三维（3D）模型的出现解决了这一问题。例如，我们对AMG510在肺癌治疗体系中作用的评估即通过3D方法完成。我们构建了一种3D肿瘤类球体-细胞外基质（TSE）模型，将肿瘤类球体包埋于凝胶中，以监测AMG510对一种与肺癌相关的侵袭性细胞系的作用。AMG510是一种靶向G12C突变型KRAS的新抑制剂22，我们的研究发现证实了其有效性，即部分携带该突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者对此药物有响应。根据我们一系列实验数据与分析，可得出一些极具价值的结果：与2D培养条件相比，在3D类球体条件下，细胞对AMG510的敏感性显著增强，而在低氧条件下.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢我们实验室所有成员的重要贡献和建议。本研究得到了江苏省卫生健康委员会重点项目（K2019030）的支持。研究概念化由 C.W. 和 Z.C. 完成，方法学由 W.H. 和 M.L. 完成，调查研究由 W.H. 和 M.L. 完成，数据整理由 W.H.、Z.Z.、S.X. 和 M.L. 完成，初稿撰写由 Z.Z.、J.Z.、S.X.、W.H. 和 X.L. 完成，审稿与编辑由 Z.C. 完成，项目管理由 C.W. 和 Z.C. 完成，经费获取由 C.W. 完成。所有作者均已阅读并同意该手稿的发表版本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5-10 μL 移液器吸头 | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL 耐煮微型离心管 | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL 移液器吸头 | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL 离心管 | Nest | 601052 | |
| 200 μL 移液器吸头 | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D 凝胶 | Avatarget | MA02 | |
| 48 孔 U 型底板 | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL 离心管 | Nest | 602052 | |
| 刃天青（Alamar Blue） | Thermo | DAL1100 | |
| 防黏附冲洗液 | STEMCELL | #07010 | |
| 认证胎牛血清（FBS） | BI | 04-001-1ACS | |
| 去离子水 | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM（杜氏改良伊格尔培养基） | Gibco | 11965-092 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | sigma | D2650-100ML | |
| Excel 软件 | Microsoft Office | ||
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad Software | ||
| 高内涵成像仪及 SMART 系统 | Avatarget | 1-I01 | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（National Institutes of Health） | ||
| 胰岛素-转铁蛋白-硒-A 添加剂（100X） | Gibco | 51300-044 | |
| 封口膜（Parafilm） | Bemis | PM-996 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Solarbio | P1020 | |
| 青霉素/链霉素溶液 | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent 荧光酶标仪 | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 培养瓶 | JET Biofil | TCF012050 | |
| 胰蛋白酶，0.25%（1X） | Hyclone | SH30042.01 |
参考文献
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer ....
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重印与许可
