本文展示了一种构建三维肿瘤球体的标准化方法。同时介绍了一种利用自动化成像系统对球体进行观察及基于图像的深度学习分析的策略。
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本文内容
摘要
摘要
近几十年来，除了单层培养的细胞外，三维肿瘤球体也被开发为一种潜在的强大工具，用于评估抗癌药物。然而，传统的培养方法无法在三维层面上以均一的方式操控肿瘤球体。为解决这一局限性，本文介绍了一种构建大小均一的肿瘤球体的简便且有效的方法。此外，我们还描述了一种基于人工智能分析软件的图像分析方法，该方法能够扫描整块培养板并获取三维球体的数据。我们研究了多个参数。通过采用标准化的肿瘤球体构建方法以及高通量成像与分析系统，可显著提高在三维球体上进行药物测试的有效性和准确性。
引言
癌症是人类最恐惧的疾病之一，主要因其高死亡率1近年来，随着新疗法的引入，癌症治疗的可能性已显著增加2,3,4,5二维（2D）和三维（3D） 体外 模型被用于在实验室环境中研究癌症。然而，二维模型无法即时且准确地评估所有能够指示抗肿瘤敏感性的重要参数；因此，它们无法充分模拟 体内 药物治疗测试中的相互作用6.
自2020年以来，全球三维（3D）培养市场得到显著推动。根据纳斯达克OMX的一份报告，到2025年底，全球3D细胞培养市场的价值将超过27亿美元。与二维（2D）培养方法相比，3D细胞培养具有诸多优势特性，不仅可在增殖和分化方面进行优化，还可实现长期存活7,8通过这些方法， 体内 可以模拟细胞微环境，以获得更准确的肿瘤特征描述以及代谢谱型，从而更深入地理解基因组和蛋白质的改变。因此，三维检测系统应被纳入主流药物研发流程，特别是针对新型抗肿瘤药物的筛选与评价。永生化细胞系或原代细胞培养在三维球状结构中的生长具有 体内 肿瘤的特征，如缺氧、药物渗透性，以及细胞间的相互作用、应答和耐药性，可被视为进行研究的严格且具有代表性的模型 体外 药物筛选9,10,11.
然而，这些三维培养模型也存在一些问题，可能需要一段时间才能解决。尽管可以使用这些方案形成细胞球，但它们在某些细节上存在差异，例如培养时间或包埋凝胶12，因此所构建的细胞球难以在严格限定的尺寸范围内实现良好控制。细胞球的尺寸可能会影响活力检测和成像分析的一致性。此外，生长微环境和生长因子也各不相同，可能导致细胞分化差异，从而产生不同的形态特征13。目前迫切需要一种标准化、简单且成本效益高的方法，以构建尺寸可控的各类肿瘤模型。
从另一个角度来看，尽管已有均相检测法和高内涵成像方法用于评估形态、活力和生长速率，但由于文献中报道的多种原因，三维模型的高通量筛选仍然面临挑战，例如肿瘤类球体在位置、大小和形态上缺乏一致性14,15,16。
在本方案中，我们列出了构建三维肿瘤球体的每一步骤，并介绍了一种利用高通量、高内涵成像系统对球体进行观察和分析的方法，该系统具备自动对焦、自动成像及分析等多种优势特性。我们展示了该方法能够生成大小均一的三维肿瘤球体，适用于高通量成像分析。这些球体对抗癌药物处理具有高度敏感性，且可通过高内涵成像技术监测其形态学变化。综上所述，我们验证了该方法在生成用于药物评价的三维肿瘤模型方面的稳健性和可靠性。
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方案
1. 类球体构建
- 培养板的防粘附处理
- 将100 µL防粘附试剂加入48孔U型底培养板的每个孔中，静置10分钟。10分钟后吸除包被试剂，并用无菌PBS洗涤两次。
- 将培养板置于培养箱中（37 °C，含5% CO2的湿润空气中）备用。
- 细胞准备、收集与计数
- 使用适用于目标细胞的培养基在细胞培养瓶中进行细胞培养（补充表2）。例如，NCI-H23和CT-26细胞使用RPMI 1640培养基，HT-29细胞使用McCoy's 5A培养基。上述两种培养基分别添加10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液（P/S）。
- 在增殖期间，将所有细胞维持于标准培养条件（37 °C，含5% CO2的湿润空气中）。以下步骤以NCI-H23细胞系为例进行说明。
- 用1×PBS洗涤T25培养瓶中的细胞两次，以去除培养基（建议选择处于对数生长期的细胞，并在细胞融合度达到80%–90%时进行传代）。
- 在37 °C、5% CO2的培养箱中，用1 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA处理扩增后的细胞1–2分钟。在显微镜下观察细胞形态（通常此时细胞呈圆形），随后终止胰酶消化反应。操作时，吸除T25培养瓶中的胰酶/EDTA悬液，并用4 mL新鲜培养基洗涤细胞。
- 将全部悬液（5 mL）转移至15 mL离心管中。用1 mL新鲜培养基冲洗残留细胞并加入该离心管。在室温下以186.48 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，向细胞沉淀中加入10 mL新鲜培养基，轻轻吹打至细胞均匀悬浮。
- 吸取0.1 mL细胞悬液至新的离心管中，加入0.9 mL新鲜培养基，充分吹打混匀。
- 取10 µL细胞悬液进行细胞计数。重复此过程两到三次，取平均值。
- 根据步骤1.2.7中获得的细胞浓度，将悬液稀释至最终接种密度为50,000个细胞/mL。
- 细胞培养与球体形成
- 向48孔U型底培养板的每孔中加入200 µL细胞悬液。
- 用密封膜包裹培养板，在室温下以119.35 × g离心5分钟。
- 小心将培养板从离心机中取出，撕去保护膜。然后向孔周围水槽中加入5–8 mL无菌水（防止蒸发），并在37 °C培养5天。在此期间不得向水槽中添加或更换水分。
- 在接下来的5天内观察细胞聚集情况。
注：通常情况下，细胞在5天内开始聚集成团。然而，不同细胞类型和细胞密度可能导致球体形成速度加快或减慢。因此，必须每天通过以下三种方法之一观察细胞状态。第一种方法是透过培养板底部观察：当细胞尚未形成球体时，可见单层细胞贴附于孔底；当形成球体后，可在每个孔的U型底部观察到致密的三维结构。第二种方法是在显微镜下检查细胞：当细胞形成肿瘤球体时，其结构由外向内分为三层（增殖层、静止层和坏死核心），并呈现透明度梯度。第三种方法是观察培养基颜色变化，这在使用数码显微镜仍无法清晰辨认三层结构时尤为有用。当培养基颜色由紫红色变为黄色时，即可开始进行凝胶包埋操作。在细胞聚集期间不得更换培养基。
- 凝胶包埋
注：凝胶需储存于−20 °C以下温度环境中。特别应注意将凝胶远离冰箱门放置，以避免温度波动。此时凝胶处于冷冻状态。- 从−20 °C冰箱中取出冷冻凝胶，并在整个实验过程中将其置于冰盒上。
- 在显微镜下观察细胞球体。在开始凝胶包埋前，应再次使用数码显微镜检查球体状态。
- 小心吸除每孔中150 µL培养基。操作时培养板也应置于冰盒上。
- 通过预冷的移液枪头沿孔壁缓慢加入液态凝胶，同时移动枪头在孔内及周围旋转，使每个球体被凝胶包埋。等待5分钟后，若凝胶未均匀扩散，可用10 µL移液枪头轻轻吹打凝胶。每孔包含一个肿瘤球体、25 µL 3.5 mg/mL凝胶和50 µL完全培养基。对照组同样需加入75 µL培养基。
注：每孔含一个球体。 - 将培养板在37 °C孵育30分钟，直至水凝胶完全形成。在显微镜下确认凝胶化状态。
- 向每个样本孔中覆盖125 µL新鲜培养基。
- 继续培养球体7–10天。每组设置4–6个孔，至少选择其中三个孔用于后续分析。
注：若进行药物测试，应为同一样本设置两组。一组用于活力检测，另一组用于成像与分析。
2. 药物处理
- 根据制造商说明书溶解药物。使用DMSO配制100倍工作液。通过连续稀释法至少配制五种不同浓度的药物。此处以肺癌治疗药物AMG 510为例。其组成见补充表1。
- 使用0.1% DMSO作为阳性对照。
- 向每个孔中加入125 µL含药培养基，然后将培养板放回培养箱中（37 °C、含5% CO2的湿润空气环境）。此时，每个孔包含一个肿瘤类球体、25 µL浓度为3.5 mg/mL的凝胶以及175 µL培养基。对照组孔中含有200 µL培养基。
3. 类球体活力检测
- 根据制造商的说明书，使用阿玛蓝（Alamar Blue）检测试剂盒测定类球体的活力。在阿玛蓝处理后，使用微孔板光度计（在570 nm和600 nm处测定吸光度）测定活力。
- 分别在类球体包埋于凝胶后的第1天、第4天、第7天和第10天测定活力，或按指定时间点进行。
注意：使用阿玛蓝检测时，至少需要16小时的反应时间。因此，应在第0天、第3天、第6天和第9天的下午各加入20 µL阿玛蓝溶液。 - 从每个孔中吸取100 µL上清液转移至新的检测板中，并向培养板的每个孔中加入80 µL新鲜培养基。随后，再更换100 µL药物处理培养基。确保孔中无残留的阿玛蓝。
注意：每次测定活力时均需进行培养基更换，且用于成像分析组的药物处理培养基也需在同一天更换。
4. 药物测试中通过图像进行类球体观察和深度学习分析
- 成像
- 吸出 100 µL 成像前将培养基吸出。
- 将培养板置于载物台上。使用配备10倍物镜（先使用2倍物镜）的自动显微镜获取类球体的数字图像。该显微镜可自动对焦并居中定位这些类球体。
注意：自动对焦功能及其所使用的算法此前已由 Yazdanfar 等人报道。17. - 等待自动成像。每个球状体采集四幅图像，通过高内涵成像系统连接的软件生成并处理整合图像。
- 单击“图像块处理”按钮，并在软件中选择已整合的图像。
- 选择“U-NET模型”，并输入转换率（10倍物镜图像的转换率为3.966）。点击屏幕下方底部以开始图像处理。随后，将直径、周长和粗糙度数据保存至电子表格软件中。
- 计算多余周长指数（EPI）。EPI 是类球体周长与P0）以及等效周长（Pe），根据公式1计算。使用Image J测量类球体在焦平面的面积（S），然后根据公式2计算类球体的等效周长。
EPI = (Po− Pe)/Pe (公式 1)
(公式 2)
注意：类球体的周长由基于开发的U-NET模型的深度学习算法软件自动生成。 - 添加 100 µL 新鲜培养基加入药物后，将培养板放回培养箱（37 °C 在含5% CO₂的湿润空气中2).
- 类球体抑制
- 使用公式 3 计算肿瘤生长抑制率（TGI）。相对类球体体积（RTV）为终末体积与初始体积之比（公式 4）。类球体体积（V）由软件根据类球体直径输出，按公式 5 自动计算得出。
TGI = (RTV对照− RTV治疗)/RTV对照 × 100% （公式 3）
RTV = V末端/原始 (公式 4)
V = 4/3π(d/2)3 (公式 5)
注意：TGI 是相对于参考值获得的 在体 生长抑制，肿瘤重量被替换为RTV。RTV对照 对照组的相对类球体体积，RTV治疗 是药物测试组的相对类球体体积，V末端 为类球体在最后一天的体积，V原始 为类球体在培养第一天的体积，且 d 表示球状体的直径。
- 使用公式 3 计算肿瘤生长抑制率（TGI）。相对类球体体积（RTV）为终末体积与初始体积之比（公式 4）。类球体体积（V）由软件根据类球体直径输出，按公式 5 自动计算得出。
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结果
图1A,B 展示了本研究中构建肿瘤球体的过程。我们首先将细胞接种于48孔U型底培养板中。此步骤与二维细胞培养所用方法几乎相同。将培养板置于普通培养箱中，并在孔周围保留水以维持湿度，使贴壁细胞开始通过自组装过程形成球体。在常规操作条件下，当使用特定培养基时，大多数类型的肿瘤球体在5天后即可完全形成（补充表 2）。我们使用数码显微镜在5天内检查了球状体构建的情况（图1D）。生长过程结束后，向每个孔中的单个球体加入凝胶包裹，从而形成一个 体内类细胞外基质（ECM）以包裹每个球状体。随后进行药物测试。由于我们采用了配备深度学习分析软件的高内涵成像系统（图1C），我们可以清楚地观察到单个球状体的生长（图1E）并获取合适的参数值，以确定药物治疗期间的特性，包括活力、直径和粗糙度。
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讨论
微环境在肿瘤生长中起着重要作用。它可能影响细胞外基质的提供、氧浓度梯度、营养供应以及机械相互作用，从而影响肿瘤细胞的基因表达、信号通路及多种功能19,20,21。在许多情况下，二维（2D）细胞培养无法产生此类效应，甚至可能产生相反的效果，从而影响对药物治疗的评估。然而，三维（3D）模型的出现解决了这一问题。例如，我们对AMG510在肺癌治疗体系中作用的评估即通过3D方法完成。我们构建了一种3D肿瘤类球体-细胞外基质（TSE）模型，将肿瘤类球体包埋于凝胶中，以监测AMG510对一种与肺癌相关的侵袭性细胞系的作用。AMG510是一种靶向G12C突变型KRAS的新抑制剂22，我们的研究发现证实了其有效性，即部分携带该突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者对此药物有响应。根据我们一系列实验数据与分析，可得出一些极具价值的结果：与2D培养条件相比，在3D类球体条件下，细胞对AMG510的敏感性显著增强，而在低氧条件下...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢我们实验室所有成员的重要贡献和建议。本研究得到了江苏省卫生健康委员会重点项目（K2019030）的支持。研究概念化由 C.W. 和 Z.C. 完成，方法学由 W.H. 和 M.L. 完成，调查研究由 W.H. 和 M.L. 完成，数据整理由 W.H.、Z.Z.、S.X. 和 M.L. 完成，初稿撰写由 Z.Z.、J.Z.、S.X.、W.H. 和 X.L. 完成，审稿与编辑由 Z.C. 完成，项目管理由 C.W. 和 Z.C. 完成，经费获取由 C.W. 完成。所有作者均已阅读并同意该手稿的发表版本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5-10 μL 移液器吸头 | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL 耐煮微型离心管 | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL 移液器吸头 | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL 离心管 | Nest | 601052 | |
| 200 μL 移液器吸头 | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D 凝胶 | Avatarget | MA02 | |
| 48 孔 U 型底板 | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL 离心管 | Nest | 602052 | |
| 刃天青（Alamar Blue） | Thermo | DAL1100 | |
| 防黏附冲洗液 | STEMCELL | #07010 | |
| 认证胎牛血清（FBS） | BI | 04-001-1ACS | |
| 去离子水 | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM（杜氏改良伊格尔培养基） | Gibco | 11965-092 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | sigma | D2650-100ML | |
| Excel 软件 | Microsoft Office | ||
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad Software | ||
| 高内涵成像仪及 SMART 系统 | Avatarget | 1-I01 | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（National Institutes of Health） | ||
| 胰岛素-转铁蛋白-硒-A 添加剂（100X） | Gibco | 51300-044 | |
| 封口膜（Parafilm） | Bemis | PM-996 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Solarbio | P1020 | |
| 青霉素/链霉素溶液 | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent 荧光酶标仪 | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 培养瓶 | JET Biofil | TCF012050 | |
| 胰蛋白酶，0.25%（1X） | Hyclone | SH30042.01 |
参考文献
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