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利用体细胞基因组编辑小鼠模型 体内 显微注射与电穿孔

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DOI：

10.3791/65131

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2023年5月5日

 ,  , 
1Rosalind and Morris Goodman Cancer Research Institute, McGill University, 2Department of Human Genetics, McGill University, 3McGill Integrated Core for Animal Modeling (MICAM), McGill University

本文内容

摘要

本方案描述了显微注射及 体内 小鼠输卵管区域限制性CRISPR介导基因组编辑的电穿孔法

摘要

生殖系基因工程小鼠模型（G-GEMMs）为研究 体内 基因功能在发育、稳态及疾病中的作用。然而，品系的建立与维持所需的时间和成本较高。近年来，CRISPR介导的基因组编辑技术的进步使得可通过直接靶向特定细胞、组织或器官，从而构建体细胞基因工程小鼠模型（S-GEMMs）。

输卵管（在人类中称为输卵管）被认为是最常见的卵巢癌——高级别浆液性卵巢癌（HGSCs）的起源组织。HGSCs起始于输卵管远离子宫的远端区域，该区域毗邻卵巢，而非输卵管的近端部分。然而，传统的HGSC小鼠模型靶向整个输卵管，因此无法准确模拟人类疾病的真实情况。本文介绍了一种将DNA、RNA或核糖核蛋白（RNP）溶液显微注射至输卵管管腔内的方法 体内 通过电穿孔技术靶向输卵管特定区域的黏膜上皮细胞。该方法在癌症建模中具有多项优势：1）电穿孔的区域/组织/器官及具体部位具有高度可适应性；2）结合特异性启动子驱动Cas9表达时，可灵活靶向多种细胞类型（细胞可塑性高）；3）电穿孔细胞数量具有较高灵活性（相对较低频率）；4）无需特定小鼠品系（可实现免疫健全的疾病建模）；5）基因突变组合具有高度灵活性；6）结合Cre报告小鼠品系时，可实现对电穿孔细胞的示踪。因此，这一经济高效的方法能够有效模拟人类癌症的发生过程。

引言

输卵管（在小鼠中称为输卵管）是连接子宫与卵巢的管状结构。它在哺乳动物生殖过程中发挥关键作用，为体内受精和着床前发育提供必要的环境。1,2尽管其具有重要性，但关于它的功能和稳态机制仍知之甚少，部分原因在于相关研究工具的开发尚不充分。 体外 绕过与此器官相关的任何不孕问题的受精技术3然而，人们已经认识到，高级别浆液性卵巢癌（HGSC）是一种侵袭性卵巢癌组织学类型，约占卵巢癌病例的75%和相关死亡病例的85%，其癌前病变4局限于远端输卵管上皮5,6,7,8这表明，我们体内并非所有细胞对致癌损伤都具有同等的易感性，而是在每种组织或器官中仅特定的/易感的细胞才会成为癌症的起源细胞——这一特性称为细胞可塑性（cellular pliancy）。9沿此方向，已有研究表明，位于卵巢附近的输卵管远端的上皮细胞与其他部位的输卵管上皮细胞存在差异。10,11因此，传统的高级别浆液性癌（HGSC）小鼠模型靶向输卵管中的所有细胞，无法准确模拟人类疾病状况。在最近的一项研究中，我们采用了CRISPR介导的基因组编辑技术相结合的方法， 体内 输卵管电穿孔及基于Cre的谱系示踪成功诱导了高级别浆液性癌（HGSC） 通过在小鼠远端输卵管中突变四个肿瘤抑制基因12,13本文详细介绍了显微注射技术的逐步操作流程。 体内 电穿孔法靶向小鼠输卵管黏膜上皮

该方法具有多项优势，可进行调整以靶向其他组织或器官，包括器官实质14。尽管其他 体内 基因递送方法（如慢病毒和腺病毒系统）虽可实现类似的组织/器官特异性靶向，但使用不同尺寸的镊子型电极进行基于电穿孔的递送时，靶向区域更易于调节。根据DNA/RNA/核糖核蛋白（RNPs）的浓度、电穿孔参数以及电极尺寸，可调控电穿孔细胞的数量。此外，当与驱动Cas9表达的启动子联用时，该方法可靶向特定细胞类型，而无需完全依赖生殖系基因工程小鼠模型（G-GEMMs）。另外，与病毒递送系统不同，电穿孔可实现多个质粒同时递送至单个细胞，且对插入DNA片段的大小限制更小15. 在体 由于这种高灵活性，基因突变的筛选也可以相对容易地进行。此外，当该方法与Cre报告基因小鼠品系（如Tdtomato或Confetti）联合使用时，可对电穿孔的细胞进行追踪或示踪。16,17.

方案

动物饲养在带有滤膜盖的静态微隔离笼具中，笼具位于配备II级生物安全柜的专用房间内。所有动物实验均遵循机构指导原则，并经麦吉尔大学医学与健康科学学院动物护理委员会批准（实验动物使用许可号：#7843）。

1. 显微注射针的制备

  1. 使用显微拉针仪，按照以下程序将玻璃毛细管拉制成尖锐的尖端：P = 500，Heat = 576，PULL = 50，VEL = 80，DEL = 70。
  2. 在解剖显微镜下，使用一对锥形超细尖镊子剪断已拉制的毛细管尖端，以形成开口，如图1A、B所示。注意开口不宜过大，以免损伤输卵管并影响缓慢注射。

微电极比较示意图，显示两个标为 A 和 B 的尖锐金属尖端，比例尺单位为微米。
图 1：显微注射针的制备。（A,B）拉制后的毛细管具有一尖端（A），经剪切形成开口（B）。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 准备用于腹腔注射的麻醉剂

  1. 在手术当天配制过滤后的稀释型戊巴比妥溶液。戊巴比妥（2,2,2-三溴乙醇）储备液的浓度为每毫升1.6克，溶剂为叔戊醇，需通过剧烈搅拌配制，并避光保存。
  2. 在通风橱内，用体积分数为1.25%的等渗盐水将戊巴比妥储备液稀释至终浓度为20 mg/mL。涡旋混匀稀释后的戊巴比妥溶液，并通过0.22 µm无菌滤器过滤。避光保存。

3. 手术区域的准备

  1. 手术区域应为专用的无菌环境，最好使用洁净工作台或生物安全柜。根据需要摆放无菌手术器械、显微镜、显微操作仪和电穿孔仪。示例见图2。
  2. 启动加热垫/加热板并将其放置在一个清洁且配备齐全的笼子下方。该笼子将用于术后小鼠的饲养。
  3. 将无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS）倒入无菌培养皿中。使用一把洁净的剪刀将吸水纸剪成约1 cm × 1 cm的正方形小片，并将其放入1× PBS中浸泡。

4. 准备注射用溶液和针头

  1. 在手术当天配制注射溶液。将DNA/RNA/核糖核蛋白复合物（RNPs）与过滤后的台盼蓝混合，使每种成分的终浓度至少达到200 ng/µL，台盼蓝浓度为5%。注射前于室温下保存。
    ​注意：使用1 mL注射器吸取100%台盼蓝，并在使用前通过0.22 µm无菌滤膜过滤。
  2. 将拉制的毛细玻璃针（此后称为显微注射针）安装至由磁性底座固定的夹持式显微操作器上（装置如图2B所示）。
  3. 将2 µL注射溶液移取至无菌培养皿中。在显微镜下观察的同时，利用连接在显微操作器上的气压驱动注射器，缓慢将1–2 µL溶液吸入显微注射针内。避免产生气泡或将气泡吸入显微注射针中。

显微镜和显微注射装置；包括解剖显微镜、显微操作器、电极。
图 2：手术区域准备。（A）洁净工作台内的手术区域设置。（B）适用于右利手操作者的解剖显微镜与显微操作器装置。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 暴露雌性生殖道

  1. 通过腹腔注射方式给予6-8周龄雌性小鼠过滤稀释的Avertin（麻醉剂），剂量为0.25-0.5 mg/g，以实现麻醉。随后，皮下注射卡洛芬（预先镇痛剂），剂量为5 mg/kg。
    注意：其他可用作麻醉剂的替代品包括异氟烷或氯胺酮/赛拉嗪。
  2. 在洁净的加热垫/加热板上放置吸水纸。然后将麻醉后的小鼠仰卧置于该加热吸水纸上。向每只眼睛涂抹眼用润滑剂，以防止手术过程中角膜干燥。
    注意：应用手背轻触测试，确认加热垫/加热板温度略温，不可过热。
  3. 使用镊子轻夹麻醉小鼠的脚趾，检测其是否达到深度麻醉状态。去除拟切口部位背侧的毛发（位置见图3A），并用消毒剂擦拭裸露皮肤。
  4. 使用一对直头钝头镊夹住裸露皮肤，再用无菌锋利剪刀沿身体中线做约1 cm长的切口。用消毒剂清洁切口周围区域。
  5. 用无菌Adson镊夹住切口一侧的皮肤并提起。然后使用无菌弯齿镊，从切口中线开始，向侧方轻轻分离皮肤与体壁。
  6. 定位肾脏下方的脂肪垫。使用无菌直头钝头镊夹住脂肪垫正上方的体壁组织。使用无菌尖头解剖剪在体壁上做一个小切口，注意避开血管。
  7. 在继续用直头钝头镊夹住体壁的同时，将无菌钝头弯镊插入切口，扩大体壁上的切口。
  8. 用钝头弯镊夹住可见的脂肪垫，并将其拉出切口，以暴露卵巢、输卵管和子宫。
  9. 为保持生殖道持续暴露，使用无菌鳄嘴钳夹住脂肪垫，如图3B所示。

6. 体内 输卵管注射与电穿孔

  1. 将加热的吸水纸和麻醉后暴露生殖道的小鼠小心地放置在解剖显微镜的载物台上，使生殖道能够被观察到。显微镜下观察的示例见图3B。
  2. 调节显微操作仪，使带有溶液的注射针也能在显微镜下被观察到。
  3. 使用一对无菌锥形超细尖镊子，夹住待注射部位的输卵管并固定。待注射区域必须与显微注射针的方向对齐。
    注意：如有需要，可使用固定脂肪垫和生殖道的鳄鱼夹轻轻旋转或移动生殖道至最佳位置。
  4. 调节显微操作仪，用显微注射针刺穿输卵管，同时使用锥形超细尖镊子将输卵管轻轻推向针尖。轻微移动显微注射针以确认其已插入输卵管内。
    注意：应将显微注射针插入输卵管的直线段，而非盘曲部分的转折点，以避免多次穿刺及注射液泄漏。
  5. 在显微镜下观察蓝色溶液的流动及输卵管管腔的扩张情况，缓慢向输卵管内注射最多1 µL溶液。注意避免将气泡注入管腔。注入100%台盼蓝后的输卵管代表性图像见图3C、D。
  6. 将针头从输卵管中取出。用一块预先浸泡于无菌1x PBS（来自步骤3.3）中的吸水纸覆盖待处理区域。
  7. 使用电极镊子（1 mm、3 mm 或 5 mm，根据目标区域大小选择）夹住已预湿的纸片及目标区域，并将其轻轻拉离身体，然后使用脉冲发生器/电穿孔仪按以下参数进行电穿孔：30 V，3次脉冲，间隔1 s，脉冲时长50 ms，单极性。
    注意：电极间距应设置为能够夹住目标区域而不使输卵管变形的程度，推荐间距约为1 mm。
  8. 电穿孔完成后，移除吸水纸，将小鼠（下方垫有加热的吸水纸）放回加热垫上。松开鳄鱼夹，并小心地将暴露的生殖道推回体壁下方。重复第5节操作，暴露对侧的生殖道。
    注意：只要管腔内充满溶液，电穿孔的成功不受小鼠动情周期阶段的影响。
  9. 用预先浸泡于无菌1x PBS的吸水纸覆盖暴露的生殖道，防止其干燥；然后通过重复步骤4.2和4.3准备第二次注射用的显微注射针。
    注意：根据需要更换显微注射针。必要时可滴加无菌1x PBS以防止暴露组织干燥。
  10. 重复上述步骤，对对侧输卵管进行注射和电穿孔。
    ​注意：手术过程中及术后根据需要重新涂抹眼用润滑剂。
  11. 双侧输卵管完成电穿孔并复位至体壁下方后，缝合或钉合背部切口。若采用缝合，使用止血钳夹住丝线编织缝合针（3/8圆；规格：5-0；针长：18 mm；线长：75 cm），用一对无菌弯齿镊夹起切口一侧组织并提起，再使用止血钳操作缝线关闭伤口。
  12. 将小鼠转移至放置在加热垫/加热盘（来自步骤3.2）上的洁净笼盒中，并持续监测直至小鼠恢复活动。
  13. 术后连续3天，每天皮下注射5 mg/kg卡洛芬，并在接下来的10天内持续观察小鼠状态。

小鼠卵巢注射过程；示意图包含子宫、输卵管、夹钳；用于生育力研究。
图3女性生殖道暴露与显微注射 (A) Rosa-LSL-tdTomato 小鼠背部中线切口位置（黄色线条所示）。B) 女性生殖道暴露。使用无菌蚊式血管钳夹住脂肪垫，以固定生殖道并保持其暴露状态。C，D代表性图像 在体 输卵管注射。将显微注射针插入远端壶腹部（标记为AMP），在暴露输卵管管腔的同时，注入经过滤的100%台盼蓝溶液C）。输卵管解剖后的代表性图像，显示注入的台盼蓝溶液分布于输卵管远端和近端管腔内（D). 请点击此处以查看此图的放大版本。

结果

图1 和 图2 分别展示显微注射针的制备和手术区域的设置 体内 显微注射与小鼠输卵管电穿孔。手术过程中，通过在背部皮肤做切口暴露雌性生殖道。图3A) 和麻醉状态下 Rosa-LSLtdTomato（Gt(ROSA)26Sor）小鼠的体壁tm14(CAG-tdTomato)Hze/J)17 小鼠。使用止血钳夹住通道上方的脂肪垫，以保持其暴露并固定。图3B含 PCS2 CreNLS 质粒的注射溶液18 400 ng/µL 将一定浓度的物质注入输卵管盘曲部分的壶腹部（标记为AMP），并使其在输卵管腔内扩散。图3C，D）。尽管本研究中使用PCS2 CreNLS质粒获得了代表性结果，但所述方法可在注射溶液中灵活替换为其他DNA、RNA或核糖核蛋白复合物（RNP），用于小鼠输卵管内的CRISPR/Cas介导的基因编辑。随后，将1 mm或3 mm镊形电极置于输卵管远端两侧，使输卵管位于两电极之间，以实现基于电穿孔的递送。

术后4天采集输卵管，通过去除系膜以观察电穿孔的特异性。使用1 mm或3 mm镊形电极时，被TdTomato标记的靶向区域局限于输卵管远端上皮（图4A、D）。通过使用不同尺寸的电极可进一步控制该靶向区域的大小。使用3 mm镊形电极时，靶向区域覆盖了更大的壶腹部（AMP）范围（图4B、C），而使用1 mm镊形电极则仅靶向最远端的伞部（INF）（图4E、F）。采集的输卵管经固定后，采用蔗糖梯度处理，并利用冷冻切片机进行切片以进行详细分析。切片使用Hoescht 33342和Phalloidin分别对细胞核和细胞骨架进行复染，随后通过点扫描共聚焦显微镜成像。在靶向区域内，被电穿孔的细胞（由TdTomato标记）随机分布于未被电穿孔（TdTomato阴性）的细胞之间（图4G）。此外，电穿孔的细胞仅局限于黏膜上皮层，未在下方的间质层或肌层中发现（图4G、H）。最后，为确认CRISPR-Cas介导的基因编辑，可通过荧光激活细胞分选（FACS）分离TdTomato阳性细胞，用于DNA提取及MiSeq测序12。

使用TdTomato和Hoescht 33342标记的昆虫肠道明场显微镜观察；细胞结构分析
图4：成功验证 体内 术后4天对输卵管上皮细胞进行注射和电穿孔 (A-C使用3 mm镊形电极进行电穿孔。通过去除输卵管系膜使输卵管展开，以更清晰地观察电穿孔的特异性A）。通过TdTomato表达鉴定的电穿孔区域局限于远端输卵管，标记为AMP（B，C). (D-F) 使用1 mm镊型电极进行电穿孔。通过去除输卵管系膜使输卵管伸展，以更清晰地观察电穿孔的特异性D）。电穿孔区域被限定于输卵管最远端的漏斗部（标记为INF）E，F). (G，H) 输卵管远端在电穿孔 PCS2 CreNLS 质粒后第 4 天的横切面。电穿孔细胞用 TdTomato 标记（G）局限于上皮单层（H). 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本详细方案中的关键步骤包括将 DNA/RNA/RNP 溶液微量注射至输卵管管腔，以及对电穿孔强度和作用区域的控制。微量注射过程中若发生 DNA/RNA/RNP 溶液泄漏，可能导致非目标区域或非目标细胞被转染。为实现稳定且高效的电穿孔，建议将输卵管管腔充分充满溶液（图 3C,D）。这是因为电穿孔的作用区域主要由电极的尺寸和放置位置决定。电穿孔过弱会减少被转染的细胞数量，而过强则可能导致非目标细胞被转染或组织结构受损。通过调整 DNA/RNA/RNP 溶液的浓度或电穿孔参数，可调节被转染细胞的数量。然而，由于电穿孔过程中产生的高电压或热量可能损伤组织，因此这些参数应在实际用于活体或麻醉小鼠前预先进行测试。最后，鉴于该操作技术要求较高，建议在对活体或麻醉小鼠实施手术前，先在死亡小鼠上练习输卵管暴露和微量注射操作。

已知多种基因参与癌症的起始过程，因此模拟这一事件需要对多个基因进行多等位基因修饰。此外，也已明确并非所有细胞对致癌突变都具有相同的易感性9。因此，癌症建模需要特定的Cre小鼠品系，以实现对致癌损伤的精确控制。然而，这些小鼠品系的可获得性和特异性带来了多种挑战，包括在非靶组织中的效应以及致死性19。此外，传统的基因工程小鼠模型（G-GEMMs）维持成本高昂，且需要较长时间来建立小鼠品系。CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展以及向特定体细胞递送基因方法的改进，使我们能够克服上述问题。在本方案中，我们介绍一种用于体细胞基因组操作的DNA/RNA/RNP递送方法，可用于癌症建模，且无需依赖特定的小鼠品系12。通过将DNA/RNA/RNP溶液注射至管腔内，并采用不同尺寸的镊形电极进行基于电穿孔的递送，可靶向小鼠输卵管黏膜上皮的特定区域（图4A-F）。该方法在模拟起源于输卵管远端的高级别浆液性癌（HGSCs）起始过程中尤为有用。

本文介绍的显微注射和体内电穿孔方法在靶向具有管腔的组织/器官方面具有高度通用性。该方法也可用于靶向器官实质14。病毒递送方法（如慢病毒和腺病毒系统）也可用于类似目的。然而，与病毒递送方法相比，电穿孔具有以下优势：1）可将多个质粒递送至单个细胞；2）对插入片段大小无限制15；3）可方便地控制递送的区域和时间。此外，通过使用谱系特异性启动子，可进一步提高靶向特异性。而在病毒系统中，由于病毒包装能力的限制，这一操作有时难以实现。

与电穿孔技术的特性一致，经电穿孔处理的上皮细胞会随机地与健康的、未经编辑的细胞交错分布（图4G）。然而，这种基因修饰细胞与未修饰细胞共存的嵌合状态可能有利于研究癌症的起始过程，因为它模拟了在免疫功能完整的微环境中早期癌症发生的偶发性特征。通过调整DNA/RNA/RNP溶液的浓度和/或电穿孔参数，可以调节电穿孔细胞的频率。结合CRISPR-Cas介导的基因编辑技术与本方案，可方便地对多个基因进行筛选，并在靶基因中产生异质性的突变/等位基因组合模式；这对于建模具有大量基因组改变的癌症（如高级别浆液性癌，HGSCs）尤为有用20,21。此外，通过对癌症进展过程中靶基因的测序，可以在免疫功能完整的 小鼠中追踪肿瘤及转移灶的体内克隆演化过程12。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Katie Teng和Matthew J. Ford博士提供了用于获得代表性结果和优化实验方案的质粒。K.H.获得了魁北克健康研究基金会（Fonds de recherche du Québec - Santé, FRQS）博士奖学金、Donnor基金会、Delta Kappa Gamma世界奖学金、生殖与发育研究中心（CRRD）、Hugh E. Burke、Rolande & Marcel Gosselin以及Alexander McFee研究生奖学金的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 无菌滤器组件 LifeGeneSF0.22PES
1 mL 注射器Terumo Medical CorportationSS-01T
1 mm 镊子型电极BEX CO., LTDLF650P1
3 mm 镊子型电极BEX CO., LTDLF650P3
30G × 1/2 针头BD305106使用可注射麻醉剂或镇痛剂时，将针头连接至 1 mL 注射器。
阿登顿镊Fisher Scientific10-000-451
气压式注射器BDB302995连接至显微操作器；如图 2B 所示。
镇痛剂--卡洛芬，剂量：5 mg/kg。
消毒剂Cardinal HealthOMEL0000017Baxedin：70% 异丙醇中含 2% 氯己定。
Avertin（2,2,2-三溴乙醇）— 麻醉剂Sigma AldrichT48402-25G
夹式安装显微操作器AD InstrumentsMM-33
弯齿解剖镊Fisher ScientificNC0696845
解剖显微镜ZeissSteREO Discovery.V8复消色差 S，0.63X，工作距离 107 mm。顶部光源配备 KL 200 LED，图 2B 中标注为光源。
眼部润滑剂Alcon-Systane 软膏（润滑性眼用软膏）
玻璃毛细管针头Sutter Instrument Co.B100–50-10外径：1 mm，内径：0.5 mm，长度：10 cm
哈特曼止血钳Fisher Scientific50-822-711
加热垫/加热盘 --本实验方案使用 SnuggleSafe 宠物床微波加热垫。微波加热 2–5 分钟，并用戴着手套的手背测试温度。
显微操作器磁性支架AD InstrumentsMB-B用于在注射过程中保持夹式安装显微操作器的稳定与直立。
微型无损伤血管夹Fisher Scientific50-822-2303 cm
微量移液器拉制仪Sutter Instrument Co.P-97P-97 Flaming/Brown 型微量移液器拉制仪。所用程序：P = 500，Heat = 576，PULL = 50，VEL = 80，DEL = 70
培养皿Fisher Scientific263991也可使用经高压灭菌/无菌的玻璃培养皿。
磷酸盐缓冲液（PBS）Bio Basic Inc.PD8117将 10X PBS 用去离子水稀释至 1X。使用前进行高压灭菌。 
脉冲发生器/电穿孔仪BEX CO., LTDCUY21 EDIT II电穿孔参数：30 V，3 次脉冲，间隔 1 秒，脉冲时长 = 50 ms，单极性
Rosa-LSLtdTomato 小鼠The Jackson Laboratory7914Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J
尖头钝头解剖剪Fisher Scientific28251
尖头解剖剪Fisher ScientificSDI130
剃毛器--也可使用脱毛膏。
编织丝线缝合线Ethicon682G3/8 圆弧，规格：5-0，针长：18 mm，线长：75 cm。也可使用皮肤缝合钉。
细尖超精细镊 Fisher Scientific12-000-122
薄型吸水纸Kimberly-Clark Professional34120Kimwipes
台盼蓝STEMCELL Technologies7050使用前经 0.22 µm 无菌滤器过滤，用于显微注射。

参考文献

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体细胞小鼠模型基因组编辑体内电穿孔显微注射技术输卵管靶向CRISPR基因组编辑输卵管癌电穿孔细胞示踪FACS分选肿瘤起始建模
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