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方法文章

CLON-G 延长中性粒细胞寿命及其 体外 自发死亡检测实验

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DOI：

10.3791/65132

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2023年5月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Experimental Hematology, National Clinical Research Center for Blood Diseases, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Tianjin Institutes of Health Science, 3Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 4Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Tianjin Medical University, 5Joint Program in Transfusion Medicine, Department of Pathology, Harvard Medical School; Division of Blood Bank, Department of Laboratory Medicine, The Stem Cell Program, Boston Children's Hospital, Dana-Farber /Harvard Cancer Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案详细介绍了制备CLON-G以延长中性粒细胞寿命至超过5天的方法，并提供了利用流式细胞术和共聚焦荧光显微镜评估中性粒细胞死亡的可靠操作流程。

摘要

中性粒细胞的平均寿命少于24小时，这限制了对中性粒细胞的基础研究及其相关应用。我们之前的研究表明，多种信号通路可介导中性粒细胞的自发性死亡。通过同时靶向这些通路——即半胱天冬酶抑制、溶酶体膜通透性抑制、氧化应激抑制、坏死性凋亡抑制以及添加粒细胞集落刺激因子（CLON-G），开发出一种联合干预方案，可在不显著影响中性粒细胞功能的前提下，将其寿命延长至5天以上。同时，我们也建立了一种可靠且稳定的评估与评价中性粒细胞死亡的方法。本研究显示，CLON-G能够延长中性粒细胞的寿命 体外 超过5天，并通过流式细胞术（FACS）和共聚焦荧光显微镜展示中性粒细胞寿命的延长。本报告介绍了CLON-G的制备步骤，并展示了一种 体外 中性粒细胞自发死亡检测法，可用于中性粒细胞的研究以及后续对中性粒细胞死亡的探究，从而为中性粒细胞研究领域提供可靠的资源。

引言

中性粒细胞以其丰富的细胞质颗粒、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶、抗菌酶类以及多种细胞器而著称，能够抵御入侵的微生物；此外，中性粒细胞具有高度运动性，是最早被募集到炎症部位的细胞，因此构成了先天免疫系统的首道防线1,2。粒细胞输注疗法因此成为治疗中性粒细胞减少症相关感染的一种有前景的临床手段，可暂时增强中性粒细胞的免疫功能3,4,5。最近的研究明确表明，中性粒细胞在多种生理病理过程中也发挥着多面效应器的作用6。中性粒细胞的平均寿命不足24小时，因此，由于稳定基因操作和长期保存方面的限制，中性粒细胞的基础研究及其应用面临巨大挑战7,8,9,10,11。目前已有一些细胞系可在一定程度上模拟中性粒细胞的部分功能，例如HL-60、PLB-985、NB4、Kasumi-1以及诱导性多能干细胞12。这些细胞系可实现有效的基因编辑和冷冻保存；然而，它们与原代中性粒细胞仍存在显著差异，因此无法真实再现中性粒细胞的功能13。因此，该领域的大多数研究仍依赖于新鲜分离的原代中性粒细胞。目前研究中仍需依赖构建昂贵且耗时的条件性基因敲除小鼠模型来探究特定基因在中性粒细胞中的功能，但尚无可用的人源模型。

在致力于探索中性粒细胞死亡过程中所涉及的异质性事件及其调控的多种通路之后14,15一种新疗法，称为CLON-G（caspases-溶酶体膜通透化-氧化应激-坏死性凋亡抑制联合粒细胞集落刺激因子）最近被报道16CLON-G 包含 Q-VD-oph（喹啉基-缬氨酰-氧-甲基天冬氨酰-[-2,6-二氟苯氧基]-甲基酮）、Hsp70（热休克蛋白 70）、DFO（去铁胺）、NAC（N-乙酰半胱氨酸）、Nec-1s（坏死抑制素-1s）和 G-CSF（粒细胞集落刺激因子）。中性粒细胞的自发性死亡由多种通路介导，包括凋亡、坏死性凋亡和焦亡。Q-VD-oph 作为一种广谱caspase抑制剂，通过靶向caspase 1、caspase 3、caspase 8和caspase 9，抑制中性粒细胞的凋亡。17中性粒细胞坏死性凋亡依赖于受体相互作用蛋白激酶-1（RIPK1）和混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）参与的信号通路18作为一种RIPK1抑制剂，Nec-1s可抑制中性粒细胞的坏死性凋亡。Hsp70和DFO可抑制溶酶体膜通透化（LMP），从而诱导中性粒细胞凋亡。19 和细胞焦亡20. 活性氧（ROS）通过介导溶酶体膜通透化（LMP）在中性粒细胞死亡中发挥关键作用19 和细胞凋亡21 并通过抑制生存信号22作为一种能够减少活性氧（ROS）积累的抗氧化剂，NAC 可延缓中性粒细胞死亡；作为一种生长因子，G-CSF 能激活中性粒细胞的存活信号并抑制钙蛋白酶介导的凋亡。23,24通过同时靶向调控中性粒细胞的多种自发性死亡通路，可在不损害其功能的前提下，有效将中性粒细胞的寿命延长至5天以上。CLON-G处理拓展了中性粒细胞保存、运输及基因操作的可能性，有助于加快中性粒细胞相关领域的研究进展。同时，基于对中性粒细胞死亡机制的认识，目前批准的细胞死亡检测方案可能对中性粒细胞造成意外损伤14，因此这些方案已优化得更适用于中性粒细胞研究。本报告提供了使用CLON-G进行中性粒细胞培养的详细方案以及一个 体外 使用流式细胞术和荧光成像检测小鼠中性粒细胞的细胞死亡。CLON-G 对小鼠和人类中性粒细胞均有效；但本方案以小鼠样本为例，以简化操作流程。NAC 的浓度在小鼠中性粒细胞中为 1 mM，在人类中性粒细胞中为 10 µM。Hsp70 具有物种特异性，因此应根据中性粒细胞的来源选择相应的 Hsp70。本方案中，中性粒细胞来源于外周血或骨髓，以及其分离方法，均不影响实验结果。

本研究中，从中性粒细胞中分离小鼠骨髓以获得足够数量的中性粒细胞用于实验，因为从小鼠骨髓中可获得约 1 × 107–1.5 × 107 个中性粒细胞，而从一只 8–12 周龄 C57BL/6 小鼠（无论性别）的外周血中仅能分离出约 1 × 106 个中性粒细胞。采用梯度离心法以避免流式细胞术分选（FACS）或磁珠分选（MACS）过程中机械刺激可能造成的损伤和活化。

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方案

波士顿儿童医院和实验血液学国家重点实验室（SKLEH）动物护理与使用委员会批准并监督了所有实验程序。 图1 展示了使用CLON-G进行中性粒细胞培养的流程图 体外 死亡率检测

1. 使用 CLON-G 延长中性粒细胞寿命

注意：所有提及的操作和材料必须保持无菌。确保所有溶液充分混匀并均匀分布。

  1. CLON-G 组分的保存
    1. 将 50 mg 的 Q-VD-oph（参见材料表）溶于 973.7 µL 二甲基亚砜（DMSO）中，终浓度为 100 mM，用移液器反复吹打直至溶液澄清。每管分装 50 µL，于 −20 °C 保存。
      警告：DMSO 为有害化学液体，操作时需穿戴实验服、护目镜和口罩，避免皮肤接触、眼睛接触及吸入。
    2. 在 4 °C 下解冻 Hsp70（参见材料表），短暂离心管内液体。在冰上每管分装 1 µL Hsp70，于 −80 °C 保存。
      注意：Hsp70 为蛋白质，需超低温保存以维持其稳定性。避免反复冻融。
    3. 将 1 mg 的 DFO（参见材料表）溶于 7.61 mL RPMI 1640 培养基中，配制成 200 µM 的储存液。每管分装 500 µL，于 −20 °C 保存。
    4. 在 15 mL 离心管中将 0.1 g NAC（参见材料表）溶于 2.5 mL RPMI 1640 培养基中，用 NaOH 调节 pH 至 7–7.4，再用 RPMI 1640 定容至 3.06 mL，制成 200 mM 的 NAC 储存液。用 0.2 µm 滤器过滤。每管分装 500 µL，于 −20 °C 保存。
      注意：高浓度 NAC 溶解较困难，可借助涡旋振荡助溶。RPMI 1640 中的酚红可作为 pH 指示剂；NAC 刚溶解时呈微黄色，调节至微粉红色为宜。NAC 储存液在 −20 °C 下可稳定保存长达 1 个月。
    5. 将 10 mg Nec-1s（参见材料表）溶于 1.8 mL DMSO 中，终浓度为 20 mM，用移液器吹打至溶液澄清。每管分装 50 µL，于 −20 °C 保存，避光。
    6. 将 250 µg G-CSF（参见材料表）溶于 1.25 mL RPMI 1640 培养基中，制成 200 µg/mL 的溶液。每管分装 50 µL，于 4 °C 保存。
  2. 2x CLON-G 培养基的制备
    1. 配制基础培养基。在 50 mL 离心管中加入 39.5 mL RPMI 1640、10 mL 胎牛血清（FBS）和 0.5 mL 青霉素-链霉素（抗生素），制成含 20% FBS 和 1% PS 的 RPMI 1640 基础培养基。
      注意：该高浓度 FBS 用于支持中性粒细胞的长期培养（可能超过 5 天）。若培养时间仅为 1–2 天，则 10%–15% FBS 已足够。
    2. 在冰上解冻所有 CLON-G 组分的储存液。
    3. 将 1 µL Hsp70 用 606 µL 基础培养基稀释至 20 µM。将 1 µL 200 µg/mL G-CSF 用 9 µL 基础培养基稀释至 20 µg/mL。
    4. 在 15 mL 离心管中加入 976 µL 基础培养基，再加入 1 µL Q-VD-oph（100 mM）、10 µL DFO（200 µM）、1 µL Hsp70（20 µM）、10 µL NAC（200 mM）、1 µL Nec-1s（20 mM）和 1 µL G-CSF（20 µg/mL），混匀后制成 1 mL 的 2x CLON-G 培养基。
      注意：2x CLON-G 培养基应在配制后立即使用。可暂时存放于 4 °C，但不可长期保存。剩余的 20 µM Hsp70 必须弃去。
  3. 中性粒细胞培养
    1. 通过梯度离心法分离小鼠中性粒细胞，方法参照先前报道25。将分离得到的小鼠中性粒细胞重悬于基础培养基中（100 万个细胞/100 µL）。
      注意：操作时应轻柔，避免激活中性粒细胞。整个过程中避免产生气泡。
    2. 在 24 孔非组织培养板（参见材料表）中加入 500 µL 2x CLON-G 培养基、400 µL 基础培养基和 100 µL 细胞悬液，轻轻吹打混匀 3–4 次。
      注意：2x CLON-G 培养基中各组分浓度过高，可能损伤中性粒细胞；切勿在无基础培养基的情况下直接加入。使用非组织培养板可防止中性粒细胞黏附。
    3. 将培养板平稳放入 37 °C、5% CO2 培养箱中。
      注意：7 天内无需更换培养基。CLON-G 组分的终浓度分别为：50 µM Q-VD-Oph、1 µM DFO、10 pM Hsp70、1 mM NAC、10 µM Nec-1s 和 10 ng/mL G-CSF。
    4. 用 Wright-Giemsa 复合染液（参见材料表）对培养的中性粒细胞进行染色，并在光学显微镜下分析（图 2A–D）。或者，使用 APC-CD11b 和 PE-Cy7-Ly6G 抗体染色，并按先前报道的方法进行流式细胞术分析（图 2E–I）26。

2. 体外 中性粒细胞自发性死亡检测

  1. 流式细胞术分析
    1. 将分离的中性粒细胞以每毫升100万个细胞的密度，在基础培养基中于37 °C、5% CO2条件下培养。使用非组织培养处理的24孔板，每孔加入1 mL细胞培养基。
    2. 用45 mL生理盐水溶解1 g CaCl2，配制成200 mM CaCl2溶液，使用0.2 µm滤器过滤，4 °C保存备用。
    3. 配制染色工作液。在1.5 mL离心管中，每样本加入7 µL生理盐水，并分别加入0.4 mg/mL FITC-Annexin-V、0.5 mg/mL碘化丙啶（PI）和200 mM CaCl2溶液各1 µL，充分混匀。现配现用。
    4. 轻轻吹打细胞培养基5至7次以混匀，随后在预定时间点取100 µL转移至流式管中。
      注意：整个操作过程应避免产生气泡。
    5. 涡旋振荡计数微球（见材料表）使其充分混匀，取10 µL均匀混合的计数微球加入与步骤2.1.4相同的流式管中。
    6. 向流式管中加入10 µL已配制的染色工作液（步骤2.1.3），避光、室温孵育5分钟。
    7. 向管中加入100 µL生理盐水，充分混匀，确保计数微球与细胞分布均匀。
    8. 进行流式细胞术分析。以较低流速收集数据（约400个事件/秒）。在FSC-A与SSC-A图中圈选APC-PE-Cy7-细胞，并进一步在中等FSC-A和SSC-A位置圈选完整细胞，分析其FITC-Annexin-V与PE-PI信号；Annexin-V−PI−细胞群定义为健康细胞。
      注意：以下公式用于计算每样本健康细胞总数及中性粒细胞存活率：
      每样本健康细胞总数27 = (1,000/计数微球数量) × Annexin-V−PI−细胞数量 × 10
      ​中性粒细胞存活率 = 特定时间点健康细胞总数 / 零时健康细胞总数
  2. 荧光成像检测
    1. 将分离的中性粒细胞以每毫升100万个细胞的密度，在基础培养基中于37 °C、5% CO2条件下接种于共聚焦培养板，每板加入2 mL细胞培养基。
      注意：共聚焦荧光显微镜可获得最佳图像质量，但任何具备488/561/DIC通道的荧光显微镜均可满足本实验需求。
    2. 在指定时间点轻柔取出培养板，均匀加入0.4 mg/mL FITC-Annexin-V、0.5 mg/mL PI和200 mM CaCl2溶液各10 µL，室温避光染色5分钟。
      注意：整个操作过程避免振荡，染色试剂应均匀、轻柔地加入。
    3. 使用共聚焦荧光显微镜（20倍物镜，见材料表）在488（Annexin-V）/561（PI）/DIC通道下采集荧光图像。设定488通道曝光时间为500 ms，561通道为200 ms，DIC通道为100 ms。每板随机选取5–10个视野进行成像。细胞类型的定义参见我们先前发表的研究报告14。

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结果

经CLON-G处理的中性粒细胞的Wright-Giemsa染色形态（图2A-D）和FACS表型（图2E-J）未受影响。根据流式细胞术分析（图3）和荧光成像检测（图4），CLON-G处理24小时后的中性粒细胞存活率约为90%以上。较低的存活率可能源于CLON-G组分保存不当、浓度不适宜，或起始分离的中性粒细胞质量较差。对在基础培养基中培养24小时的未处理中性粒细胞进行流式细胞术分析显示，这些中性粒细胞中存在Annexin-V阳性群体（图3B）。该群体的减少可能与细胞培养基中含有的乙二胺四乙酸（EDTA）有关。在基础培养基中培养24小时的中性粒细胞的荧光图像中应可见肿胀的细胞（

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讨论

中性粒细胞在先天性和适应性免疫中发挥重要作用，其稳态受到严格调控。中性粒细胞是人体外周血中最丰富的白细胞，具有强大且快速的更新能力。一个健康的成年人每天可释放约 1 × 10⁹ 个中性粒细胞每千克骨髓组织。9 每天从骨髓中产生中性粒细胞/kg28因此，中性粒细胞的死亡已成为该领域令人困惑的谜题之一，大量研究致力于深入理解其机制。Caspase29,30,31,32，LMP33, 活性氧物种21,22,33，坏死34,

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披露

作者声明本研究是在无任何利益冲突的情况下进行的。

致谢

本项目得到海河实验室细胞生态系统创新基金（22HHXBSS00036，22HHXBSS00019）、中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2021-I2M-1-040，2022-I2M-JB-015）、中央高校基本科研业务费专项资金、北京协和医学院（3332022062）以及四川省科技计划项目（编号：2021YJ0480）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 µm 毫微孔滤膜Pall Corporation4612滤液制备的CLON-G组分。
1.5 mL 微型离心管LABSELECTMCT-001-150实验耗材
15 mL 离心管LABSELECTCT-002-15实验耗材
24孔细胞培养板Falcon351147中性粒细胞培养板
50 mL 离心管LABSELECTCT-002-50实验耗材
BD LSRIIBD中性粒细胞死亡流式细胞术分析仪器
氯化钙（CaCl2)Sigma AldrichC4901Annexin-V 结合辅助剂  磷脂酰丝氨酸。
共聚焦显微镜PerkinelmerUltraVIEW VOX中性粒细胞死亡荧光分析仪
共聚焦培养板NEST801001-20mm荧光成像实验用实验室耗材
计数微珠赛默飞世尔科技C36950流式细胞术分析中性粒细胞死亡的定量
DFOSigma AldrichD9533CLON-G 组分。LMP 抑制剂。
二甲基亚砜（DMSO）Sigma AldrichD2650Q-VD-oph 和 Nec-1s 的溶剂。
胎牛血清Gibco10099141C中性粒细胞培养基础培养基组分。营养供给。
FITC-Annexin-VBD51-65874XAnnexin-V 可与衰老细胞的磷脂酰丝氨酸结合。此信号位于 FITC 通道。
Hsp70Abcamab113187CLON-G 组分。LMP 抑制剂。
NACSigma AldrichA9165CLON-G 的组分。抗氧化剂。
Nec-1sEMD Millipore852391-15-2CLON-G 的组分。坏死性凋亡抑制剂。
青霉素-链霉素溶液（PS）Gibco15070063中性粒细胞培养基础培养基组分。用于保护细胞免受细菌污染的抗生素。
碘化丙啶（PI）BioLegend421301中性粒细胞死亡检测用。一种可与DNA结合的小分子荧光染料  但无法被动穿过具有完整质膜的细胞。
Q-VD-ophSelleckchemS7311CLON-G 的组分。广谱caspase抑制剂。
注射用重组人粒细胞集落刺激因子（CHO细胞）（G-CSF）Chugai Pharma 中国GRANOCYTECLON-G 的组分。  通过Akt通路促进中性粒细胞存活。
圆底聚苯乙烯管Falcon100-0102流式细胞术分析用实验耗材
RPMI1640GibcoC11875500BT中性粒细胞培养基础培养基组分
生理盐水LEAGENER00641中性粒细胞死亡流式细胞术分析用溶液
氢氧化钠（NaOH）FENG CHUAN13-011-00029NAC的pH调节。
Wright-Giemsa 染色液SolarbioG1020中性粒细胞细胞离心涂片染色

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