本文旨在提供详细的实验方案，用于分离植物相关内生真菌、长期保存分离物、形态学表征，以及提取总DNA，以用于后续的分子鉴定和宏基因组分析。
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摘要
摘要
菌异养植物表现出菌根依赖性中最极端的形式之一，已完全丧失自养能力。与这些植物密切关联的真菌对其而言如同其他任何重要资源一样必不可少。因此，研究菌异养物种时最关键的技术之一就是能够用于探究其相关真菌的方法，尤其是定殖于根部和地下器官的真菌。在此背景下，通常应用依赖培养和不依赖培养的内生真菌鉴定技术。分离真菌内生菌可实现其形态学鉴定、多样性分析，并可保存接种物用于兰科种子的共生萌发。然而，已知植物组织中存在大量不可培养的真菌。因此，不依赖培养的分子鉴定技术能够更全面地覆盖真菌物种的多样性和丰度。本文旨在为开展两种研究方法——依赖培养和不依赖培养的方法——提供必要的方法学支持。关于依赖培养的实验方案，本文详细描述了从野外采集点到实验室条件下植物样品的采集与保存流程，以及从菌异养植物的地下器官和地上器官中分离丝状真菌、建立分离菌株保藏体系、通过载片培养法对菌丝进行形态学表征，以及通过总DNA提取进行真菌的分子鉴定。在不依赖培养的技术方面，详细流程包括为宏基因组分析采集植物样品，以及使用商业化试剂盒从无叶绿素植物器官中提取总DNA。最后，本文还提出了后续实验流程（如聚合酶链式反应 [PCR]、测序）的衔接方案，并介绍了相应的分析技术。
引言
内生真菌按定义是指那些以不显眼的方式（即不对宿主造成伤害）侵染植物器官和组织内部的真菌1,2。这些真菌可与宿主植物呈中性或互利关系，可能赋予植物对病原体和不利环境条件的抗性，并可能参与合成对植物有益的化合物（如生长因子及其他植物激素）1,3。菌根内生真菌是指能够与植物建立菌根共生关系并参与养分转运的真菌4。在兰科植物中，绝大多数物种的种子萌发以及该科所有植物的幼苗定植都依赖于与菌根内生真菌的相互作用5。在这些情况下，菌异养型兰科植物表现出对其菌根共生真菌的完全依赖，因其整个生命周期所需的矿物质养分和碳化合物均依赖于这些真菌的供给6。因此，在研究菌异养生活策略时，分离和鉴定与其共生的真菌是基本前提。此外，目前对于内生真菌在菌异养植物中的作用，甚至这些真菌的真实多样性，仍知之甚少7,8。
内生真菌的研究可进行如下 通过 不同的技术，传统上被称为非依赖培养或依赖培养的方法，例....
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方案
1. 植物样品采集
- 基于培养方法的样品采集
- 小心地挖掘地下器官；这些可以是待采集植物的根、茎、根状茎或贮藏器官。除非常致密的土壤外，应徒手采集这些样品。
注意：不建议在此步骤中使用诸如铲子或勺子等工具，因为这可能会损伤菌异养植物脆弱的结构，并可能导致非内生真菌对组织的污染。 - 尽可能多地采集地下器官。将样品保存在纸袋中，并置于冷藏容器内（例如，带有冰块的聚苯乙烯泡沫箱或保温袋）。若同时采集了地上器官，则需与地下器官分开运输。
- 小心地挖掘地下器官；这些可以是待采集植物的根、茎、根状茎或贮藏器官。除非常致密的土壤外，应徒手采集这些样品。
- 非依赖培养方法的样品采集
- 按照步骤1.1.1中“注意”部分所述的相同建议，小心挖掘待采集植物的根部。
- 尽可能多地采集地下器官。将采集的样品保存在液氮中的冻存管内（理想选择），或使用干冰包围的离心管（替代选择）。若采集了地上器官，应单独保存。
2. 植物器官相关内生真菌的分离14
注意：本节使用的所有材料、溶液和试剂必须无菌。无法购买预灭菌产品的，应在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
- 植物器官的表面消毒
- 将采集的样品（步....
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结果
在分离方案中，若考虑到最后一次冲洗用水存在污染，且在接种了组织片段的培养皿中也检测到污染，则可根据污染物的类型采取不同的应对措施（表1）。如果污染源为生长迅速且产孢能力强的真菌，或对所选抗生素具有抗性的快速增殖细菌，则必须从头重新进行该操作流程。相反，若真菌污染物生长缓慢或不产孢，则可在后续步骤中简单地避免对其的分离操作。最后，对于增殖速度较慢的细菌污染，在后续步骤中也较易避免，尤其是在恢复菌丝的纯化阶段。
在前述所有情况下，理想的处理方案是使用其他样本重新进行消毒处理，并将植物材料接种到含有其他抗生素的培养基中，这些抗生素应具有更广谱的抗菌活性，以应对污染初始培养皿的耐药细菌。然而，考虑到采集新样本以及获取菌异养植物器官所面临的困难，某些污染情况也可在后续的实验步骤中成功解决，如表1所示。
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讨论
植物样品的表面消毒是本方案中最关键的步骤之一。在最后一次洗涤液滴入的PDA培养皿中应尽可能无任何污染。在分离培养皿中，细菌污染通常比空气传播的产孢真菌更为常见，因为植物组织内也普遍存在内生细菌3,11。因此，在接种组织片段时，向培养基中添加抗生素至关重要。联合使用不同类型的抗生素可获得更佳效果，从而实现更广谱的抑菌作用。另一个需要注意的重要问题是真菌分离过程中的固有偏差，使用PDA和AA培养基不可避免地会筛选出某些真菌种类，而对其他种类不利。联合使用其他培养基可在一定程度上减小这种偏差，但无法完全消除此类局限性9。
通常，在培养皿中生长时能够产孢的真菌，在低温或非低温的保藏方案中均表现出较高的存活率；而不能产孢的菌株可能无法耐受卡斯特拉尼法（Castellani's）或矿物油保藏法34,35,.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢圣保罗研究基金会（FAPESP，项目号：2015/26479-6）和国家科学技术发展委员会（CNPq，项目号：447453/2014-9）的资助。JLSM 感谢 CNPq 提供的生产力研究基金（项目号：303664/2020-7）。MPP 感谢卡洛斯·查加斯博士高级别学术人员培训基金会（Capes，硕士奖学金，项目号：88887.600591/2021-00）以及 CNPq 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶带 | （任何公司生产，用于微形态学分析中的胶带贴片法） | ||
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | A5354 | （用于植物片段的接种；可使用其他抗生素——参见步骤 2.2.1） |
| 高压灭菌器 | （任何公司生产，用于多个步骤中的材料灭菌） | ||
| 细菌学琼脂 | Sigma-Aldrich | A1296 | （用于多个步骤） |
| C1、C2、C3、C4、C5 和 C6 溶液 | Qiagen | 12888-50 | （随 DNeasy PowerSoil 试剂盒购入） |
| 离心机 | Merck/Eppendorf | 5810 G | （用于真菌分离物的总 DNA 提取） |
| 离心管 | Merck | CLS430828 | （用于样品收集） |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | C2432 | （用于真菌分离物的总 DNA 提取） |
| 刚果红 | Supelco | 75768 | （用于菌丝染色） |
| 冻存管 | Merck | BR114831 | （用于多个步骤） |
| 乙醇 | Supelco | 100983 | 需进行适当稀释（用于多个步骤） |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | 3609 | （用于真菌分离物的总 DNA 提取） |
| 滤纸 | Merck | WHA10010155 | （用于多个步骤） |
| 玻璃试管 | Merck | CLS7082516 | （用于稻谷未脱壳状态下的冷冻保存） |
| 玻璃棉 | Supelco | 20411 | （用于稻谷未脱壳状态下的冷冻保存） |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | 或右旋糖（用于蛭石冷冻保存） |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | 或丙三醇（用于蛭石冷冻保存，制备 LPCB） |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | 563935 | （用于真菌分离物的总 DNA 提取） |
| 乳酸 | Sigma-Aldrich | 252476 | （用于制备 LPCB——菌丝染色） |
| 乳酸酚蓝溶液（LPCB） | Sigma-Aldrich | 61335 | （用于菌丝染色） |
| 超净工作台 | （I 级，任何公司生产，用于多个步骤） | ||
| 光学显微镜 | （任何公司生产，用于观察菌丝） | ||
| MB 离心柱 | Qiagen | 12888-50 | （随 DNeasy PowerSoil 试剂盒购入） |
| 甲基蓝（棉蓝） | Sigma-Aldrich | M5528 | （用于制备 LPCB——菌丝染色） |
| 微量离心管（1.5 mL） | Merck | HS4323 | （用于真菌分离物的总 DNA 提取） |
| 微量离心管（2 mL） | Merck | BR780546 | （用于多个步骤） |
| 矿物油 | （用于真菌分离物的保存） | ||
| 纸袋 | 平均尺寸 150 mm × 200 mm（用于样品收集） | ||
| 培养皿（玻璃，120 mm × 20 mm） | Merck/Pyrex | SLW1480/10D | （可高压灭菌，用于真菌载片培养，建议使用较高者） |
| 培养皿（玻璃，50 mm × 17 mm） | Merck/Aldrich | Z740618 | （用于真菌分离物的纯化）；或可选用：聚苯乙烯培养皿（无菌，γ射线辐照，不可高压灭菌） |
| 培养皿（玻璃，80 mm × 15 mm） | Merck/Brand | BR455732 | （用于植物片段的接种）；或可选用：聚苯乙烯培养皿（无菌，γ射线辐照，不可高压灭菌） |
| 苯酚 | Sigma-Aldrich | P1037 | （用于真菌分离物的总 DNA 提取，制备 LPCB） |
| 瓷研钵 | Sigma-Aldrich | Z247464 | （用于真菌分离物的总 DNA 提取） |
| 瓷研杵 | Sigma-Aldrich | Z247502 | （用于真菌分离物的总 DNA 提取） |
| 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA） | Millipore | P2182 | （用于多个步骤） |
| PowerBead 管 | Qiagen | 12888-50 | （随 DNeasy PowerSoil 试剂盒购入） |
| 快速封片剂（Entellan） | Sigma-Aldrich | 1.0796 | （用于真菌载片培养） |
| 硅胶 | Supelco | 717185 | （用于稻谷未脱壳状态下的冷冻保存） |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S9888 | （用于真菌分离物的总 DNA 提取） |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | L3771 | 月桂基硫酸钠盐（用于真菌分离物的总 DNA 提取） |
| 次氯酸钠（含 2% 活性氯） | （市售产品，用于表面消毒） | ||
| 土壤 DNA 提取试剂盒（DNeasy PowerSoil 试剂盒） | Qiagen | 12888-50 | （用于植物器官的总 DNA 提取） |
| 分光光度计 - Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | （用于植物器官的总 DNA 提取） |
| 体视显微镜 | （=解剖显微镜，任何公司生产，用于宏观形态学分析） | ||
| 四环素 | Sigma-Aldrich | T7660 | （用于植物片段的接种） |
| 恒温金属浴 | Merck/Eppendorf | EP5362000035 | （或其他公司产品） |
| 组织匀浆仪与细胞破碎仪 | SPEX SamplePrep | 2010 Geno/Grinder — 自动化组织匀浆仪与细胞破碎仪（用于植物器官的总 DNA 提取） | |
| 甲苯胺蓝 O | Sigma-Aldrich/Harleco | 364-M | （用于菌丝染色） |
| 海藻糖 | Sigma-Aldrich | T9531 | （用于蛭石冷冻保存） |
| Tris 碱溶液（Tris） | Sigma-Aldrich | T1699 | （用于真菌分离物的总 DNA 提取） |
| 未脱壳稻米 | （用于冷冻保存） | ||
| U 形玻璃棒 | （或进行适当改装——参见步骤 5.4.1，用于真菌载片培养） | ||
| 蛭石 | 细颗粒（用于蛭石冷冻保存） | ||
| 涡旋振荡器 | Sigma-Aldrich/BenchMixer | BMSBV1000 | （用于真菌分离物的总 DNA 提取） |
| 酵母提取物 | Sigma-Aldrich | Y1625 | （用于蛭石冷冻保存） |
参考文献
- de Azevedo, J. L. Endophytic microorganisms. Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).
- Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. An overview of endophytic microbes: endophytism defined. Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).
- Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer
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