分枝杆菌天然及重组细胞外囊泡的富集

摘要

本方案详细描述了从无菌培养的分枝杆菌中富集天然的分枝杆菌胞外囊泡（mEVs）的方法 Mycobacterium smegmatis （耻垢分枝杆菌，Msm）以及如何设计并富集含有mCherry（一种红色荧光报告蛋白）的重组MsmEVs。最后，通过富集含有EsxA蛋白的MsmEVs验证了这一新方法。 结核分枝杆菌

摘要

大多数细菌，包括分枝杆菌，均可产生细胞外囊泡（EVs）。由于细菌来源的细胞外囊泡（bEVs）含有细胞组分的特定子集，包括代谢物、脂质、蛋白质和核酸，多个研究团队已评估了天然或重组形式的bEVs作为亚单位疫苗候选物的保护效力。与天然EVs不同，重组EVs经过分子工程改造，可包含一种或多种目标免疫原。在过去十年中，不同研究团队已探索了多种生成重组bEVs的方法。然而，本文报道了在分枝杆菌中设计、构建和富集重组分枝杆菌细胞外囊泡（mEVs）的方法。为此，我们采用 Mycobacterium smegmatis (Msm)，一种无致病性的土壤分枝杆菌作为模型系统。我们首先描述了Msm天然EVs的分离与富集方法。随后，介绍了重组mEVs的设计与构建，该体系包含红色荧光报告蛋白mCherry或EsxA（Esat-6），后者是分枝杆菌中一种重要的免疫原蛋白 结核分枝杆菌我们通过将 mCherry 和 EsxA 的N端分别与一种小型 Msm 蛋白 Cfp-29 的C端融合来实现这一目标。Cfp-29 是 MsmEVs 中少数丰度较高的蛋白质之一。生成和富集来自 Msm 的重组 mEVs 的方案与生成和富集 Msm 天然 EVs 的方案相同。

引言

尽管已研发并接种了多种针对传染病的疫苗，但时至今日，人类死亡总数中仍有约30%源于传染性疾病¹。在结核病（TB）疫苗——卡介苗（Bacillus Calmette Guerin, BCG）问世之前，结核病是头号致死病因（每10万人口中约有10,000至15,000例）²。随着BCG疫苗的接种以及一线和二线抗结核药物的广泛可及，到2022年，结核病相关死亡人数已显著下降至每年约100万例（即每10万人口中约15–20例）¹。然而，在全球结核病流行地区，结核病相关死亡率仍维持在每10万人口约100–550例的水平¹。尽管专家们认识到导致这些差异的多种原因，但BCG疫苗介导的保护作用甚至无法持续到生命第一个十年，似乎是其中最主要的原因^3,4,5,6,7。因此，鉴于联合国提出的更新版“可持续发展目标”以及世界卫生组织（WHO）的“终结结核病策略”，全球正在协同努力，开发一种远优于BCG的新型疫苗，有望提供对结核病的终身保护。

方案

1. 耻垢分枝杆菌、大肠埃希菌及其衍生菌株的培养条件

1. 培养基
   1. Middlebrook 7H9 液体培养基
      1. 通过将所需体积的双蒸水（ddw）在玻璃烧杯中预热至约45–50℃，配制20% Tween-80储备液 ^o在微波炉中加热至 C，使用适当的量筒加入所需体积的 Tween-80，并在小型磁力搅拌器上持续搅拌，使 20% Tween-80 形成均匀溶液。将 20% Tween-80 溶液经 0.22 μm 一次性滤器过滤，所得淡黄色储备液于 4 ℃ 保存 ^oC.
         注意：必须将量筒中残留的所有吐温-80转移至烧杯中，以确保最终浓度准确。切勿对配制好的吐温-80储备液进行高压灭菌。 过滤（使用 0.22 µm 滤器）除菌，并于 4 ℃ 保存 ^oC.
      2. 按照说明书制备7H9液体培养基。将4.7 g 7H9粉末悬浮于900 mL去离子水中，加入2 mL甘油，混匀后于121 °C高压灭菌 ^oC，15 psi，20 分钟
         注意：高压灭菌前请勿添加Middlebrook ADC增补剂（ADC）和吐温-80。
      3. 待高压灭菌的培养基冷却至室温（RT，即约25℃）后 ^oC)，在标准A2型生物安全柜中，无....

结果

我们使用 M. smegmatis 以耻垢分枝杆菌（Msm）作为模式分枝杆菌，用于展示天然及重组mEVs（R-mEVs）的富集过程。该流程图概括了mEVs富集的操作步骤。图1）也适用于Msm的R-mEVs以及Mtb的天然EVs的富集（具体细节见1.2节方案注释中的微小调整）。富集后的mEVs需通过透射电子显微镜负染色进行观察³⁶ (图2A）。通常，Msm 特异性 EVs 会在 4^th-6^th 13 mL 6-60% 密度梯度的 1 mL 分级组分（图2B）。大约 80-100 µg 从2 L处于对数中期的无菌Msm培养物中常规获取EVs的蛋白当量。其直径通常在20 nm至250 nm之间图 2C).

我们实验室的一个长期目标是评估不同分枝.......

讨论

由于开发一种优于卡介苗（BCG）并能取代它的新型结核病疫苗仍面临巨大挑战，作为替代策略，多个研究团队正致力于发现不同的结核病亚单位疫苗，以增强BCG的效力并延长其保护持续时间^48,49。鉴于细菌胞外囊泡（bEVs）作为潜在亚单位成分及天然佐剂正受到越来越多关注^50,51，稳定富集足量的分枝杆菌胞外囊泡（mEVs）以用于后续检测与分析已成为关键步骤。本实验方案正是基于上述研究需求，旨在从无菌培养的分枝杆菌及其重组株中富集mEVs。

在对耻垢分枝杆菌（Msm）胞外囊泡（EVs）进行详细的质谱蛋白质组学分析时，Prados-Rosales 等 鉴定了丰度最高的10种蛋白质³⁰。我们进一步推测，经过充分的分子改造后，其中任意一种蛋白应足以将目标外源蛋白带入mEVs中。有趣的是，Cfp-29因其.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A2型生物安全柜	Thermo Fisher Scientific, USA		1300系列
台式离心机	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1、HindIII、HpaI	NEB, USA		NEB
细胞密度计	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
柠檬酸	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
双蒸水	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
电穿孔比色皿	Bio-Rad, USA		2 mm
电穿孔仪	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA特异性抗体	Abcam, UK		兔多克隆抗体
柠檬酸铁铵	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
落地式离心机	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
玻璃器皿	Borosil, INDIA		1 L 三角烧瓶
甘油	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES 和氯化钠	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
摇床培养箱	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-天冬酰胺	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
LB液体培养基和琼脂（Miller配方）	Hi Media, INDIA		Hi Media
七水合硫酸镁	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
磁力搅拌器	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry特异性抗体	Abcam, UK		兔单克隆抗体
微波炉	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9液体培养基	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC 增菌液	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		DH5a的衍生物
Optiprep (碘克沙醇)	Merck, USA		以60%水溶液形式提供
PCR纯化试剂盒	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH计	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
质粒DNA小量提取试剂盒	Hi Media, INDIA		Hi Media
培养板孵育箱	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
质粒pMV261	Addgene, USA * *该  质粒  已  不  再在该质粒库中提供		穿梭载体
高保真DNA聚合酶	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5高保真DNA聚合酶	NEB, USA		NEB
制冷循环水浴锅	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Midddlebrook 7H11琼脂基础培养基	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC培养基	Hi Media, INDIA		Hi Media
氢氧化钠	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA连接酶	NEB, USA		NEB
吐温-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
超速离心机	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
超速离心管 - 14 mL	Beckman Coulter, USA		聚全氟烷氧基树脂型 – SW40Ti转子用超透明型
超速离心管 - 38 mL	Beckman Coulter, USA		聚丙烯型– SW28转子用乳白色型
超声清洗水浴器	Thermo Fisher Scientific, USA		超声仪 - 台式型号
0.22 µm 一次性滤器	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon浓缩管	Merck, USA		Amicon Ultra离心滤器 - Millipore
3X FLAG抗体	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL离心瓶	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL离心管	Corning, USA		无菌，预包装
细菌
菌株
大肠杆菌	NEB, USA		NEB 5-alpha（DH5α的衍生物）。
表达cfp29::mCherry的Msm	本研究		MC2 155
表达cfp29::esxA的Msm	本研究		MC2 155
表达cfp29::esxA::3X FLAG的Msm	本研究		MC2 155
耻垢分枝杆菌 (Msm)	哈佛大学 Sarah M. Fortune 教授，美国		MC2 155