方法文章

分枝杆菌天然及重组细胞外囊泡的富集

DOI:

10.3791/65138

2023年12月8日

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摘要

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本方案详细描述了从无菌培养的分枝杆菌中富集天然的分枝杆菌胞外囊泡(mEVs)的方法 Mycobacterium smegmatis (耻垢分枝杆菌,Msm)以及如何设计并富集含有mCherry(一种红色荧光报告蛋白)的重组MsmEVs。最后,通过富集含有EsxA蛋白的MsmEVs验证了这一新方法。 结核分枝杆菌

摘要

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大多数细菌,包括分枝杆菌,均可产生细胞外囊泡(EVs)。由于细菌来源的细胞外囊泡(bEVs)含有细胞组分的特定子集,包括代谢物、脂质、蛋白质和核酸,多个研究团队已评估了天然或重组形式的bEVs作为亚单位疫苗候选物的保护效力。与天然EVs不同,重组EVs经过分子工程改造,可包含一种或多种目标免疫原。在过去十年中,不同研究团队已探索了多种生成重组bEVs的方法。然而,本文报道了在分枝杆菌中设计、构建和富集重组分枝杆菌细胞外囊泡(mEVs)的方法。为此,我们采用 Mycobacterium smegmatis (Msm),一种无致病性的土壤分枝杆菌作为模型系统。我们首先描述了Msm天然EVs的分离与富集方法。随后,介绍了重组mEVs的设计与构建,该体系包含红色荧光报告蛋白mCherry或EsxA(Esat-6),后者是分枝杆菌中一种重要的免疫原蛋白 结核分枝杆菌我们通过将 mCherry 和 EsxA 的N端分别与一种小型 Msm 蛋白 Cfp-29 的C端融合来实现这一目标。Cfp-29 是 MsmEVs 中少数丰度较高的蛋白质之一。生成和富集来自 Msm 的重组 mEVs 的方案与生成和富集 Msm 天然 EVs 的方案相同。

引言

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尽管已研发并接种了多种针对传染病的疫苗,但时至今日,人类死亡总数中仍有约30%源于传染性疾病1。在结核病(TB)疫苗——卡介苗(Bacillus Calmette Guerin, BCG)问世之前,结核病是头号致死病因(每10万人口中约有10,000至15,000例)2。随着BCG疫苗的接种以及一线和二线抗结核药物的广泛可及,到2022年,结核病相关死亡人数已显著下降至每年约100万例(即每10万人口中约15–20例)1。然而,在全球结核病流行地区,结核病相关死亡率仍维持在每10万人口约100–550例的水平1。尽管专家们认识到导致这些差异的多种原因,但BCG疫苗介导的保护作用甚至无法持续到生命第一个十年,似乎是其中最主要的原因3,4,5,6,7。因此,鉴于联合国提出的更新版“可持续发展目标”以及世界卫生组织(WHO)的“终结结核病策略”,全球正在协同努力,开发一种远优于BCG的新型疫苗,有望提供对结核病的终身保护。

为实现这一目标,目前多个研究团队正在评估经过修饰或重组的卡介苗(BCG)菌株、除BCG外的非致病性及减毒分枝杆菌物种,以及亚单位候选疫苗8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。通常,亚单位疫苗是选择性地装载了少量纯化的(约1–6种)全长或截短的病原体免疫原性蛋白的脂质体。然而,由于这些蛋白容易错误折叠成非天然构象,和/或所装载蛋白之间发生随机且无功能的相互作用,亚单位疫苗常常缺乏天然且相关的表位,因此无法有效激活免疫系统14,19,20

因此,细菌的细胞外囊泡(EVs)作为有前景的替代方案,研究进展迅速21,22,23,24,25,26。通常,细菌EVs(bEVs)包含其细胞组分的一部分,包括部分核酸、脂质以及数百种代谢物和蛋白质27,28。与人工加载少量纯化蛋白的脂质体不同,bEVs含有数百种天然加载且正确折叠的蛋白质,更易于激活免疫系统,尤其在无需佐剂或Toll样受体(TLR)激动剂辅助的情况下也具有较强的免疫刺激能力27,28,29。正是基于这一研究方向,我们及其他研究者探索了分枝杆菌EVs作为BCG潜在亚单位增强剂的应用价值30。尽管人们担忧bEVs的抗原载量不均一,但来自减毒Neisseria meningitidis的EVs已成功用于人类,预防B群脑膜炎球菌感染31,32

至少从理论上讲,能够有效增强BCG作用的最佳细胞外囊泡(EVs)应是来源于致病性细菌的EVs。然而,从致病性分枝杆菌中富集EVs成本高昂、耗时较长且存在安全风险。此外,由病原体产生的EVs可能更具致病性而非保护性。鉴于潜在风险,本文报道了一种经过充分验证的实验方案,用于从体外无菌培养的非致病性分枝杆菌(Msm)所产生的EVs中进行有效富集。

然而,尽管非致病性分枝杆菌编码多种病原体蛋白的直系同源物,但缺乏若干对充分激活免疫系统以实现保护性免疫至关重要的疫苗抗原或致病蛋白表位33。因此,我们还探索通过分子工程手段构建并富集耻垢分枝杆菌(Msm)的重组细胞外囊泡(EVs),使得在Msm中表达并翻译的任何目标致病蛋白的大部分均能被转运至其EVs中。我们假设,将目标蛋白与Msm EVs中丰度最高的10种蛋白中的一种或多种融合表达,将有助于实现此类转运。

在我们实验室开始对分枝杆菌囊泡(mEVs)的富集方法进行标准化时,Prados-Rosales 等人于 2011 年首次报道了在体外对 mEVs 进行可视化和富集的方法in vitro30。随后在 2014 年,该研究团队发表了其 2011 年方法的改进版本34。2015 年,Lee 等人也报道了一种独立标准化的 mEV 富集方法,同样来源于分枝杆菌的纯培养物35。结合上述两种方法34,35,并在充分标准化的基础上引入了一些我们的改进,本文描述了一种可常规用于从分枝杆菌纯培养物中富集 mEV 的实验方案36

本文重点详细描述了Msm特异性EVs的富集方法,该方法是在已发表的分枝杆菌EVs通用富集方案36基础上的拓展。我们还详细说明了如何构建含有mCherry蛋白(作为红色荧光报告分子)和EsxA(Esat-6)37,38,39的重组mEVs(R-mEVs),其中EsxA是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的主要免疫原和潜在亚单位疫苗抗原。R-mEVs的富集方案与我们此前描述的从Msm中富集天然EVs的方法完全相同。

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方案

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1. 耻垢分枝杆菌大肠埃希菌及其衍生菌株的培养条件

  1. 培养基
    1. Middlebrook 7H9 液体培养基
      1. 通过将所需体积的双蒸水(ddw)在玻璃烧杯中预热至约45–50℃,配制20% Tween-80储备液 o在微波炉中加热至 C,使用适当的量筒加入所需体积的 Tween-80,并在小型磁力搅拌器上持续搅拌,使 20% Tween-80 形成均匀溶液。将 20% Tween-80 溶液经 0.22 μm 一次性滤器过滤,所得淡黄色储备液于 4 ℃ 保存 oC.
        注意:必须将量筒中残留的所有吐温-80转移至烧杯中,以确保最终浓度准确。切勿对配制好的吐温-80储备液进行高压灭菌。 过滤(使用 0.22 µm 滤器)除菌,并于 4 ℃ 保存 oC.
      2. 按照说明书制备7H9液体培养基。将4.7 g 7H9粉末悬浮于900 mL去离子水中,加入2 mL甘油,混匀后于121 °C高压灭菌 oC,15 psi,20 分钟
        注意:高压灭菌前请勿添加Middlebrook ADC增补剂(ADC)和吐温-80。
      3. 待高压灭菌的培养基冷却至室温(RT,即约25℃)后 oC),在标准A2型生物安全柜中,无菌加入100 mL ADC的10倍浓缩液(终浓度1×)和2.5 mL 20% Tween-80(终浓度0.05%)。用0.22 µm一次性滤器过滤混合液,得到淡黄绿色透明储备液,于4 ℃保存 oC.
        注意:培养基的 pH 值必须为 ~6.6 至 6.8(如果 <6.4 或 >7.0,则弃去并重新配制)。4 ℃保存 oC(可稳定保存3-4周)。 建议将添加了ADC和Tween-80的7H9培养基先后通过两个独立的0.22 µm一次性滤器过滤两次。
    2. 萨顿氏(最小培养基)液体培养基
      1. 将L-天冬酰胺(0.4% w/v)和柠檬酸(0.2% w/v)溶解于950 mL去离子水中。分别加入新配制的1,000倍储存液各1 mL(溶于去离子水中):磷酸氢二钾(无色;储存液为10 g/20 mL;终浓度1×为0.5 g/L)、七水合硫酸镁(无色;储存液为10 g/20 mL;终浓度1×为0.5 g/L)和柠檬酸铁铵(极淡棕色;储存液为1.6 g/40 mL;终浓度1×为0.04 g/L),并在磁力搅拌器上充分搅拌。
        注意:1,000倍浓缩液最多可保存2周;若超过该期限,需重新配制;避光室温保存(例如置于柜子或架子内)。若柠檬酸铁铵呈深棕色,则弃用并重新配制。建议按照步骤1.1.2.1中所述顺序依次加入三种盐溶液。每次加入盐溶液前,均需轻轻旋摇混合溶液。
      2. 使用pH计测量并记录pH值,确保其在3.1至3.2左右。如果pH值高于3.7,则弃去该储备液并重新配制。如需将pH值调节至7.4,逐滴加入所需量的10 N氢氧化钠。在磁力搅拌器持续搅拌溶液/培养基的同时,监测最终pH值。
      3. 加入 4.76 mL 甘油和 0.25 mL 20% 吐温-80(终浓度 0.005%,参见步骤 2.2.1.3 的注释),然后加水定容至 1 L。随后,使用两个独立的 0.22 µm 一次性滤器,对 1 L 培养基进行两次过滤除菌。将澄清无色的培养基于 4 ℃ 保存 oC(可稳定保存2周)。
        注意:只有在将 pH 值调节至 7.4 之后,方可加入甘油。否则,培养基会变为浑浊的白色。若出现浑浊,请弃用(不要尝试加热),并重新新鲜配制。所有 mEVs 的制备均须使用新鲜配制的 Sauton's 培养基。
    3. Middlebrook 7H11 琼脂基础
      1. 按照制造商的说明进行配制。将19 g 7H11粉末悬浮于900 mL ddw中,加入5 mL甘油,在磁力搅拌器上旋涡振荡以获得均匀的悬浮液(淡绿色;pH值为6.6至6.8;如果 >7.2,弃去并重新配制),在121℃下高压灭菌 oC,15 psi,20 分钟。
        注意:高压灭菌前不要加入ADC和0.05%吐温-80。
      2. 当培养基冷却至约 50 o在A2型生物安全柜中,无菌操作加入100 mL已恢复至室温的ADC和2.5 mL 20%(终浓度0.05%)吐温-80(已恢复至室温)。立即无菌分装至培养皿中。
        注意:平板在 4 ℃ 下稳定 o在4°C下孵育至少4-6周。确保将培养板在室温下放置过夜,然后再将培养板包裹好置于4°C oC储存。否则,在37℃培养期间,水分会滞留在培养板中 oC.
    4. Miller Luria Bertani(LB)肉汤及琼脂基础
      1. 按照说明书进行配制。配制LB液体培养基时,将25 g粉末溶于1,000 mL去离子水(ddw)中,在磁力搅拌器上用玻璃烧杯轻轻搅拌5分钟,直至均匀悬浮。待完全混匀后,将所需体积分装至培养基瓶中(例如,500 mL培养基瓶中分装300 mL),然后进行高压灭菌。配制LB琼脂培养基时,将40 g粉末溶于1,000 mL去离子水(ddw)中,混匀后高压灭菌(或在500 mL玻璃培养基瓶中,将12 g粉末溶于300 mL ddw中,随后高压灭菌)。
  2. 生长条件
    注意:所有细菌培养操作步骤必须在生物安全柜(A2型)中进行。所有培养物必须使用无菌试管、烧瓶和移液器吸头进行处理。
    1. 第1天
      1. 分别加入1 mL来自-80℃的耻垢分枝杆菌(Msm)甘油菌种 oC 冷冻机)转移至 2 个 10 mL(装于 50 mL 无菌锥形离心管中)新近高压灭菌、冷却并预温(约 37 oC) 7H9肉汤,轻轻旋转混匀3次,盖紧管盖,37℃过夜培养 oC 和 200-220 rpm(摇床培养箱)。
        注意:为了培养 结核分枝杆菌 (结核分枝杆菌),采用类似的步骤,但在37℃下将50 mL试管培养4–6天 o在BSL3条件下,于37°C、120-150 rpm(摇床培养箱)中操作。处理和丢弃结核分枝杆菌(Mtb)及其培养物时,须遵守所有国际指南及BSL3和生物安全三级病原体的相关生物安全规范。操作Mtb及其培养物时应使用B2型生物安全柜。
    2. 第2天
      1. 当OD600 (A600 nm;细胞密度计)达到约1.0时,在3,200 × g下离心Msm培养物10分钟 g 以及室温(台式离心机)。使用无菌1 mL吸头弃去上清液。
        注意:上述步骤同样适用于结核分枝杆菌(Mtb)培养物,只是所需天数为4–7天。务必避免移液器吸头接触细菌沉淀。
      2. 洗涤:向每份耻垢分枝杆菌(Msm)沉淀中加入1 mL预温至室温的Sauton's培养基(步骤1.1.2),用1 mL移液器吸头轻轻重悬,以获得均匀的菌悬液。使用无菌移液器吸头,用相同的培养基将每管体积补至10 mL。将菌悬液在3,200 × g条件下离心10分钟 g 室温下离心并弃去上清液。重复此步骤一次。
        注意:上述步骤在Mtb培养物中保持不变。
      3. 将经过两次洗涤的 Msm 细胞重悬于 20 mL(每份)预热的 Sauton 培养基中(在培养皿或摇床培养箱中预热),并在 600 nm 处测定细胞的光密度。将所需体积的 Msm 培养物接种至含有约 330 mL 无菌 Sauton 培养基的无菌 1 L 锥形瓶中,使终末 OD600 约为 0.05。
        注意:重悬操作必须始终先用小体积进行。如果直接将最终体积的液体一次性加入沉淀中,细胞将保持分散的沉淀状态(这是重悬不充分的标志)。解决此问题的唯一方法是重新离心培养物,并按推荐方法重新进行重悬。上述步骤同样适用于结核分枝杆菌(Mtb)培养物。
    3. 第2/3天
      1. 将330 mL培养液置于摇床培养箱中,在200 rpm、37 ℃条件下孵育 oC,直至培养物的OD600 达到约0.3。随后,洗涤细胞一次(操作同步骤1.2.2.2,但使用等体积溶液),再将沉淀重悬于相同体积的溶液中。将重悬后的菌液各50 mL分装至六个无菌的1 L锥形瓶中,每个锥形瓶中预先加入280 mL无菌预热的Sauton's培养基(1/10)th 通常使用的(0.05%)Tween-80 的十分之一,即 0.005%(另请参见步骤 2.2.1.3 的注释,以了解为何使用 1/10)th). 最终 OD600 必须约为 0.05。
        注意:对于结核分枝杆菌(Mtb)培养,应使用滚瓶(容量为1/2/4 L),而非锥形瓶。调整每瓶培养液体积,使其置于滚瓶仪上时,培养液 到达瓶口。滚瓶中的实际体积取决于滚瓶的容量。
      2. 将每份330 mL的培养物置于摇床培养箱中,在37℃、200 rpm条件下振荡培养 oC 直至 OD600 达到2.0至2.5(约15-18小时)。
        ​注意:对于结核分枝杆菌(Mtb)培养物,确保最终 OD600 约为1.0-1.2(需要约5-8天)。

2. 采用密度梯度离心法富集耻垢分枝杆菌膜囊泡

  1. 第4天
    1. 将约2 L的对数中期Msm培养物分装至6个400 mL无菌离心瓶中,在4 °C下以适当转速离心 oC,约8,000 × g (落地式离心机)。将废弃培养基/培养上清液收集至两个预冷的、经高压灭菌的1 L锥形瓶中,并保留部分沉淀物用于后续分析步骤(如SDS-PAGE和Western印迹,此处未详述)。
      注意:所有后续步骤均须在低温(约 4 °C)下进行,以更好地维持 mEVs 的完整性。mEVs 在室温下较为稳定,但长期保存必须冷藏(不建议反复冻融)。在无菌培养过程中,mEVs 会从 Msm/Mtb 表面解离,并积累于培养上清液/用过的培养基中。
    2. 先将耻垢分枝杆菌(Msm)培养上清液通过0.45 µm的一次性滤器单元过滤,再通过0.22 µm的一次性滤器单元过滤,以彻底去除细菌残留。
      注意:直接通过0.22 µm滤器过滤时常会导致滤器堵塞(因为在执行步骤2.1.1时细菌沉淀可能被扰动)。为制备结核分枝杆菌(Mtb)培养上清液,在将培养滤液转移至BSL-2环境前,需对Mtb培养物进行三次过滤(即:首先使用0.45 µm一次性滤器进行第一次过滤;随后连续使用两个0.22 µm一次性滤器进行第二次和第三次过滤)。
  2. 第4/5天
    1. 使用 30 kDa 超滤离心管,将 Msm 培养上清液(约 2 L)在 4 ℃ 条件下离心浓缩至约 38 mL oC,20 分钟,3,200 × g.
      1. 先用无菌的冷去离子水(约 15 mL)预洗浓缩器(4 ℃下洗涤) oC,5 分钟,3,200 × g).
      2. 用约 15 mL 预过滤的冷 Sauton 培养基(条件与 2.2.1.1. 中水的处理条件相同)洗涤,以去除制造过程中使用的所有化学物质残留。
      3. 由于技术上需要约130个超滤管(若仅使用一次)来浓缩约2升的培养滤液,必要时请将超滤管重复使用至少3至4次。操作步骤如下:将15 mL滤液浓缩至0.5至1.0 mL(参照步骤2.2.1),将浓缩液转移至一支洁净、已灭菌且预冷的38 mL超速离心管中,然后将剩余未浓缩的培养滤液重新加入已使用过的超滤管中,进行重复浓缩。
        注意:使用24、30 kDa浓缩管浓缩2 L培养滤液最长需要6小时。在浓缩过程中,Tween-80也会被浓缩,可能导致浓缩管堵塞。在Sauton培养基中将Tween-80的终浓度调整为0.005%(而非0.05%),有助于防止此类堵塞。Tween-80浓度降低后,不影响耻垢分枝杆菌(Msm)生长过程中的均匀悬浮状态,也不会导致Msm细胞聚集。然而,由于结核分枝杆菌(Mtb)在0.005% Tween-80条件下会发生细胞聚集,因此在制备Mtb特异性胞外囊泡(EVs)时,应使用0.05% Tween-80。
    2. 将浓缩的 Msm 培养滤液(约 38 mL)转移至洁净、经去离子水清洗并预先冷却的 40–50 mL 聚丙烯离心管中,进行两步离心:第一步在 4,000 × g 然后在15,000 × g,两个步骤均在4℃下进行 o20 分钟(以去除所有碎片)。使用落地式离心机进行此步骤。
  3. 第5/6天
    1. 将培养上清液转移至预冷的38.5 mL聚丙烯超速离心管中,在超速离心机中于100,000 × g 4 h,4 ℃ oC.
      注意:此转速下使用摆桶式转子效果最佳。确保将超速离心管装至满管,并使用重量相等的平衡超速离心管。若离心后离心管粘附于摆桶式转子(由冷凝所致),可用镊子轻轻将其从转子上取下。在超速离心前,擦去超速离心管外表面的冷凝水分,可防止粘连。
    2. 将上清液保存至一个50 mL预冷的离心管中(见注释)。将超速离心管倒置在一张新的无绒吸水纸上,以去除残留的上清液。用600 µL HEPES缓冲液(50 mM HEPES,150 mM NaCl,pH 7.4;使用前过滤除菌)重悬沉淀。
      注意:仅将上清液作为备用保存。天然mEV沉淀呈凝胶状,直径5-7 mm,颜色为暗灰黄色至半透明斑点。若未见沉淀,可使用保存的上清液重复步骤2.3.1。若重复步骤2.3.1后仍无沉淀出现,则弃去样本并从步骤1.2重新开始。沉淀物溶解较慢,建议加入HEPES缓冲液后于4℃静置过夜。 oC,以便于重悬。轻轻吹打重悬,但需反复使用移液器吹打(建议使用P200枪头以获得更好的重悬效果),直至形成均匀悬液。
  4. 第6天
    1. 将重悬的沉淀物进行基于碘克沙醇(iodixanol)的密度梯度离心。
      1. 将重悬的沉淀物小心地铺在一支13 mL洁净、经ddw清洗并预冷的超透明聚丙烯超速离心管底部,然后用1 mL移液器轻轻加入约4 mL惰性密度梯度“iodixanol”溶液(商品化形式为约60% w/v溶液),并混匀。将重悬的沉淀物层加至管底(最多5 mL)后,依次在其上方小心叠加1 mL(w/v)的40%、30%、20%和10% iodixanol亚储备液(用HEPES缓冲液将60%母液稀释制备)。最后,在最上层加入4 mL用HEPES缓冲液从60%母液稀释制备的6%亚储备液,以充满离心管。
        注意:请在使用前立即配制梯度溶液;切勿储存后再次使用。
      2. 小心地(避免晃动)将试管放入玻璃烧杯中称重,然后轻轻将其转移至摆桶式转子中。
        注意:称重时需使用已称重的对照管进行配平。
      3. 在 141,000 × g 条件下进行超速离心 g 4℃下孵育16小时 oC.
  5. 第7天
    1. 小心取出试管(参见步骤 2.3.1 的注释),并将 1 mL 馏分收集至预先高压灭菌的微量离心管中;注意第 4 个馏分th 至6th 通常含有耻垢分枝杆菌膜囊泡(Msm mEVs)的组分。
      注意:这些组分中的 mEVs 通常会分离成三到四条 mEVs 条带(其中一条为主条带),呈暗白色。含有 mCherry 的 R-mEVs 在第 5 个组分中分离出来th 至 7th 组分中,呈深紫色至洋红色。结核分枝杆菌EVs通常在第5组分中分离出来th 至 7th 组分。mEVs 在梯度中的分离效果取决于所用梯度浓度以及梯度层的铺设质量。若 mEVs 发生部分破裂,可能会出现在较早的组分中。相反,若步骤 2.3.2 所得沉淀未能充分重悬,则囊泡会形成致密的微小沉淀,从而出现在较晚的组分中。我们建议仅在需要评估哪些 1 mL 组分含有 mEVs 时,才精确收集各组分。用户可根据实际需要将组分分装为更小或更大的体积。当我们将 mEVs 用于某些特定应用时,例如测试其作为 BCG 潜在亚单位疫苗增强剂的效果,我们会将 mEVs 的收集体积限制在 mEVs 所在组分的 250 µL 以内,以便特异性地收集仅含 mEVs 的条带,并按 2.7.5 步骤进行后续处理。这有助于更有效地去除所有可能干扰下游实验的碘克沙醇残留。
  6. 第8天
    1. 合并含有mEV的组分,用HEPES缓冲液稀释至38 mL,于4℃下再次进行超速离心 oC,100,000 × g 条件下离心 16 小时 g将沉淀重悬于HEPES缓冲液或下游实验(未在此详述)所需的任何缓冲液中,如同步骤2.3.2所述,并遵循相同的注意事项;下游实验包括蛋白质定量、纳米颗粒追踪分析、负染色、透射电子显微镜、蛋白质印迹及免疫胶体金标记。
      ​注意:为了更好地重悬,使用超声波水浴仪对含有mEV的离心管进行10分钟超声处理。超声时间过长可能导致mEV破裂并造成完整mEV的损失。若样品已充分悬浮,则无需超声。从2.1至2.6的所有步骤在富集结核分枝杆菌(Mtb)来源的EV时均相同。

3. 重组mEVs的构建与富集。

注意:Msm 胞外囊泡(EV)中丰度最高的10种蛋白质之一(通过质谱鉴定)是 Cfp-2930。鉴于其分子量较小(29 kDa)、二级结构简单40、定位于膜上41,并且在无菌培养条件下易于分泌至培养基中(例如作为培养滤液蛋白;在 Msm 和 Mtb 中均可分泌42,43),本文利用该蛋白将红色荧光报告蛋白和一种目标蛋白(EsxAMtb)递送至 mEVs 中。为实现这一目的,

  1. 使用适当的正向和反向引物(表1;可直接克隆至穿梭载体(如 pMV261)中以进行扩增 cfp-29 来自 Msm。使用约 50 ng 的高分子量(约>20 kb)Msm 基因组 DNA 作为模板,通过 PCR 扩增目标片段 cfp-29 使用高保真校对DNA聚合酶(如Phusion或Q5)扩增基因片段。PCR操作请遵循制造商的推荐方案。
    注意:在引物设计中加入必要的限制性酶切位点,以便于克隆至任何感兴趣的替代穿梭载体中。PCR 反应条件和体系体积将根据所使用的高保真 DNA 聚合酶的类型和品牌而有所不同。反应体系的体积需根据 DNA 模板的用量和高保真 DNA 聚合酶的数量进行调整。请遵循制造商关于 PCR 条件、扩增效率以及引物非特异性结合消除的建议。
  2. 使用任何市售的PCR纯化试剂盒对洗脱的扩增产物进行纯化,并通过标准琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物长度。 消化纯化的扩增产物。
    1. 使用分光光度计估算纯化扩增产物的含量。 至少使用 2 µg cfp-29 用于消化的扩增子
    2. 先用 BstB1 在 65 ℃ 下进行消化 o37℃下孵育1小时(缓冲液和酶的类型及用量依照制造商推荐),将反应温度降至室温,然后在37℃下用HindIII消化1小时 oC(缓冲液的类型和用量以及酶的用量,按照制造商的建议)。
    3. PCR纯化并将消化后的扩增产物洗脱于50 µL经高压灭菌的无核酸酶水中。
    4. 使用分光光度计估算消化后扩增产物的浓度和产量。于 -20 ℃ 保存 oC,直至进行连接反应。注意:PCR 扩增后,取 10 µL PCR 反应混合物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳,以验证扩增片段长度(约 798 + 50 bp)和产量。尽管所用酶组合无法实现双酶切,但使用兼容缓冲液可避免重复进行 PCR 产物纯化,从而防止已酶切扩增片段的损失。酶切后扩增片段的浓度因所用 PCR 纯化试剂盒的不同而有所差异,同时也取决于所选替代载体的长度(以 bp 计)。
  3. 使用正向引物和反向引物(表1),一种具有校对功能的DNA聚合酶,以及约50 ng的结核分枝杆菌基因组DNA,进行PCR扩增 esxA- 或 esxA-3X FLAG-特异性扩增子。使用约5 ng的适当质粒DNA通过PCR扩增mCherry。质粒及序列详情见于 补充文件 1.
    注意:使用甘氨酸、甘氨酸、甘氨酸、甘氨酸、丝氨酸44,45(G4S) 连接子 cfp-29mCherry/esxA/esxA-3X FLAG 在mCherry起始之前,G4S连接子有助于防止mCherry发生非特异性无功能折叠(包括由Cfp-29驱动的折叠)。参考 cfp-29, hsp60 启动子, mCherry,以及 esxA 序列在 补充文件 1用作模板的质粒 mCherry 可在不同的质粒库/保藏中心获取。mCherry 存在多种不同版本(序列略有差异),需使用不同的正向和反向引物序列。这些引物 (表1) 有助于扩增前述的 mCherry 补充文件 1N端融合 mCherry/esxA/esxA::3XFLAG 在Cfp-29的C末端连接效果良好。
  4. 消化1 µg的DNA mCherry/esxA/esxA::3XFLAG 扩增子并纯化消化后的 DNA。
    1. 用HindIII和HpaI对每个扩增子进行双酶切,37℃孵育1小时 oC(或按照制造商的建议)。
    2. 使用市售的PCR纯化试剂盒,并按照生产商的说明纯化经消化的扩增产物。用50 µL经高压灭菌的无核酸酶的去离子水洗脱经消化的扩增产物。
    3. 使用分光光度计估算消化后扩增产物的浓度和产量。储存于 -20 o直至连接反应设置前均置于 C 保存。
  5. 消化 2 µg pMV261-KanR (补充文件 1)或选用合适的克隆载体及相应的限制性内切酶。
    1. 先用 BstB1 在 65 ℃ 下进行消化 oC下孵育1小时(缓冲液和酶的类型及用量参照制造商说明书),将反应温度降至室温,然后在37℃下用HindIII消化1小时 oC(缓冲液的类型和用量以及酶的用量,按照制造商的建议)。
    2. 凝胶纯化后,用 50 µL 经高压灭菌的无核酸酶双蒸水洗脱。
    3. 使用分光光度计估算消化后载体的浓度和产量。于 -20 ℃ 保存 oC,直至进行连接反应设置。
      注意:使用上述引物可对 pMV261 实现一步双片段克隆。任何能在宿主中以附加体质粒形式稳定存在的穿梭载体均可使用。整合型质粒也可行,但每细胞的重组蛋白表达量相对较低。
  6. 连接并转化至一种相容性菌株中 E. coli.
    1. 连接时使用 125 ng 载体。使用相应酶切消化的 mCherry/esxA/esxA::3XFLAG 扩增子以 1:3 的摩尔比混合。在 16 °C 冷却循环水浴中,使用 T4 DNA 连接酶(用量按制造商推荐)进行过夜连接反应。
      注意:应使用适当的对照,例如仅含载体且分别添加与不添加T4 DNA连接酶,以评估消化效率并预测克隆成功的效率。
    2. 转化
      1. 解冻 NEB将5α化学感受态细胞分装液(每次转化约100 µL)置于冰上孵育15分钟。用无菌移液器吸头轻轻吹打混匀两次。将连接反应产物(最多20 µL)加入冰冷的感受态细胞中。
      2. 轻轻吹打混合细胞与连接的DNA,冰上孵育额外30分钟。
      3. 在42 °C(循环水浴)下进行热激处理60秒,随后立即转移至冰上继续孵育15分钟。
      4. 通过加入1 mL SOC培养基(2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl₂)回收转化后的细胞2,10 mM MgSO₄4,以及 20 mM 葡萄糖),在 37 °C、200 rpm 条件下孵育 1 小时。
      5. 在1.5 mL 微量离心管中离心收集细菌(3000 × g,室温孵育10分钟,弃去上清液,将沉淀重悬于200 µL无菌、预热的新鲜配制LB培养基中,混匀后涂布于新制备的含适当浓度抗生素的LB Miller琼脂平板上。
      6. 将培养皿放入预设为37℃的培养箱中孵育 oC.
  7. 筛选潜在克隆(此处未详述),通过菌落PCR或限制性酶切验证46 并进行测序(Sanger测序)以确认融合。
  8. 提取已验证克隆的质粒DNA(约200 ng/1–2 µL;可使用任何市售试剂盒)E. coli 背景)并将其转化至新制备的耻垢分枝杆菌电转感受态细胞中。
  9. Msm 感受态细胞的制备
    1. 新鲜培养耻垢分枝杆菌(参照步骤1.2.1和1.2.2)。按照步骤1.3.3和1.3.4洗涤新培养的耻垢分枝杆菌(除使用7H9 + ADC + Tween-80(富集)替代Sauton培养基外)。
    2. 将一份洗涤后的 Msm 细胞加入至终 OD600 在含有150 mL丰富培养基的无菌500 mL三角瓶中,接种量约为0.05。
    3. 在37℃、200 rpm条件下于摇床培养箱中孵育 oC,直至培养物的OD600 达到约0.8至1.0(约12-14小时)。
    4. 将培养物转移至预冷的400 mL离心瓶中,冰上孵育60–90分钟。随后在4℃下离心收集细胞沉淀 o4,000 × g 条件下 15 分钟 g.
    5. 用150 mL溶液洗涤细胞两次(每次4,000 × g离心) g, 4 oC,以及15分钟)与冰冷的无菌(经高压灭菌)10%甘油混合。
      注意:每次离心洗涤后,沉淀物会变得松散。弃去上清液时需格外小心(每次洗涤后均需如此),否则大部分细胞将随弃去的上清液丢失。
    6. 用 75 mL 含 0.005% Tween-80 的冰冻无菌 10% 甘油洗涤细胞一次。
    7. 将细胞沉淀重悬于7.5 mL含10%甘油和0.005%Tween-80的溶液中,并分装为每份400 µL。
      注意:尽管耻垢分枝杆菌电转感受态细胞至少在4个月内保持感受态,但新鲜制备的感受态细胞转化效果最佳。使用存放时间较长的感受态细胞时,会出现少量非粉红色菌落(白色菌落),为假转化子。感受态细胞保存时间越长,假转化子数量越多 白色菌落
  10. Msm 的转化
    1. 将耻垢分枝杆菌感受态细胞分装液置于冰上解冻。
      注意:在室温下解冻并转化此类细胞会导致效率降低。
    2. 向冰冷的感受态细胞中加入1-2 µL质粒DNA(总量约200 ng),用1 mL无菌移液枪头轻轻混匀,转移至预冷的无菌2 mm电穿孔杯中。
    3. 将装有Msm感受态细胞与质粒DNA混合物的封闭比色皿放入电穿孔仪的小室中,轻轻合上盖子,设置参数为2.5 kV(电压)、25 µF(电容)和1000 Ω(电阻),施加一次指数衰减型电脉冲。
    4. 立即向比色皿中加入1 mL预热的无菌富集培养基(7H9 + ADC + Tween-80),用1 mL无菌移液器吸头轻轻混匀,并将全部内容物转移至一个10 mL无菌试管中。
    5. 在设定为37℃的摇床培养箱中孵育内容物3小时 oC 和 200 rpm。在微量离心管中以 4,000 × g,室温下静置10分钟,弃去上清液,将沉淀重悬于200 µL无菌预热的丰富培养基中,然后将悬液接种至新制备的含ADC、吐温-80及适当浓度所需抗生素的7H11琼脂平板上。
      注意:对于耻垢分枝杆菌(Msm),如需要,分别使用终浓度为 50 µg/mL 的潮霉素(Hygromycin)、25 µg/mL 的卡那霉素(Kanamycin)和 50 µg/mL 的安普霉素(Apramycin)。Msm 本身 对这些抗生素不具有抗性。仅在使用含有相应抗性基因的质粒时,才可使用这些抗生素来筛选或培养转化子/重组耻垢分枝杆菌菌落。
    6. 将培养皿放入已预设为37℃的培养箱中孵育 oC. 转化子通常在3至5天内出现。
      注意:如果目标蛋白对耻垢分枝杆菌(Msm)具有毒性,转化子可能出现较晚或无法出现。在此类情况下,可克隆全长蛋白的截短版本。
    7. 在确认出现阳性克隆后(步骤同3.7),对新生的耻垢分枝杆菌菌落制备甘油菌种保存液
  11. 为了富集含有 mCherry 或 EsxA 蛋白的 R-mEVs,首先培养表达 mCherry 或 exsAesxA::3X FLAG 按照步骤1.2.1至1.2.3操作,然后执行步骤2.1至2.6以富集R-mEVs。R-mEVs将洗脱至第4管中th-7th 密度梯度离心后组分(步骤2.5)。第一次超速离心步骤(2.3.1)后获得的R-mEVs沉淀。重复步骤2.3.1相同操作后,确认R-mEVs在超速离心管底部中央形成直径5–7 mm的深紫色至洋红色沉淀。
  12. 进行蛋白质印迹分析47 (未在此详述)以检测富集的R-mEVs中目标蛋白。

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结果

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我们使用 M. smegmatis 以耻垢分枝杆菌(Msm)作为模式分枝杆菌,用于展示天然及重组膜囊泡(R-mEVs)的富集过程。此为mEVs富集流程的示意图总结图1)也适用于Msm的R-mEVs以及Mtb的天然EVs的富集(具体细节见1.2节方案说明中的微小修改)。富集后的mEVs需通过透射电子显微镜负染色进行观察。36 (图 2A)。通常,Msm 特异性的 EVs 会在 4th-6th 13 mL 6-60% 密度梯度的 1 mL 分级组分(图2B)。通常从 2 L 的 Msm 对数中期无菌培养物中可获得约 80–100 µg 蛋白质当量的 EVs。其直径通常在 20 nm 至 250 nm 之间(图2C).

我们实验室的一个长期目标...

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讨论

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由于开发一种优于卡介苗(BCG)并能取代它的新型结核病疫苗仍面临巨大挑战,作为替代策略,多个研究团队正致力于发现不同的结核病亚单位疫苗,以增强BCG的效力并延长其保护持续时间48,49。鉴于细菌胞外囊泡(bEVs)作为潜在亚单位成分及天然佐剂正受到越来越多关注50,51,稳定富集足量的分枝杆菌胞外囊泡(mEVs)以用于后续检测与分析已成为关键步骤。本实验方案正是基于上述研究需求,旨在从无菌培养的分枝杆菌及其重组株中富集mEVs。

在对耻垢分枝杆菌(Msm)胞外囊泡(EVs)进行详细的质谱蛋白质组学分析时,Prados-Rosales 鉴定了丰度最高的10种蛋白质30。我们进一步推测,经过充分的分子改造后,其中任意一种蛋白应足以将目标外源蛋白带入mEVs中。有趣的是,Cfp-29因其...

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披露

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所有作者声明,本研究工作是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系/利益的情况下进行的。

致谢

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作者衷心感谢Sarah M. Fortune教授慷慨分享M. smegmatis mc2155菌株。同时感谢Servier医学艺术(smart.servier.com)为图1提供了一些基本图形元素。作者诚挚感谢实验室其他成员在进行mEV富集过程中长期使用摇床培养箱、离心机和超速离心机时所给予的耐心配合与支持。同时感谢实验室助理Surjeet Yadav先生始终确保必要的玻璃器皿和耗材充足且易于取用。最后,作者感谢THSTI行政、采购和财务团队在项目顺利实施过程中提供的持续支持与帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A2型生物安全柜Thermo Fisher Scientific, USA1300系列
台式离心机Eppendorf, USA5810 R
BstB1、HindIII、HpaINEB, USANEB
细胞密度计GE Healthcare, USAUltraspec 10
柠檬酸Sigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
磷酸氢二钾Sigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
双蒸水Merck, USA~18.2 MW/cm @ 25 oC
电穿孔比色皿Bio-Rad, USA2 mm
电穿孔仪Bio-Rad, USAElectroporator
EsxA特异性抗体Abcam, UK兔多克隆抗体
柠檬酸铁铵Sigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
落地式离心机Thermo Fisher Scientific, USASorvall RC6 plus
玻璃器皿Borosil, INDIA1 L 三角烧瓶
甘油Sigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
HEPES 和氯化钠Sigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
摇床培养箱Thermo Fisher Scientific, USAMaxQ 6000 & 8000
L-天冬酰胺Sigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
LB液体培养基和琼脂(Miller配方)Hi Media, INDIAHi Media
七水合硫酸镁Sigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
磁力搅拌器Tarsons, INDIATarsons
mCherry特异性抗体Abcam, UK兔单克隆抗体
微波炉LG, INDIAMC3286BLT
Middlebrook 7H9液体培养基BD, USADifco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC 增菌液BD, USABBL Middlebrook ADC enrichment
NanodropThermo Fisher Scientific, USASpectronic 200 UV-Vis
NEB5aNEB, USADH5a的衍生物
Optiprep (碘克沙醇)Merck, USA以60%水溶液形式提供
PCR纯化试剂盒Hi Media, INDIAHi Media
pH计Mettler Toledo, USAMettler Toledo
质粒DNA小量提取试剂盒Hi Media, INDIAHi Media
培养板孵育箱Thermo Fisher Scientific, USANew Series
质粒pMV261Addgene, USA *
*该  质粒  已  不  再在该质粒库中提供
穿梭载体
高保真DNA聚合酶Thermo Fisher Scientific, USAPhusion DNA Plus Polymerase
Q5高保真DNA聚合酶NEB, USANEB
制冷循环水浴锅Thermo Fisher Scientific, USAR20
Midddlebrook 7H11琼脂基础培养基BD, USABBL Seven H11 Agar base
SOC培养基Hi Media, INDIAHi Media
氢氧化钠Sigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
T4 DNA连接酶NEB, USANEB
吐温-80Sigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
超速离心机Beckman Coulter, USAOptima L100K
超速离心管 - 14 mLBeckman Coulter, USA聚全氟烷氧基树脂型 – SW40Ti转子用超透明型
超速离心管 - 38 mLBeckman Coulter, USA聚丙烯型– SW28转子用乳白色型
超声清洗水浴器Thermo Fisher Scientific, USA超声仪 - 台式型号
0.22 µm 一次性滤器Thermo Fisher Scientific, USANunc-Nalgene
30-kDa Centricon浓缩管Merck, USAAmicon Ultra离心滤器 - Millipore
3X FLAG抗体Sigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
400 mL离心瓶Thermo Fisher Scientific, USANunc-Nalgene
50 mL离心管Corning, USA无菌,预包装
细菌
菌株
大肠杆菌NEB, USANEB 5-alpha(DH5α的衍生物)。
表达cfp29::mCherry的Msm本研究MC2 155
表达cfp29::esxA的Msm本研究MC2 155
表达cfp29::esxA::3X FLAG的Msm本研究MC2 155
耻垢分枝杆菌 (Msm)哈佛大学 Sarah M. Fortune 教授,美国 MC2 155

参考文献

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Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 2/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

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