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方法文章

Bacillus subtilis 芽孢在流式细胞术中计数与标记分析的改进

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DOI：

10.3791/65141

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2023年6月30日

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1Laboratório de diagnóstico e controle de doenças infecciosas na Amazônia, Instituto Leônidas e Maria Deane - Fiocruz Amazônia, 2Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro - Fiocruz Amazônia, 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia PPGH-UEA/HEMOAM, 5Department of Biology, Federico II University, 6Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 7Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à saúde, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ Rondônia, 8Centro Multiusuário para Análises de Fenômenos Biomédicos (CMABio-UEA), Universidade Estadual do Amazonas, 9Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

本文内容

摘要

本方案重点介绍使用流式细胞术和计数微球对溴化乙锭标记的细菌孢子进行定量分析。该方法还可高效分析完整孢子表面蛋白质的共价偶联情况。

摘要

Bacillus subtilis 的孢子已被提议用于多种生物技术和免疫学应用；然而，目前迫切需要开发能够提高固定在孢子表面抗原的检测灵敏度并实现其定量的方法。基于流式细胞术的分析方法此前已被提出，可作为快速、可靠且特异地检测标记的 B. subtilis 细胞的有效手段。本文中，我们提出利用流式细胞术评估荧光抗体（FA）在孢子表面展示效率，并结合计数微球对孢子数量进行定量。

为此，我们使用溴化乙锭作为DNA标记物，以及藻红蛋白别藻蓝蛋白（APC）标记的抗体作为表面标记物，该抗体与孢子偶联。孢子的定量采用计数微球法进行，因为该技术在细胞检测中具有较高的准确性。使用流式细胞仪分析标记后的孢子，以确认偶联效果。结果表明，DNA标记可提高流式细胞术对萌发孢子检测的定量准确性。观察发现，溴化乙锭无法标记休眠状态的孢子；然而，该技术能够更精确地确定表面偶联荧光蛋白的孢子数量，从而有助于推动以孢子作为生物技术平台在不同应用领域中的相关研究。

引言

Bacillus subtilis 是一种杆状的革兰氏阳性细菌，当环境条件不适合细胞生长时，能够形成休眠孢子1。孢子是极为稳定的细胞形态，包括 B. subtilis 在内的多种细菌孢子被广泛用作人和动物的益生菌2。由于其具有抗逆性和安全性，表面展示异源蛋白的 B. subtilis 孢子已被提出可作为黏膜佐剂、疫苗递送系统以及酶固定化平台3,4。

为了获得 B. subtilis的芽孢，必须使用特殊的培养基对其进行营养剥夺处理。在获得并纯化这些芽孢后，必须对其进行定量，以提高检测效率5,6。因此，需采用某些方法来分析所获得芽孢的浓度。可使用平板计数法或Petroff-Hausser计数室（也称为计数板）进行计数。后者最初用于测定血细胞浓度，但也可用于微生物学领域的芽孢计数7,8。尽管该方法是细胞计数的标准方法，但其读数过程较为繁琐，因为该方法完全依赖人工操作，且准确性取决于操作者的经验。

基于流式细胞术（FC）的分析方法此前已被提出，作为快速、可靠且特异地检测标记的芽孢杆菌属（Bacillus spp.）细胞的有效手段。流式细胞术计数微球的使用已在常规检测（如CD4和CD8 T淋巴细胞的绝对计数）以及涉及可被流式细胞术检测和计数颗粒的研究中，确保了细胞计数的可重复性9。Godjafrey和Alsharif建议使用计数微球对未标记的芽孢进行FC定量分析10。已有研究描述通过 标记芽孢DNA，利用流式细胞术监测芽孢杆菌属（Bacillus spp.）的产孢过程10,11,12,13。另有研究采用FC评估芽孢表面荧光标记蛋白的含量15。

本研究旨在利用商用计数微球，通过流式细胞术进行事件计数时确保可重复性的标准。本文建议在流式细胞术（FC）中使用计数微球进行细胞计数，以优化孢子计数并评估荧光标记抗体在孢子表面的偶联效率。

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方案

有关本实验方案中使用的所有材料、仪器和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 流式细胞术设置

  1. 连接至计算机的流式细胞仪光学参数校准
    1. 登录流式细胞仪软件。
    2. 在软件工作区中，选择 细胞仪 | 启动，等待数分钟，进入 | 清洗模式 | 液体就绪。
      ​注意：在开始采集样本前，细胞仪启动过程中已去除气泡和堵塞物。
  2. 质量控制
    1. 使用质量控制试剂调节光电倍增管的电压，并评估其灵敏度。
      1. 在聚苯乙烯管中制备质量控制试剂。
      2. 为确定基线，向已标记的试管中加入 0.5 mL 稀释液（10 mM 过滤 PBS，pH 7）和 3 滴微球，制备悬浮微球。
      3. 轻轻翻转混匀微球管。
    2. 在软件工作区中，选择 细胞仪 | CST 以连接至 CST 界面。等待数分钟后，观察显示信息 细胞仪已断开连接。
    3. 将含有质量控制试剂的聚苯乙烯管连接至流式细胞仪探针。
  3. 细胞仪配置验证
    1. 在 系统摘要 窗口中，确认细胞仪配置适用于本实验。
    2. 选择相应的设置微球批次编号，以确认所选设置微球批号与当前 CS&T 研究微球批次一致。
  4. 性能检测
    1. 选择 检测性能 选项，然后点击 运行。
    2. 性能检测完成后，将显示检测结果。查看 细胞仪性能报告。可点击 完成 结束性能检测，或从细胞仪上取下试管，并在 系统摘要 窗口中查看结果。
    3. 观察形态学参数和荧光灵敏度分析的最终结果，该结果将显示在 | 系统摘要 | 细胞仪性能结果 | 中，状态为：PASSED

2. 孢子的制备

  1. 孢子形成后，用超纯冰水通过离心洗涤孢子3次，每次在17,949 × g 条件下离心10分钟。
  2. 用10 mL超纯水重悬最后一次离心所得的沉淀。
  3. 将孢子在121 ºC条件下高压灭菌45分钟，以灭活营养细胞。
    注意：本课题组此前比较不同灭活方法的试验结果表明，步骤2.3中所述条件具有高效灭活效果，在LB琼脂培养基平板分析法中未观察到菌落形成。

3. 使用流式细胞术定量高压灭菌的孢子

  1. 取 50 µL 经高压灭菌的孢子，加入溴化乙锭（EtBr，10 mg/mL 溶于水）至终浓度为 0.05%（v/v），避光孵育 30 分钟（图 1A）。
  2. 用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤孢子 3 次，每次在 17,949 × g 离心 10 分钟，然后将孢子重悬于 1× PBS 中。
  3. 加入 10 µL 微球，稀释比例遵循制造商推荐方案。
  4. 按照步骤 4 所述方法，使用流式细胞仪分析样品。
    ​注意：必须强调，微球应尽可能均匀地移取，因为若此步骤操作不当，会导致计算结果出现偏差。

4. 使用流式细胞术进行分析

  1. 登录细胞仪软件。
  2. 在软件工作区中，选择 细胞仪 | 清洗模式 | 保持液体。
  3. 调整工作区以确定流式细胞术中的分析。
    1. 根据阴性对照（未标记孢子）的形态学和荧光特性定义分析门控（图2）。
      1. 基于阴性对照（未标记孢子）的颗粒形态学和荧光特性，确定门控策略。
    2. 为确定细胞形态学，选择 点图图形，将 FSC-A 参数设为横轴，SSC-A 设为纵轴 进行分析。
    3. 为确定荧光信号，选择 FL3 点图作为纵轴，FL5 作为横轴，并在四个象限中创建门控。
  4. 使用一个 12 x 75 mm 带塞聚苯乙烯试管，其中含有未标记样本，以及先前用单色 EtBr、单色 APC 和多色 EtBr+APC 标记的样本。
  5. 轻轻混匀含有阴性对照的试管，并将其连接至流式细胞仪探针。
  6. 点击 采集。
  7. 通过导航至 细胞仪 | 参数 | FSC (375) 和 SSC (275) 设置激光功率。
  8. 将阈值设为 (500) 细胞仪 | 阈值。
  9. 为消除自发荧光，分析仅含孢子且不含染料的样本。
  10. 调整滤光检测器的电压：FL3 (603) 和 FL5 (538)，以便根据对照中选定的荧光区分阴性和阳性群体。细胞仪 | 参数。
  11. 细胞仪 | 补偿 | 将 FL5/FL3 设置偏移 设为 1.0。
  12. 完成形态学和荧光分析后，配置仪器进行数据采集，设置为 30,000 个事件 | 实验 | 实验布局 | 采集 |30,000 个事件…。
  13. 参数调整完毕后，在流式细胞仪中采集已标记样本及含微球样本的数据。
  14. 按照制造商说明书中的公式（1）计算孢子浓度。
    细胞计数中的静态平衡；公式：A=(X/Y)×(N/V)；示意图；科学计算。    (1)
    注：本研究中，将微球定量法与 Petroff-Hausser 计数室分析法进行了比较。此外，还比较了高压灭菌孢子与未高压灭菌孢子的标记效果。

5. 使用流式细胞术估算孢子表面的蛋白质偶联指数

  1. 取50 µL孢子（103/µL）在17,949 × g条件下离心10分钟，收集孢子，然后用25 µL的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）（300 mM）重悬。
  2. 室温孵育15分钟。
  3. 向孢子悬液中加入25 µL的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠（NHS）（50 mM），室温孵育30分钟。
  4. 用1× PBS按步骤5.1所述方法离心洗涤孢子3次。
  5. 加入荧光蛋白，15 °C过夜孵育。
    注意：本研究中使用的荧光蛋白为APC标记的抗人IL-10抗体。该抗体作为研究模型使用，但由于EDC/NHS可促进孢子表面蛋白上的-COOH与-NH2基团之间形成共价连接，因此也可应用其他荧光分子。
  6. 按步骤5.3所述方法洗涤孢子。
  7. 加入10 mg/mL溴化乙锭，按1:50稀释，冰上避光孵育1小时（图1B）。
  8. 按步骤5.3所述方法洗涤孢子。
  9. 重复步骤4。
  10. 为检测荧光，调整点图中X轴的FL3和Y轴的FL5参数。
  11. 使用流式细胞仪分析样品，采用蓝色激光（488 nm）检测FL3（670 LP滤光片），以及红色激光（633 nm）检测FL5（660/20滤光片），具体操作如步骤4所述。
    注意：相同样品也在显微镜下进行载玻片免疫荧光分析，放大倍数为1,000倍，使用以下滤光片：FITC 480/30 nm（绿色）和TRITC 540/25 nm（红色）。

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结果

在灭菌孢子（AS）样品中，2 × 103 孢子/µl 和 1 × 103 孢子/µl 分别通过计数珠和Petroff-Hausser法进行检测（图2).

流式细胞术实验设置：溴化乙锭孵育、孢子定量、荧光蛋白偶联。
图1：孢子定量的总体方案。（A）经EtBr标记的孢子和（B）双标记孢子。缩写：EDC = 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；NHS = N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠。

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讨论

传统方法（如菌落平板计数）不仅耗时，而且需要活细胞，无法对失活的孢子进行定量5。佩特里夫-豪泽计数室是一种替代方法，但其操作需要经验丰富的显微镜技术人员。流式细胞术已被证明是实现该目的的一种有效替代方法。

Genovese 等人12描述了使用流式细胞术结合两种核酸标记物，并通过精确控制所用仪器的流速（体积/分钟），对芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的活细胞和芽孢进行定量分析，该方法可设定具体的数值参数。并非所有流式细胞仪都能严格控制流速（体积/分钟），部分仪器仅能选择最低、中等或最高档位。在此类情况下，可使用计数微球以确保细胞计数的准确性，并实现不同流式细胞仪之间的结果可重复性。通过本方法，本研究成功计算出样品中每毫升所含芽孢（包括萌发和休眠状态）的数量。

根据Godfrey和Alsharif专利中描述的参数10对孢子群体进行计数和分析。这些作者描述了该方法在分...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究部分由巴西高等教育人员进修协调机构（CAPES）-资助代码001、亚马孙州政府通过亚马孙州研究支持基金会（FAPEAM）提供的资源以及国家科学技术发展委员会（CNPq）资助。 作者感谢健康工具技术发展计划PDTIS-FIOCRUZ提供设施使用支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide, NHS）Sigma130672
抗人荧光抗体BioLegend501410APC 抗人 IL-10
抗小鼠荧光抗体赛默飞世尔科技A32723Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II BD流式细胞仪
BD FACSDiva 细胞仪设置 & 追踪微球试剂盒（与BD FACSDiva软件v 6.x联用）BD642412质控试剂
BD FACSDiva 软件 v. 6.1.3BD643629软件
Centrifuge MegaFuge 8R赛默飞世尔科技75007213
计数微球BD340334TruCount 管
Eclipse 80i尼康荧光显微镜
溴化乙锭Ludwig Biotec
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichA4503
塑料微量离心管Eppendorf
聚苯乙烯管Falcon3520085 mL 聚苯乙烯试管，12 × 75 mm，无盖，非无菌

参考文献

  1. McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
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