本方案重点介绍使用流式细胞术和计数微球对溴化乙锭标记的细菌孢子进行定量分析。该方法还可高效分析完整孢子表面蛋白质的共价偶联情况。
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本文内容
摘要
摘要
Bacillus subtilis 的孢子已被提议用于多种生物技术和免疫学应用；然而，目前迫切需要开发能够提高固定在孢子表面抗原的检测灵敏度并实现其定量的方法。基于流式细胞术的分析方法此前已被提出，可作为快速、可靠且特异地检测标记的 B. subtilis 细胞的有效手段。本文中，我们提出利用流式细胞术评估荧光抗体（FA）在孢子表面展示效率，并结合计数微球对孢子数量进行定量。
为此，我们使用溴化乙锭作为DNA标记物，以及藻红蛋白别藻蓝蛋白（APC）标记的抗体作为表面标记物，该抗体与孢子偶联。孢子的定量采用计数微球法进行，因为该技术在细胞检测中具有较高的准确性。使用流式细胞仪分析标记后的孢子，以确认偶联效果。结果表明，DNA标记可提高流式细胞术对萌发孢子检测的定量准确性。观察发现，溴化乙锭无法标记休眠状态的孢子；然而，该技术能够更精确地确定表面偶联荧光蛋白的孢子数量，从而有助于推动以孢子作为生物技术平台在不同应用领域中的相关研究。
引言
Bacillus subtilis 是一种杆状的革兰氏阳性细菌，当环境条件不适合细胞生长时，能够形成休眠孢子1。孢子是极为稳定的细胞形态，包括 B. subtilis 在内的多种细菌孢子被广泛用作人和动物的益生菌2。由于其具有抗逆性和安全性，表面展示异源蛋白的 B. subtilis 孢子已被提出可作为黏膜佐剂、疫苗递送系统以及酶固定化平台3,4。
为了获得 B. subtilis的芽孢，必须使用特殊的培养基对其进行营养剥夺处理。在获得并纯化这些芽孢后，必须对其进行定量，以提高检测效率5,6。因此，需采用某些方法来分析所获得芽孢的浓度。可使用平板计数法或Petroff-Hausser计数室（也称为计数板）进行计数。后者最初用于测定血细胞浓度，但也可用于微生物学领域的芽孢计数7,8。尽管该方法是细胞计数的标准方法，但其读数过程较为繁琐，因为该方法完全依赖人....
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方案
有关本实验方案中使用的所有材料、仪器和软件的详细信息，请参见材料表。
1. 流式细胞术设置
- 连接至计算机的流式细胞仪光学参数校准
- 登录流式细胞仪软件。
- 在软件工作区中，选择 细胞仪 | 启动，等待数分钟，进入 | 清洗模式 | 液体就绪。
注意：在开始采集样本前，细胞仪启动过程中已去除气泡和堵塞物。
- 质量控制
- 使用质量控制试剂调节光电倍增管的电压，并评估其灵敏度。
- 在聚苯乙烯管中制备质量控制试剂。
- 为确定基线，向已标记的试管中加入 0.5 mL 稀释液（10 mM 过滤 PBS，pH 7）和 3 滴微球，制备悬浮微球。
- 轻轻翻转混匀微球管。
- 在软件工作区中，选择 细胞仪 | CST 以连接至 CST 界面。等待数分钟后，观察显示信息 细胞仪已断开连接。
- 将含有质量控制试剂的聚苯乙烯管连接至流式细胞仪探针。
- 使用质量控制试剂调节光电倍增管的电压，并评估其灵敏度。
- 细胞仪配置验证 <....
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结果
在灭菌孢子（AS）样品中，2 × 103 孢子/µl 和 1 × 103 孢子/µl 分别通过计数珠和Petroff-Hausser法进行检测（图2).
图1：孢子定量的总体方案。（A）经EtBr标记的孢子和（B）双标记孢子。缩写：EDC = 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；NHS = N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠。
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讨论
传统方法（如菌落平板计数）不仅耗时，而且需要活细胞，无法对失活的孢子进行定量5。佩特里夫-豪泽计数室是一种替代方法，但其操作需要经验丰富的显微镜技术人员。流式细胞术已被证明是实现该目的的一种有效替代方法。
Genovese 等人12描述了使用流式细胞术结合两种核酸标记物，并通过精确控制所用仪器的流速（体积/分钟），对芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的活细胞和芽孢进行定量分析，该方法可设定具体的数值参数。并非所有流式细胞仪都能严格控制流速（体积/分钟），部分仪器仅能选择最低、中等或最高档位。在此类情况下，可使用计数微球以确保细胞计数的准确性，并实现不同流式细胞仪之间的结果可重复性。通过本方法，本研究成功计算出样品中每毫升所含芽孢（包括萌发和休眠状态）的数量。
根据Godfrey和Alsharif专利中描述的参数10对孢子群体进行计数和分析。这些作者描述了该方法在分.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究部分由巴西高等教育人员进修协调机构（CAPES）-资助代码001、亚马孙州政府通过亚马孙州研究支持基金会（FAPEAM）提供的资源以及国家科学技术发展委员会（CNPq）资助。 作者感谢健康工具技术发展计划PDTIS-FIOCRUZ提供设施使用支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide, NHS） | Sigma | 130672 | |
| 抗人荧光抗体 | BioLegend | 501410 | APC 抗人 IL-10 |
| 抗小鼠荧光抗体 | 赛默飞世尔科技 | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | 流式细胞仪 | |
| BD FACSDiva 细胞仪设置 & 追踪微球试剂盒（与BD FACSDiva软件v 6.x联用） | BD | 642412 | 质控试剂 |
| BD FACSDiva 软件 v. 6.1.3 | BD | 643629 | 软件 |
| Centrifuge MegaFuge 8R | 赛默飞世尔科技 | 75007213 | |
| 计数微球 | BD | 340334 | TruCount 管 |
| Eclipse 80i | 尼康 | 荧光显微镜 | |
| 溴化乙锭 | Ludwig Biotec | ||
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| 塑料微量离心管 | Eppendorf | ||
| 聚苯乙烯管 | Falcon | 352008 | 5 mL 聚苯乙烯试管，12 × 75 mm，无盖，非无菌 |
参考文献
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
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