含生物活性剂纳米盘的制备与表征

摘要

本文介绍了含有纳米盘的生物活性物质的制备与表征方法。以两性霉素B纳米盘为例，逐步描述了该实验方案。

摘要

纳米盘（nanodisk）指的是一种由双层形成脂质、支架蛋白和整合的生物活性物质组成的离散型纳米颗粒。纳米盘的结构为盘状脂质双层，其周边由支架蛋白环绕，该蛋白通常属于可交换载脂蛋白家族。许多疏水性生物活性物质通过整合入颗粒脂质双层的疏水微环境中，已在纳米盘中实现高效增溶，从而产生直径在10–20 nm范围内、高度均一的颗粒群体。纳米盘的制备需要精确控制各组分的比例，按适当顺序依次加入各组分，随后对混合物进行水浴超声处理。两亲性支架蛋白会自发结合并重组分散的脂质双层/生物活性物质混合物，形成离散且均一的纳米盘 颗粒。在此过程中，反应混合物的外观从不透明、浑浊逐渐转变为澄清的溶液，在优化充分的情况下，经离心后不会产生任何沉淀。表征研究包括测定生物活性物质的增溶效率、电子显微镜分析、凝胶过滤色谱、紫外-可见（UV/Vis）吸收光谱和/或荧光光谱分析。随后通常还需利用培养细胞或小鼠进行生物学活性检测。对于携带抗生素（如大环内酯类多烯抗生素两性霉素B）的纳米盘，可测定其在不同浓度或时间条件下抑制酵母或真菌生长的能力。由于纳米盘制备简便、组分灵活、颗粒尺寸处于纳米级、本身具有稳定性且可在水相中溶解，因此适用于多种体外（in vitro）和体内（in vivo）应用。本文中，我们描述了一种通用的方法，用于制备和表征以两性霉素 B作为疏水性生物活性物质的纳米盘。

引言

新生盘状高密度脂蛋白（HDL）是人体循环系统中更为丰富的球形HDL的天然前体。这些新生颗粒也被称为前β-HDL，具有独特而显著的结构特性¹。事实上，新生HDL并非球形颗粒，而是呈盘状。对天然及重组盘状HDL的大量结构表征研究表明，它们由一层磷脂双分子层构成，其边缘由两亲性可交换载脂蛋白（apo）如apoA-I环绕。在人体脂蛋白代谢过程中，循环中的新生HDL从外周细胞摄取脂质，并在关键蛋白介质（包括ATP结合盒转运蛋白A1和卵磷脂：胆固醇酰基转移酶）的作用下成熟为球形HDL²。该过程是逆向胆固醇转运通路的关键组成部分，被认为对预防心脏病具有保护作用。基于这些认识以及重组盘状HDL的技术能力，研究人员已将这类颗粒用作治疗动脉粥样硬化的干预手段³。本质上，将重组HDL（rHDL）输注给患者可促进胆固醇从斑块沉积中流出，并将其运回肝脏转化为胆汁酸后排出体外。目前已有数家生物技术/制药公司正在推进这一治疗策略⁴。

与此同时，在实验室中制备这些颗粒的能力已引发大量研究活动，推动了新应用和新技术的发展。其中一个重要的应用是利用重组高密度脂蛋白（rHDL）颗粒作为微型膜结构，为跨膜蛋白提供类似天然的环境⁵迄今为止，已有数百种蛋白质被成功整合到盘状重组高密度....

方案

1. 支架蛋白组分的转化、表达与纯化

1. 含apoE4-NT质粒的BL21细菌转化
   1. 将一管BL21 (DE3)感受态细胞置于冰上解冻10分钟。
   2. 待所有冰融化后，轻轻混匀，并小心吸取50 µL细胞悬液加入预置在冰上的转化管中。
   3. 加入5 µL含有50 ng的质粒DNA（序列见 补充表 1) 加入细胞混合物中，轻轻弹击管壁4到5次以混匀，切勿涡旋震荡。
   4. 将混合物置于冰上30分钟。
   5. 将混合物在恰好 42 °C 下热激 10 秒。
   6. 置于冰上5分钟。
   7. 将950 µL的S.O.C.培养基用移液器加入室温的离心管中。
   8. 将试管置于37 °C摇床培养箱中，以250 rpm振荡孵育60分钟。
   9. 轻轻敲击并倒置混匀细胞，然后取100 µL细胞溶液均匀涂布于含氨苄青霉素（终浓度0.1 mg/mL）的20 mL LB琼脂选择性平板上。
   10. 37 °C 下孵育过夜，或孵育至可见菌落形成。
2. 使用电子移液器，在室温下将25 mL无菌NZCYM培养基转移至一个无菌的250 mL锥形瓶中，并加入氨苄青霉素，使其终浓度为0.1 mg/mL。
3. 使用无菌接种环，从含有相应转化菌株的筛选平板上挑取单个菌落，并直....

结果

生物活性物质纳米盘制剂制备过程
在所述的两性霉素B（ampB）-纳米盘制剂制备过程中，当样品外观由浑浊变为澄清时，即认为反应已完成（图1）。该变化表明纳米盘已形成，且生物活性物质已被溶解。许多生物活性物质在可见光波长范围内具有吸光性（例如ampB、姜黄素、叶黄素、辅酶Q₁₀），在此类情况下，样品会呈现该生物活性物质的颜色。一旦样品澄清完成（通常需5–20分钟水浴超声处理），将样品转移至1.7 ml微量离心管中，在11,000 × g 条件下离心5分钟，以沉淀不溶性物质。若无可见沉淀物，可作为有力证据表明生物活性物质已成功包载于纳米盘中；反之，若出现沉淀物，则表明生物活性物质部分或完全未被包载。如有必要或有助于分析，可平行制备仅含双层形成脂质和支架蛋白的对照制剂，并通过肉眼观察或使用分光光度计进行定量比较，评估两种样品的澄清程度。无论何种情况，在含有生物活性物质的纳米盘样品完成离心后，均需将其对磷酸盐缓冲液（PBS）或其他适当缓冲液进行透析，以去除残留溶剂。

讨论

含有生物活性成分的纳米盘制剂提供 了一种便捷的方法，用于增溶原本不溶的疏水性化合物。由于成品生物活性成分纳米盘在水相介质中完全可溶，因此为多种疏水性分子提供了有效的递送方式（表1）。这些分子包括小分子、天然和合成药物、植物营养素、激素等。该制剂策略通常遵循标准操作流程，且必须考虑生物活性成分在有机溶剂中的溶解特性。除了选择合适的有机溶剂以溶解生物活性成分外，还需满足两个额外参数：制备浓度约为20 mg/mL的储备液，并确保该溶剂与水溶液具有良好的混溶性。这是必要的，因为它能够在不引入过量有机溶剂的前提下，向制剂混合物中加入足量的生物活性成分。混溶性至关重要，因为若发生相分离，将阻碍生物活性成分掺入最终的纳米盘产品中。

在选定的缓冲液中，于双层形成性磷脂分散后立即引入生物活性试剂，可使这些组分在添加支架蛋白之前相互作用。在添加支架蛋白之前以及刚添加之后，样品呈现为不透明的悬浮液。然而，当三种组分（磷脂、生物活性试剂和支架蛋白，按5/1/2的质量比）均加入，并在适当温度下进行足够时间的水浴超声处理后，样品外观会从浑浊变为澄清。如果生物活性试剂.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素B	Cayman Chemical Company	11636	ND制剂 &和标准制备
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP17925	转化 &扩增与扩增
ApoE4-NT 质粒	GenScript	N/A	转化
带挡板锥形瓶	新不伦瑞克科学公司	N/A	扩增 &与表达
BL21 感受态大肠杆菌	New England Biolabs	C2527I	转化
离心管	Nalgene	3140-0250	表达
氯仿	Fisher Scientific	G607-4	ND制剂
DMSO	Sigma Aldrich	472301	标准制备
二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱	Avanti Lipids	850345P	ND配方
锥形瓶	Bellco Biotechnology	N/A	扩增 &和表达
Falcon 管	Sarstedt Ag & 公司	D51588	酵母活力检测
玻璃硼硅酸盐管	VWR	47729-570	ND制剂
GraphPad（软件）	Dotmatics	N/A	酵母活力检测
加热超声波清洗浴	VWR	N/A	ND配方
加热与氮气模块	赛默飞世尔科技	TS-18822	ND 配方
HiTrap Heparin HP（5 mL）	GE Healthcare	17-0407-03	纯化
异丙基 βD-1-硫代半乳糖吡喃糖苷	Fisher Scientific	BP1755	表达
J-25 离心机	贝克曼库尔特	J325-IM-2	表达
JA-14 转子	贝克曼库尔特	339247	表达
冻干机	Labconco	7755030	ND制剂
甲醇	Fisher Scientific	A452-4	ND制剂
氮气	普莱克斯	UN1066	ND配方
NZCYM 培养基	RPI 研究产品	N7200-1000.0	扩增 &与表达
Pet-22B 载体	GenScript	N/A	转化
培养皿	Fisher Scientific	FB0875718	转化 &扩增与扩增
石英比色皿	Fisher Brand	14385 928A	光谱分析
摇床培养箱	新不伦瑞克科学公司	M1344-0004	转化、扩增 &与表达
Slide-A-Lyzer 浮标	赛默飞世尔科技	66430	纯化
SnakeSkin 透析管	赛默飞世尔科技	68100	纯化
SnakeSkin透析管	赛默飞世尔科技	88243	纯化
氯化钠	Fisher Scientific	S271	纯化
磷酸氢二钠	Fisher Scientific	S374-500	纯化
磷酸二氢钠	Fisher Scientific	BP329-500	纯化
Spectra/POR 加权封口器	Spectrum Medical Industries	132736	纯化
分光光度计	岛津 UV-1800	220-92961-01	光谱分析
台式离心机	贝克曼库尔特	366816	ND 配方
UVProbe 2.61（软件）	岛津	N/A	光谱分析
真空过滤器	默克密理博	9004-70-0	表达 &纯化
真空泵	GAST 制造公司	DOA-P704-AA	表达 &纯化
涡旋混合	Fisher Scientific	12-812	ND 配方
酵母	N/A	BY4741	酵母活力检测
酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖	BD	242820	酵母活力检测