含纳米片生物活性剂的配制与表征

Summary

在这里，我们描述了含有纳米盘的生物活性剂的生产和表征。以两性霉素B纳米盘为例，逐步描述该方案。

Abstract

术语纳米盘是指由双层形成脂质、支架蛋白和集成生物活性剂组成的离散类型的纳米颗粒。纳米盘被组织成圆盘状的脂质双层，其周边由支架蛋白限制，支架蛋白通常是可交换载脂蛋白家族的成员。许多疏水性生物活性剂通过集成到颗粒脂质双层的疏水环境中，在纳米盘中有效地溶解，产生了直径为10-20nm的颗粒群。纳米盘的配制需要单个组分的精确比例，每种组分的适当顺序添加，然后对配方混合物进行浴超声处理。两亲性支架蛋白自发接触并重组分散的双层形成脂质/生物活性剂混合物，形成离散、均匀的纳米盘颗粒群。在此过程中，反应混合物从不透明、浑浊的外观转变为澄清的样品，当完全优化时，离心时不会产生沉淀。表征研究涉及生物活性剂增溶效率的测定、电子显微镜、凝胶过滤色谱、紫外可见（UV/Vis）吸光光谱和/或荧光光谱。随后通常使用培养的细胞或小鼠研究生物活性。在含有抗生素（即大环内酯类多烯类抗生素两性霉素B）的纳米盘的情况下，可以测量它们作为浓度或时间函数抑制酵母或真菌生长的能力。相对容易配制、相对于组分的多功能性、纳米级粒径、固有稳定性和水溶性允许纳米盘技术的无数体 外 和 体内 应用。在本文中，我们描述了一种配制和表征含有两性霉素B作为疏水生物活性剂的纳米盘的一般方法。

Introduction

新生的盘状高密度脂蛋白（HDL）是人体循环系统中更丰富的球形高密度脂蛋白的天然祖先。这些新生颗粒，也称为pre-ß HDL，具有独特而独特的结构特性¹。事实上，新生的HDL不是作为球状粒子存在的，而是圆盘状的。对天然和重组盘状高密度脂蛋白的广泛结构表征研究表明，它们由磷脂双层组成，其周长由两亲性可交换载脂蛋白（apo）限制，例如apoA-I。在人脂蛋白代谢中，循环的新生高密度脂蛋白从外周细胞中积累脂质，并在依赖于关键蛋白质介质的过程中成熟为球形高密度脂蛋白，包括ATP结合盒转运蛋白A1和卵磷脂:胆固醇酰基转移酶²。这个过程代表了反向胆固醇转运途径的关键组成部分，被认为可以预防心脏病。有了这些知识和重建盘状HDL的能力，研究人员将这些颗粒用作治疗动脉粥样硬化的治疗^{干预措施3。}从本质上讲，将重组高密度脂蛋白（rHDL）输注到患者中会促进胆固醇从斑块沉积物中排出，并将其返回到肝脏以转化为胆汁酸并从体内排泄。一些生物技术/制药公司正在推行这种治疗策略⁴。

与此同时，在实验室中产生这些粒子的能力引发了一系列研究活动，导致了新的应用和新技术。一个突出的应用涉及使用rHDL颗粒作为微型膜，在天然环境中容纳跨膜蛋白⁵。迄今为止，已有数百种蛋白质成功掺入盘状....

Protocol

1. 支架蛋白组分的转化、表达和纯化

1. BL21 细菌转化与含 apoE4-NT 的质粒
   1. 将一管BL21（DE3）感受态细胞在冰上解冻10分钟。
   2. 所有冰融化后，轻轻混合并小心地将 50 μL 细胞移液到冰上的转化管中。
   3. 向细胞混合物中加入含有 50 ng 质粒 DNA（有关序列，参见 补充表 1）的 5 μL。小心地轻弹试管四到五次以混合。不要涡旋。
   4. 将混合物放在冰上30分钟。
   5. 在42°C下对混合物进行热冲击10秒。
   6. 放在冰上5分钟。
   7. 在室温下将 950 μL S.O.C. 培养基移液到管中。
   8. 将管置于37°C振荡培养箱中60分钟，振荡设置为250rpm。
   9. 通过轻弹和倒置将细胞彻底混合，然后将 100 μL 细胞溶液铺在用氨苄青霉素处理的 20 mL Luria 肉汤 + 琼脂选择板上，浓度为 0.1 mg/mL。
   10. 在37°C孵育过夜，或直到可见菌落生长。
2. 使用电动移液器，在室温下将 25 mL 无菌 NZCYM 培养基转移到无菌的 250 mL 锥形烧瓶中，并加入氨苄西林至终工作浓度为 0.1 mg/mL。
3. 使用无菌接种环，从含有适当转化的细菌菌株的选择板中转移一个单独的菌....

Results

生物活性剂纳米盘配制工艺
在所描述的ampB-纳米盘配制程序中，当样品外观从浑浊转变为透明时，反应被认为是完成的（图1）。这种变化表明纳米盘已经形成并且生物活性剂已经溶解。通常，生物活性剂吸收可见波长区域的光（例如，ampB，姜黄素，叶黄素，辅酶Q₁₀），在这些情况下，样品采用生物活性剂的颜色。样品澄清完成后（通常为浴超声处理5-20分钟），将样品转移到1.7ml微量离心管中，并以11，000× g 离心5分钟以沉淀不溶性物质。没有可见的颗粒可以被认为是生物活性剂已被掺入纳米盘的有力证据。另一方面，颗粒的出现表明部分或没有发生生物活性剂掺入。如果必要或有用，仅可以并行进行含有双层形成脂质和支架蛋白的对照制剂，并且使用分光光度计对两个样品的澄清程度进行目视和定量比较。在任何情况下，在离心含有纳米盘的生物活性剂后，将样品透析至PBS或其他适当的缓冲液上，以除去痕量的溶剂。

生物活性剂增溶效率分析
为了说明如何.......

Discussion

含有纳米盘的生物活性剂的配制提供了一种溶解否则不溶的疏水化合物的便捷方法。由于产品生物活性剂纳米盘完全溶于水介质，因此它们为各种疏水分子提供了一种有用的递送方法（表1）。这些包括小分子、天然和合成药物、植物营养素、激素等。配方策略通常遵循标准方案，该方案必须考虑生物活性剂在有机溶剂中的溶解度特性。除了选择合适的有机溶剂来溶解生物活性剂外，还需要两个附加参数，即实现~20 mg/ml储备溶液和溶剂与水溶液的混溶性。这是必要的，因为它允许将大量的生物活性剂添加到配方混合物中，同时不引入过量的有机溶剂。混溶性很重要，因为相分离会阻止生物活性剂掺入产品纳米盘中。

在所选缓冲液中形成双层磷脂分散体后立即引入生物活性剂，允许这些组分在添加支架蛋白之前相互相互作用。在添加支架蛋白之前和之后，样品显示为不透明的悬浮液。然而，一旦加入三种成分（磷脂、生物活性剂和支架蛋白，以 5/1/2 w/w/w 的比例），并且样品在正确的温度下进行足够长时间的浴超声处理，其外观就会从浑浊变为透明。如果生物活性剂是有色的，澄清的样品将呈现该颜色。因此，通过目视检查很容易检测纳米盘的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
两性霉素 B	Cayman Chemical Company	11636	ND 配方 &标准品制备
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP17925	转化 &扩增
ApoE4-NT 质粒	金斯瑞	N/A	转化
挡板培养瓶	New Brunswick Scientific	N/A	扩增 &表达
BL21 感受态大肠杆菌	New England Biolabs	C2527I	转化
离心瓶	Nalgene	3140-0250	表达
氯仿	Fisher Scientific	G607-4	ND 配方
DMSO	Sigma Aldrich	472301	标准制备
二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱	Avanti 脂质	850345P	ND 配方
锥形瓶	Bellco Biotechnology	N/A	扩展 &Expression
Falcon 管	Sarstedt Ag &Co	D51588	酵母活力测定
玻璃硼硅酸盐管	VWR	47729-570	ND 配方
GraphPad（软件）	Dotmatics	N/A	酵母活力测定
加热超声处理浴	VWR	N/A	ND 公式吨
加热和氮气模块	Thermo Scientific	TS-18822	ND 配方
HiTrap肝素 HP （5 mL）	GE Healthcare	17-0407-03	纯化
异丙基 &β;-D-1-硫代吡喃半乳糖苷	Fisher Scientific	BP1755	Expression
J-25 离心机	Beckman Coulter	J325-IM-2	Expression
JA-14 转子	Beckman Coulter	339247	Expression
冻干器	Labconco	7755030	ND 配方
甲醇	Fisher Scientific	A452-4	ND 配方
氮气	普莱塞尔	UN1066	ND 配方
NZCYM 培养基	RPI 研究产品	N7200-1000.0	扩展 &表达
Pet-22B 载体	金斯瑞	N/A	转化
培养皿	Fisher Scientific	FB0875718	转化 &扩展
石英比色	Fisher Brand	14385 928A	光谱分析
振荡培养箱	New Brunswick Scientific	M1344-0004	转化、扩展和Expression
Slide-A-Lyzer 浮标	Thermo Scientific	66430	净化
SnakeSkin 透析管	Thermo Scientific	68100	净化
SnakeSkin 透析管	Thermo Scientific	88243	净化
氯化钠	Fisher Scientific	S271	净化
磷酸氢二钠	Fisher Scientific	S374-500	纯化
磷酸氢钠	Fisher Scientific	BP329-500	纯化
光谱/POR 加权瓶盖	光谱 医疗行业	132736	纯化
分光光度计	岛津 UV-1800	220-92961-01	光谱分析
台式离心机	贝克曼库尔特	366816	ND 配方
UVProbe 2.61 （软件）	岛津	N/A	光谱分析
真空滤光片	Millipore	9004-70-0	表达 &净化
真空泵	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	表达 &净化
涡旋	Fisher Scientific	12-812	ND 配方
酵母	N/A	BY4741	酵母活力测定
酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖	BD	242820	酵母活力测定