小鼠非侵入性气管内脂多糖滴注

摘要

此处，我们提出一种经气管递送脂多糖（LPS）的实验方案 通过 无创经口咽气管插管。该方法可最大限度地减少手术操作对动物造成的创伤，并能准确地将LPS输送至气管，进而进入肺部。

摘要

由脂多糖（LPS）或内毒素诱导的急性肺损伤（ALI）小鼠模型，至今仍是急性肺损伤或急性炎症动物研究中最常用的模型之一。目前在急性肺损伤小鼠模型中最为常用的方法包括腹腔注射LPS以及经气管切开进行LPS气管灌注。然而，前一种方法缺乏对肺部的靶向性，并可能损害其他器官；后一种方法则会引起手术创伤、感染风险以及较低的存活率。本文推荐一种用于小鼠LPS滴注的无创经口咽气管插管方法。该方法借助气管插管装置，将LPS通过口咽腔无创地导入气管，进而灌注至肺部。此方法不仅可确保对肺部的靶向给药，还能避免动物遭受损伤和死亡风险。我们预期该方法将在急性肺损伤研究领域得到广泛应用。

引言

急性肺损伤（ALI）是一种常见的临床综合征。在多种致病因素作用下，肺上皮细胞和血管内皮细胞的生理屏障遭到破坏，导致肺泡通透性增加，从而引起肺顺应性下降、肺水肿以及严重的低氧血症¹。急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是ALI最严重的形式。目前认为，失控的炎症反应和氧化应激损伤是导致ALI以及更严重的ARDS的主要原因²。当肺泡上皮细胞因创伤而直接受损时，会激活肺泡巨噬细胞的炎症反应链，进而引发肺部炎症³。全球范围内，每年有超过300万例急性ARDS患者，约占重症监护病房（ICU）入院人数的10%；此外，重症病例的死亡率高达46%^4,5,6。因此，有必要建立合适的ALI动物模型以研究其发病机制。小鼠是研究ALI最常用的实验动物，因其呼吸道能够很好地模拟人类呼吸道，适用于ALI相关研究。此外，ALI表现为大量炎性细胞浸润、肺血管通透性升高和肺水肿。血清中炎症因子的变化以及肺组织干湿重比可反映ALI的严重程度⁷。

目前，建立小鼠LPS诱导急性肺损伤（ALI）模型的主要方法包括经鼻给药和手术气管插管^8,9在此，我们提出一种将LPS递送至气管的新方法 通过 无创经口咽插管法。该方法利用带有光源的插管器定位小鼠气管，随后将LPS递送至气管和肺部。与经鼻给药方法相比，该方法可更准确地将LPS递送至肺部。与手术法气管插管相比，该方法无需手术操作，避免造成创伤，减轻小鼠疼痛¹⁰因此，该方法可用于建立更具说服力的急性肺损伤小鼠模型。

方案

动物实验方案已通过成都中医药大学管理委员会的审查和批准（记录编号：2021-11）。本研究使用雄性C57/BL小鼠（20–25 g，6–8周龄）。实验期间，小鼠饲养于动物饲养箱中，可自由饮水和进食。

1. 准备

1. 确保插管平台由底座、升高管、一个回形针、两个橡皮筋和若干细绳组成。取一根细绳，将其穿过升高管顶部的两个孔，并将细绳的两端分别系在升高管顶部的小突起上。
   注意：需在细绳与两个孔之间预留足够空间，以便小鼠头部穿过。
2. 将两个橡皮筋分别系在回形针的两端，并用胶带将带橡皮筋的回形针固定在升高管背面。最后，将升高管以90°角固定在底座上（图1）。
3. 选择合适尺寸和长度的导管。对于20−30 g的小鼠，可使用22 G导管（长度为2.5−3.8 cm）¹¹。将导管安装至导管笔上，并打开导管笔的光源（图2）。
4. 使用70%酒精对小型手术镊和巴斯德吸管进行消毒处理。

2. 测试化合物的制备

1. 称取3 mg LPS并溶于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）中，配制成浓度为3 mg/mL的LPS溶液。
2. 称取10 mg戊巴比妥钠并溶于1 mL生理盐水中，配制成1%的戊巴比妥钠溶液。使用0.45 µm注射器滤器对该溶液进行过滤除菌。

3. 非侵入性口咽部滴注

1. 以每公斤体重50 mg的剂量，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉^12,13。通过观察翻正反射是否消失来判断麻醉深度。
2. 将麻醉后的小鼠置于插管平台上。用线固定上门齿，用橡皮筋固定两只前肢（图3）。
3. 用镊子将舌头拉出，并用左手固定。右手持导管，沿口腔缓慢向上推送至下颌会厌处。利用导管笔的光源寻找气管，并缓慢将其插入气管内（图4）。
4. 导管插入气管后，缓慢撤出插管笔，保留导管在原位。将巴斯德吸管插入导管接口，并按压头部（图5）。
   注意：若小鼠胸部隆起，则表明插管成功（图6）。
5. 成功实施气管插管后，使用平头微量注射器经导管向小鼠给予3 mg/kg的3 mg/mL LPS溶液^14,15（图7）。
6. 操作完成后，移除导管和微量注射器。将小鼠从支架上取下，单独放入笼中恢复。观察其呼吸状态，直至小鼠恢复意识。
   注意：在LPS气管滴注后12小时，按照动物伦理委员会批准的程序处死小鼠。采用标准方法进行血清TNF-α检测和肺组织干湿重比测定。

结果

通过检测脂多糖（LPS）滴注后12小时小鼠炎性细胞因子TNF-α的表达水平及肺组织干湿重比，验证了本研究所提出的LPS滴注方法。实验共设四组：空白对照组（未接受任何处理）、手术气管插管组¹⁶、鼻内滴注组^17,18以及无创经口咽插管组（n = 6）。与空白对照组相比，无创经口咽插管组小鼠血清中TNF-α水平显著升高（图8A）；肺组织干湿重比亦显著增加（图8B），达到与手术气管插管组相当的水平。数据采用非配对单因素方差分析（ANOVA）及事后多重比较的Tukey-Kramer检验进行统计学分析。所有数据均以均值 ± 标准误（SEM）表示，以p < 0.05为差异具有统计学意义。

讨论

最初，我们通过观察口腔内部来寻找气管的位置¹⁹。然而，在此过程中，我们发现C57/BL小鼠的气管较窄，若无内窥镜等设备的辅助，很难通过该方法准确找到位置²⁰。经过进一步探索，我们发现插管灯的光线能够穿透体表，使操作者能够判断导管的位置²¹。

为了检查导管是否进入气管，最初我们尝试使用一块小镜子，该镜子通过放置在冰上进行冷却。插管后，我们将镜子靠近套管口。如果镜子上出现雾气，则认为插管成功。然而，我们发现这种方法无法准确判断套管是否真正进入气管。首先，套管前端靠近小鼠口腔，难以确定镜子上出现的雾气是由呼出的口腔气体所致，还是来自气管。其次，镜子需要预先冷却，在反复使用过程中，冷却所需的时间也延长了实验总时长。随后，我们改用巴斯德移液管向气管内吹气；若套管已插入气管，小鼠胸部会明显隆起；若误插入食管，则右下腹部会膨胀²²。因此，我们采用此方法作为判断插管是否成功的依据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脂多糖	MERK	L4130	LPS
微升注射器	SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD	10028505008124	用于递送LPS
小鼠套管	RWD Life Science	803-03008-00	小鼠套管
小鼠插管套件	RWD Life Science	903-03027-00	包含底座、支架、插管器、手术镊和若干细线
巴斯德吸管	Biosharp life science	BS-XG-03	用于验证插管是否成功
戊巴比妥钠	北京化学试剂公司，中国	20220918	用于麻醉小鼠