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方法文章

评估一种纳米乳剂佐剂疫苗针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的免疫应答

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DOI：

10.3791/65152

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2023年9月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

本文内容

摘要

本方案制备并评估物理特性、免疫反应及 体内 一种新型纳米乳剂佐剂疫苗的保护作用

摘要

纳米乳佐剂疫苗因其粒径小、热稳定性高以及能够有效诱导免疫应答而受到广泛关注。然而，建立一套全面的评估新纳米乳佐剂疫苗免疫反应的实验方案至关重要。因此，本文介绍了一种严谨的方法，用于测定疫苗的理化特性（通过透射电子显微镜[TEM]、原子力显微镜[AFM]和动态光散射[DLS]），疫苗抗原及体系的稳定性（通过高速离心试验、热力学稳定性试验、SDS-PAGE和Western blot），以及特异性免疫应答（IgG1、IgG2a和IgG2b）。采用该方法，研究人员可对 准确地 一种新型纳米乳剂佐剂疫苗在致死性MRSA252小鼠模型中的保护作用。通过这些方案，可筛选出佐剂效应最显著的纳米乳剂疫苗佐剂，同时该方法有助于优化新型疫苗的后续研发。

引言

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种机会性病原体，在全球重症监护病房（ICU）病房1、心血管科和烧伤科中具有最高的感染率之一。MRSA感染率高、病死率高且具有广泛的耐药性，给临床治疗带来极大困难2。在世界卫生组织（WHO）于2017年发布的抗生素耐药细菌全球优先清单中，MRSA被列为最优先的类别3。因此，迫切需要研发一种针对MRSA感染的疫苗。

铝佐剂已被长期使用，其佐剂辅助机制相对明确，具有安全性高、效果良好且耐受性好的特点4。目前，铝佐剂是一类广泛应用的佐剂。普遍认为，吸附在铝盐颗粒上的抗原可提高稳定性，并增强注射部位对抗原的摄取能力，实现良好的吸附和缓慢释放5。目前，铝佐剂的主要缺点在于其对某些候选疫苗抗原缺乏佐剂效应，或仅表现出较弱的佐剂效应6。此外，铝佐剂可诱导IgE介导的超敏反应5。因此，有必要开发新型佐剂以激发更强的免疫应答。

纳米乳佐剂是由油相、水相、表面活性剂和助表面活性剂组成的胶体分散体系7。此外，这类佐剂具有热力学稳定性与各向同性，可通过高压灭菌或高速离心进行稳定处理，并可在温和的制备条件下自发形成。目前已有多种乳剂类佐剂（如MF59、NB001-002系列、AS01-04系列等）上市或处于临床研究阶段，但其粒径均大于 160 nm8，因而无法充分發揮纳米级（1–100 nm）药物制剂的优势（即较大的比表面积、小粒径、表面效应、高表面能、小尺寸效应以及宏观量子隧穿效应）。在本实验方案中，报道了一种基于纳米乳技术、粒径为1–100 nm的新型佐剂，其表现出良好的佐剂活性9。我们测试了重组亚单位疫苗抗原蛋白HI（α-溶血素突变体[Hla]与铁离子表面决定因子B[IsdB]亚单位N2活性片段融合蛋白）；建立了一系列流程，用于检测该佐剂的物理性质与稳定性，评估其在肌内注射后诱导的特异性抗体反应，并利用小鼠全身感染模型验证疫苗的保护效果。

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方案

动物实验根据实验动物使用与护理手册进行，并经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。本研究使用6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。实验动物购自商业来源（见材料表）。

1. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌HI抗原蛋白的制备

  1. 获取 IsdB 和 Hla 来自商业来源的克隆（参见 材料表），进行聚合酶链式反应（PCR）扩增以扩增 IsdB 和 Hla 基因，并将其产物连接至PGEX-6P-2质粒（商业获取；参见 材料表）。使用Xl/blue菌株的载体进行筛选 大肠杆菌10.
  2. 将阳性克隆转化进入 E. coli BL21 感受态细胞（参见 材料表）并用鲨鱼培养物进行扩增10.
  3. 使用异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside）诱导表达抗原，并采用多模式色谱（MMC）纯化试剂盒进行分离11（参见 材料表).
  4. 表征抗原蛋白并使用全自动纯化仪进行纯化11.
    1. 使用市售的亲和层析树脂从澄清裂解液中亲和纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签蛋白（参见 材料表).
    2. 通过MMC纯化重组蛋白11.
    3. 采用Triton X-114相分离法去除内毒素11简而言之，将1% Triton X-114与重组蛋白洗脱液在0 °C下混合5分钟，以确保形成均一溶液，随后在37 °C孵育5分钟，使两相形成。
  5. 使用细菌内毒素检测方法11 使用 Turtle 试剂盒（参见 材料表）检测内毒素浓度。该蛋白抗原的内毒素含量为 0.06 EU/µg，低于国际标准（1.5 EU/µg）。10.
    1. 进行干扰试验以消除测试产品对内毒素检测可能产生的影响11.
      注：根据《中华人民共和国药典》2020年版附录12，内毒素含量应低于5 EU/剂量。根据计算，鲎试剂的灵敏度（λ0.25 EU/mL）和最大有效稀释倍数为33.312 基于 MVD = cL/λ，其中 L 为供试品的细菌内毒素限值，c 为供试品溶液的浓度，当 L 以 EU/m 表示时，c 等于 1.0 mg/mL。λ 为凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/mL）。
  6. 将抗原（通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳[SDS-PAGE]测定为48 kDa）以1.5 mg/mL浓度在无内毒素的无菌水或磷酸盐缓冲液（PBS）（二氯化钠法）中重悬11.
    ​注意：蛋白峰时间为13.843 min，纯度为99.4%（高效液相色谱法），蛋白保存于-70 °C10从提取的基因组DNA S. aureus 菌株 MRSA252（参见 材料表) 用作PCR模板。该 IsdB 使用上游引物 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG 扩增基因
    C-39 和反向引物 59-TTTTCCTTTTGCGG
    CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39。该 Hla 使用上游引物 PHLAF（GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC）和下游引物 PHLAR（TAAGCGGCCGCTTAT）对目的基因进行扩增
    CAATTTGTCATTTCTTC

2. 纳米乳液疫苗的制备

  1. 按照1:6:3（w/w）的质量比，依次向HI抗原蛋白溶液（10 mg/mL）中加入三种辅料（肉豆蔻酸异丙酯、聚氧乙烯蓖麻油和丙二醇；参见材料表），充分搅拌。然后，逐步加入灭菌纯水至终体积为10 mL，并在500 rpm、25 °C条件下搅拌约20分钟。
    注：本方案制备的纳米乳剂体积为10 mL，三种辅料的质量分别为0.34 g、2 g和1 g。此处的蛋白溶液为工作液，其浓度为最终溶液浓度的10倍。
  2. 采用低能乳化法13制备纳米乳剂佐剂疫苗（蛋白浓度为1 mg/mL），得到澄清透明的液体溶液。
    ​注：空白纳米乳剂（BNE）的制备方法类似，仅以HI替代水。常规乳化方法通常需将内相和外相加热至约80 °C进行乳化，随后逐步搅拌冷却。该过程消耗大量能量，最终获得乳剂。

3. 纳米乳佐剂疫苗的物理表征与稳定性

  1. 粒径、Zeta 电位和聚合物分散指数（PDI）表征。
    1. 取 100 µL 纳米乳佐剂疫苗，用注射用水稀释 50 倍。加入 2 mL 样品用于检测。
    2. 使用 Nano Zetasizer（ZS；参见材料表）在 25 °C 下测定粒径、Zeta 电位和 PDI。
  2. 透射电子显微镜（TEM）
    1. 取 10 µL 纳米乳疫苗，用纯水稀释 50 倍，滴加至碳支持膜覆盖的 100 目铜网上，室温下用 1% 磷钨酸（参见材料表）染色 5 分钟。
    2. 用滤纸吸除多余的磷钨酸溶液。
    3. 在透射电子显微镜下观察形态（参见材料表）。检查终产物在电镜视野中是否接近稳定且呈圆形，以及是否具有良好的分散性。
  3. 扫描电子显微镜（SEM）
    1. 取 10 µL 纳米乳佐剂疫苗，用纯水稀释 50 倍，取 10 µL 预稀释样品滴于硅片上，置于 37 °C 恒温培养箱中孵育 24 小时。
    2. 对制备好的硅片进行铂喷镀 40 秒，冷却至室温。
    3. 在高分辨率扫描电子显微镜下观察所制备样品的形貌特征（参见材料表）。确定样品在电镜视野中是否接近稳定、呈球形且分散良好。
  4. 形态稳定性
    1. 将 1 mL 纳米乳疫苗样品置于微量离心管中，在室温（25 °C）下以 13,000 × g 离心 30 分钟，评估新鲜样品的稳定性。
    2. 观察这些新鲜样品的外观，随后进行六次温度循环的热力学稳定性测试（一个循环：4 °C 保存 48 小时，25 °C 保存 48 小时，37 °C 保存 48 小时）。
    3. 离心后，让样品静置 15 分钟，观察是否存在丁达尔效应（样品在光照下是否清澈透明），以及是否发生破乳现象（破乳后出现明显分层）。
  5. SDS-PAGE 和 Western blot
    1. 振荡样品，将 0.6 mL 无水乙醇与 0.3 mL 疫苗混合，室温（25 °C）下以 13,000 × g 离心 30 分钟。
    2. 将上清液转移至洁净离心管中，用 0.3 mL 水溶解沉淀。经无水乙醇和蒸馏水处理后，分别获得上清液和沉淀溶液（包括空白纳米乳和疫苗），均进行 50 倍稀释。
    3. 混合 2.5 mL 分离胶 A 和 2.5 mL 分离胶 B（参见材料表），加入 50 µL 10% 过硫酸铵，迅速用移液器将溶液注入玻璃板中。混合 1 mL 浓缩胶 A 和 1 mL 浓缩胶 B，加入 20 µL 10% 过硫酸铵至玻璃板中，插入合适大小的梳子，静置至凝固。
    4. 向步骤 3.5.2 获得的稀释样品中加入共 5 µL 的 5× 蛋白上样缓冲液，沸水浴加热 5 分钟。
    5. 将 10 µL 加热后的蛋白样品加入对应加样孔，5 µL 蛋白 Marker 加入 Marker 孔。
    6. 连接电极，开启电泳仪（参见材料表），调节电压至 300 V。当电泳前沿距离 PAGE 胶底部 1 cm 时关闭电源。
    7. 取出凝胶，用 ddH2O 冲洗。加入考马斯亮蓝 G-250 染色液（参见材料表）染色 10 分钟。倒出染色液，用 ddH2O 冲洗凝胶两次。
    8. 加入市售脱色液，微波加热凝胶 1 分钟。摇床震荡 10 分钟，反复更换脱色液直至背景清晰。然后进行凝胶成像（参见材料表）。
      NOTE: Western blot 的前期处理如步骤 3.5.1–3.5.6 所述。
    9. 用转膜电泳缓冲液浸湿三块滤纸。将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜在甲醇中浸泡 30 秒，使用半干式转膜仪进行转膜（两层滤纸、PVDF 膜、电泳胶、一层滤纸）。以 23 V 电压转膜 23 分钟。
    10. 转膜后取出 PVDF 膜，用含吐温 20 的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBST）洗涤一次。
    11. 将 PVDF 膜置于封闭液（5% 脱脂奶粉溶液）中，4 °C 过夜封闭。
    12. 取出 PVDF 膜，用 TBST 洗涤三次，每次 10 分钟。
    13. 与一抗（来自免疫后血清阳性的小鼠）孵育。将待测一抗11（参见材料表）用 TBST 稀释 500 倍（或 100 倍）。将封闭后的 PVDF 膜放入一抗溶液中，37 °C 孵育 1 小时。
    14. 取出 PVDF 膜，用 TBST 洗涤三次，每次 10 分钟。
    15. 与二抗孵育（参见材料表）。将碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗小鼠二抗用 TBST 稀释 5,000 倍。将 PVDF 膜放入二抗溶液中，37 °C 孵育 40 分钟。
    16. 取出 PVDF 膜，用 TBST 洗涤四次，每次 10 分钟。
    17. 将 PVDF 膜浸入碱性磷酸酶底物氮蓝四唑（NBT）和 BCIP（5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸对甲苯胺盐）的混合液中（用量以刚好浸没膜为宜）进行显色（参见材料表）。阳性结果呈紫色。
      ​NOTE: 结果必须显示清晰的紫色条带，且样品条带与抗原的分子量应在标记位置一致。

4. 肌肉注射后对该疫苗抗体免疫反应的评估

注意：小鼠通过肌肉注射纳米乳液疫苗进行免疫，方法参照已发表的文献11。以注射PBS的小鼠作为阴性对照。完成三次免疫后1周，采集小鼠血清11。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量检测血清中IgG及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的水平。

  1. 抗原包被：用包被液将HI蛋白抗原稀释至10 µg/mL，每孔加入100 µL至ELISA板中，4 °C孵育过夜。
    注意：包被液的配制方法是将1.6 g无水碳酸钠和2.9 g碳酸氢钠溶解于1 L去离子水中。
  2. 封板：洗涤平板（3次循环，每次循环300 µL）。每孔加入300 µL封闭液，37 °C封闭2 h。
    注意：封闭液的配制是在 PBS 中加入 Tween-20 和牛血清白蛋白（BSA）。PBST 溶液中 BSA 的含量为 1%。
  3. 血清稀释：用PBST将小鼠血清样本稀释100倍（取3 µL血清加入297 µL PBST中，涡旋混匀），每份血清样本使用100 µL。将阳性血清和阴性对照血清用PBST稀释100倍，方法为加入4 µL血清 加入396 µL PBST，然后涡旋混匀。
  4. 双倍稀释：将200 µL上述稀释的实验血清加入包被的ELISA板的第一行，除第一列和第12列外，其余各孔均加入100 µL PBSTth 逐行操作。从第一行开始进行1:2的系列稀释：将移液器调整至100 µL，从第一行吸取100 µL转移至第二行，用移液器吹打混匀10次。
  5. 将血清以多个比例稀释至第11行，并弃去100 µL液体。
  6. 根据样本模板，将稀释后的阴性血清和阳性血清分别加入第12行的相应孔中（参见 表1-100 µL/孔。
  7. 用塑料膜密封ELISA板，在37 °C下孵育1小时。
  8. 稀释二抗抗小鼠IgG-HRP（参见 材料表) 用 PBST 以 1:10,000 稀释。
  9. 洗涤平板（3个循环，每个循环300 µL）。然后，向每孔加入100 µL稀释的二抗，在37 °C孵育40分钟。
  10. 染色 终止反应：洗涤酶标板（5个循环，每个循环300 µL）。加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）显色液（100 µL；参见 材料表)加入到每个孔中。将培养板置于37 °C避光孵育10分钟，然后立即加入50 µL的2 M HCl终止反应2SO4.
  11. 检测光密度（OD450）值，通过酶标仪检测（读取OD450 终止后15分钟内测量数值。

5. 评估 体内 新型佐剂疫苗的效果

注意：该纳米乳剂疫苗的保护效果在商业获取的致死性 MRSA252 小鼠模型中进行评估（见材料表）。根据我们研究团队先前的研究结果14，每只小鼠接种 1 × 108 菌落形成单位（CFU）是评估 MRSA252 细菌感染致死模型保护效果的最佳剂量。

  1. 菌株复苏：取一管冻存的 MRSA252，接种细菌于 Mueller Hinton（MH）（A）平板上（参见 材料表）由 "三线法"，并在37 °C下培养过夜。执行以下步骤： "三线法" 如下所述：
    1. 右手持接种环，灼烧灭菌后冷却，以获取一环菌液。
    2. 将琼脂平板用左手持握（皿盖置于桌面上），放置于酒精灯火焰左前方，使平板开口朝向火焰，以防止细菌进入空气中。右手持沾有菌液的接种环，在琼脂表面以密集但不重叠的方式前后划线，覆盖平板总面积的约1/5–1/6区域，此为第一区。
      注意：接种环与琼脂应以30°–40°的角度轻轻接触；通过用手腕力量滑动可避免划伤琼脂。
    3. 灼烧接种环上多余的细菌（是否需要灼烧或灭菌每个区域取决于标本中细菌的量）。冷却后，重复倒数第二行的第2-3步，在末端划第二个区域（约占平板面积的1/4）。
    4. 第二个区域完成后，烧灼环，以相同方式绘制第三个区域，直至填满整个培养皿。
    5. 画线后，将平板倒置于培养皿盖上，标记平板，并在37 °C培养箱中孵育18–24 h，观察琼脂表面菌落的分布情况。重点注意是否有单个菌落被分离，并观察菌落特征（如大小、形状、透明度和色素产生）。
  2. 细菌活化：次日，取两个50 mL摇瓶，各加入20 mL MH（B）培养基（参见 材料表) 各加入一个。用10 µL枪头挑取两个单菌落并加入摇瓶中。37 °C、220 rpm条件下过夜培养。
  3. 二次活化：次日，取两个50 mL摇瓶，每瓶含20 mL MH（B）培养基。从含有初次活化菌液的摇瓶中取出200 µL菌液，加入上述两个含20 mL MH（B）培养基的新摇瓶中，在37 °C、220 rpm条件下振荡培养5 h。
  4. 将第二次活化的细菌溶液收集至50 mL离心管中，在3,000 x g 20 分钟，弃去上清液。
  5. 将沉淀的细菌重悬于40 mL生理盐水中。
  6. 测量OD600 细菌溶液的值，并用生理盐水调整至1。此时，实验中MRSA252的细菌数量为2 x 109 CFU/mL
  7. 用OD稀释细菌溶液600 从1稀释至浓度为1 × 109 CFU/mL
  8. 将48只Balb/c小鼠随机分为四组（n=12）。
    注：第 I 组：PBS 组；第 II 组：BNE 对照组；第 III 组：天然抗原（蛋白）组；第 IV 组：纳米乳剂佐剂疫苗组。
  9. 通过腹腔注射100 mg/kg的1%戊巴比妥钠麻醉小鼠。
  10. 使用红外理疗灯照射小鼠（参见 材料表约1分钟，以引起尾静脉血管扩张。
  11. 通过尾静脉注射稀释后的细菌溶液（步骤5.7），每只小鼠注射100 µL，以进行攻毒。
  12. 将小鼠置于红外理疗灯下，直至其恢复正常的活动能力。
  13. 每12小时观察并记录小鼠存活情况，持续10天。
  14. 通过腹腔注射每公斤体重100 mg的1%戊巴比妥钠，处死在攻击后存活的小鼠。

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结果

纳米乳佐剂疫苗的制备方案 体外 和 体内 对该疫苗进行了检测。采用透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和动态光散射（DLS）技术，测定该样品表面的zeta电位和粒径等关键特性（图1）。SDS-PAGE 和 Western 印迹结果显示，沉淀和上清液中的抗原含量在离心后未发生显著降解，表明该疫苗结构完整、具有特异性和免疫原性（图2）。纳米乳佐剂疫苗显著提高了总IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度，疫苗的免疫原性显著增强。图3A-C）。抗原组在450 nm处的血清IgG2b OD值最高（用PBS按1:500稀释）（图3D）。致死性MRSA252小鼠模型最直接地反映出，纳米乳剂佐剂疫苗具有良好的保护作用，能有效抑制MRSA252细菌感染，提高感染小鼠的存活率（

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讨论

IsdB一种细菌细胞壁锚定且受铁调控的表面蛋白，在获取血红素铁的过程中发挥重要作用15. Hlaα毒素是已知耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）中最有效的细菌毒素之一，可在真核细胞上形成孔道，并干扰细胞黏附及上皮细胞功能。16在本研究中，基于抗原基因，利用基因工程技术构建并表达了一种新型重组MRSA抗原蛋白（HI）。 IsdB 和 Hla然后，采用低能乳化法制备了一种纳米乳液疫苗，并对该疫苗的稳定性和有效性进行了评估。例如，某些特性，如长期稳定性、结构、形态、吸收及效应 体内，受乳液液滴的大小影响很大7结果表明，粒径是影响纳米乳剂转运的重要因素。 体内 及其被抗原呈递细胞的吞噬作用17关于细胞吞噬作用，尺寸小于1 µm的纳米颗粒更容易被树突状细胞（DCs）和巨噬细胞吞噬，也最有可能激发全身性免疫反应18

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披露

作者声明本研究不存在任何利益冲突。

致谢

本研究得到中国国家重点研发计划项目 No. 2021YFC2302603、国家自然科学基金项目 No. 32070924 和 32000651，以及重庆市自然科学基金项目计划 No. 2019jcyjA-msxmx0159 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5424-小型高速离心机 FA-45-24-11Eppendorf, Germany 5424000495
96孔板Corning Incorporated, USACLS3922
AFM Dimension FastScanBRUKER, Germany null
酒精灯深圳易霸迅科技有限公司，中国YBS-AA-11408
Balb/c小鼠 北京华阜生物科技股份有限公司 
BCIP/NBT福州迈新生物技术开发有限公司，中国BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0酶标仪Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USAnull
BL21感受态细胞Merck millipore, Germany70232-3CN
BSA-100GSigma-Aldrich, USAB2064-100G
Centrifuge 5810 REppendorf, Germany 5811000398
考马斯亮蓝G-250染色液MIKX，中国DB236
脱色液BOSTER，中国AR0163-2
电热恒温培养箱 HH-B11-420上海跃进医疗器械厂，中国null
电泳仪北京六一仪器厂，中国DYCZ-25D
凝胶成像系统Tanon, USAnull
谷胱甘肽-Sepharose亲和层析树脂 GST美5生物，中国affinity chromatography resin
H2SO4成都科试化工有限公司，中国7664-93-9
HI重组蛋白第三军医大学，中国110-27-0
HRP-山羊抗小鼠IgG百奥龙，中国BF03001
HRP-山羊抗小鼠IgG1百奥龙，中国BF03002R
HRP-山羊抗小鼠IgG2a百奥龙，中国BF03003R
HRP-山羊抗小鼠IgG2b百奥龙，中国BF03004R
接种环海门飞越有限公司，中国YR-JZH-1UL
IsdB和Hla克隆上海杰瑞生物技术有限公司，中国null
异丙基肉豆蔻酸（药用辅料）SEPPIC, 法国null
异丙基-β-D-1-巯基半乳糖吡喃糖苷fdbio，中国FD3278-1
LB肉汤培养基北京奥博兴生物技术有限公司，中国02-136
红外理疗灯广州润曼医疗设备有限公司，中国7600
低温冷冻离心机Eppendorf, Germany null
Malvern NANO ZSMalvern Instruments Ltd., 英国null
MH(A)培养基北京奥博兴生物技术有限公司，中国02-051
MH(B)培养基北京奥博兴生物技术有限公司，中国02-052
405 LSRS酶标洗板机Bio Tek Instruments,Inc Highland  Park, USAnull
Mini-TBC紧凑型转膜仪北京东方瑞利有限公司，中国1658030
MMC填料东曹（上海）有限公司0022818
MRSA252美国ATCCnull
Nanodrop紫外分光光度计Thermo Scientific, USAnull
New FlashTM Protein any KD PAGE蛋白电泳凝胶试剂盒达科为，中国8012011
PBSbiosharp，中国null
PCR扩增仪Thermal Cycler, USAnull
pGEX-目的基因重组质粒上海杰瑞生物技术有限公司，中国B3528G
磷钨酸G-CLONE，中国CS1231-25g
移液器Eppendorf, Germany 3120000844
聚氧乙烯蓖麻油（药用辅料）阿拉丁，中国K400327-1kg
一抗实验室自制：来自免疫小鼠的阳性血清null详见参考文献11
丙二醇（药用辅料）Sigma-Aldrich, USAP4347-500ML
蛋白MarkerThermo Scientufuc, USA26616
PVDF转印膜Invitrogen, USA88518
扫描电子显微镜JEOL, 日本JSM-IT800
戊巴比妥钠Merck, GermanyTc-P8411
Talos L120C透射电子显微镜Thermo Fisher, USAnull
TMB显色液天根，中国PA107-01
龟试剂盒厦门佰安德科技有限公司ES80545
Tween-20Macklin，中国9005-64-5

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