评估一种纳米乳剂佐剂疫苗针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的免疫应答

摘要

本方案制备并评估物理特性、免疫反应及 体内 一种新型纳米乳剂佐剂疫苗的保护作用

摘要

纳米乳佐剂疫苗因其粒径小、热稳定性高以及能够有效诱导免疫应答而受到广泛关注。然而，建立一套全面的评估新纳米乳佐剂疫苗免疫反应的实验方案至关重要。因此，本文介绍了一种严谨的方法，用于测定疫苗的理化特性（通过透射电子显微镜[TEM]、原子力显微镜[AFM]和动态光散射[DLS]），疫苗抗原及体系的稳定性（通过高速离心试验、热力学稳定性试验、SDS-PAGE和Western blot），以及特异性免疫应答（IgG1、IgG2a和IgG2b）。采用该方法，研究人员可对 准确地 一种新型纳米乳剂佐剂疫苗在致死性MRSA252小鼠模型中的保护作用。通过这些方案，可筛选出佐剂效应最显著的纳米乳剂疫苗佐剂，同时该方法有助于优化新型疫苗的后续研发。

引言

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种机会性病原体，在全球重症监护病房（ICU）病房¹、心血管科和烧伤科中具有最高的感染率之一。MRSA感染率高、病死率高且具有广泛的耐药性，给临床治疗带来极大困难²。在世界卫生组织（WHO）于2017年发布的抗生素耐药细菌全球优先清单中，MRSA被列为最优先的类别³。因此，迫切需要研发一种针对MRSA感染的疫苗。

铝佐剂已被长期使用，其佐剂辅助机制相对明确，具有安全性高、效果良好且耐受性好的特点⁴。目前，铝佐剂是一类广泛应用的佐剂。普遍认为，吸附在铝盐颗粒上的抗原可提高稳定性，并增强注射部位对抗原的摄取能力，实现良好的吸附和缓慢释放⁵。目前，铝佐剂的主要缺点在于其对某些候选疫苗抗原缺乏佐剂效应，或仅表现出较弱的佐剂效应⁶。此外，铝佐剂可诱导IgE介导的超敏反应⁵。因此，有必要开发新型佐剂以激发更强的免疫应答。

纳米乳佐剂是由油相、水相、表面活性剂和助表面活性剂组成的胶体分散体系⁷。此外，这....

方案

动物实验根据实验动物使用与护理手册进行，并经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。本研究使用6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。实验动物购自商业来源（见材料表）。

1. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌HI抗原蛋白的制备

1. 获取 IsdB 和 Hla 来自商业来源的克隆（参见 材料表），进行聚合酶链式反应（PCR）扩增以扩增 IsdB 和 Hla 基因，并将其产物连接至PGEX-6P-2质粒（商业获取；参见 材料表）。使用Xl/blue菌株的载体进行筛选 大肠杆菌¹⁰.
2. 将阳性克隆转化进入 E. coli BL21 感受态细胞（参见 材料表）并用鲨鱼培养物进行扩增¹⁰.
3. 使用异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside）诱导表达抗原，并采用多模式色谱（MMC）纯化试剂盒进行分离¹¹（参见 材料表)....

结果

纳米乳佐剂疫苗的制备方案 体外 和 体内 对该疫苗进行了检测。采用透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和动态光散射（DLS）技术，测定该样品表面的zeta电位和粒径等关键特性（图1）。SDS-PAGE 和 Western 印迹结果显示，沉淀和上清液中的抗原含量在离心后未发生显著降解，表明该疫苗结构完整、具有特异性和免疫原性（图2）。纳米乳佐剂疫苗显著提高了总IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度，疫苗的免疫原性显著增强。图3A-C）。抗原组在450 nm处的血清IgG2b OD值最高（用PBS按1:500稀释）（图3D）。致死性MRSA252小鼠模型最直接地反映出，纳米乳剂佐剂疫苗具有良好的保护作用，能有效抑制MRSA252细菌感染，提高感染小鼠的存活率（

讨论

IsdB一种细菌细胞壁锚定且受铁调控的表面蛋白，在获取血红素铁的过程中发挥重要作用¹⁵. Hlaα毒素是已知耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）中最有效的细菌毒素之一，可在真核细胞上形成孔道，并干扰细胞黏附及上皮细胞功能。¹⁶在本研究中，基于抗原基因，利用基因工程技术构建并表达了一种新型重组MRSA抗原蛋白（HI）。 IsdB 和 Hla然后，采用低能乳化法制备了一种纳米乳液疫苗，并对该疫苗的稳定性和有效性进行了评估。例如，某些特性，如长期稳定性、结构、形态、吸收及效应 体内，受乳液液滴的大小影响很大⁷结果表明，粒径是影响纳米乳剂转运的重要因素。 体内 及其被抗原呈递细胞的吞噬作用¹⁷关于细胞吞噬作用，尺寸小于1 µm的纳米颗粒更容易被树突状细胞（DCs）和巨噬细胞吞噬，也最有可能激发全身性免疫反应¹⁸

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5424-小型高速离心机 FA-45-24-11	Eppendorf, Germany	5424000495
96孔板	Corning Incorporated, USA	CLS3922
AFM Dimension FastScan	BRUKER, Germany	null
酒精灯	深圳易霸迅科技有限公司，中国	YBS-AA-11408
Balb/c小鼠	北京华阜生物科技股份有限公司
BCIP/NBT	福州迈新生物技术开发有限公司，中国	BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0酶标仪	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	null
BL21感受态细胞	Merck millipore, Germany	70232-3CN
BSA-100G	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
考马斯亮蓝G-250染色液	MIKX，中国	DB236
脱色液	BOSTER，中国	AR0163-2
电热恒温培养箱 HH-B11-420	上海跃进医疗器械厂，中国	null
电泳仪	北京六一仪器厂，中国	DYCZ-25D
凝胶成像系统	Tanon, USA	null
谷胱甘肽-Sepharose亲和层析树脂 GST	美5生物，中国	affinity chromatography resin
H2SO4	成都科试化工有限公司，中国	7664-93-9
HI重组蛋白	第三军医大学，中国	110-27-0
HRP-山羊抗小鼠IgG	百奥龙，中国	BF03001
HRP-山羊抗小鼠IgG1	百奥龙，中国	BF03002R
HRP-山羊抗小鼠IgG2a	百奥龙，中国	BF03003R
HRP-山羊抗小鼠IgG2b	百奥龙，中国	BF03004R
接种环	海门飞越有限公司，中国	YR-JZH-1UL
IsdB和Hla克隆	上海杰瑞生物技术有限公司，中国	null
异丙基肉豆蔻酸（药用辅料）	SEPPIC, 法国	null
异丙基-β-D-1-巯基半乳糖吡喃糖苷	fdbio，中国	FD3278-1
LB肉汤培养基	北京奥博兴生物技术有限公司，中国	02-136
红外理疗灯	广州润曼医疗设备有限公司，中国	7600
低温冷冻离心机	Eppendorf, Germany	null
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., 英国	null
MH(A)培养基	北京奥博兴生物技术有限公司，中国	02-051
MH(B)培养基	北京奥博兴生物技术有限公司，中国	02-052
405 LSRS酶标洗板机	Bio Tek Instruments,Inc Highland  Park, USA	null
Mini-TBC紧凑型转膜仪	北京东方瑞利有限公司，中国	1658030
MMC填料	东曹（上海）有限公司	0022818
MRSA252	美国ATCC	null
Nanodrop紫外分光光度计	Thermo Scientific, USA	null
New FlashTM Protein any KD PAGE蛋白电泳凝胶试剂盒	达科为，中国	8012011
PBS	biosharp，中国	null
PCR扩增仪	Thermal Cycler, USA	null
pGEX-目的基因重组质粒	上海杰瑞生物技术有限公司，中国	B3528G
磷钨酸	G-CLONE，中国	CS1231-25g
移液器	Eppendorf, Germany	3120000844
聚氧乙烯蓖麻油（药用辅料）	阿拉丁，中国	K400327-1kg
一抗	实验室自制：来自免疫小鼠的阳性血清	null	详见参考文献11
丙二醇（药用辅料）	Sigma-Aldrich, USA	P4347-500ML
蛋白Marker	Thermo Scientufuc, USA	26616
PVDF转印膜	Invitrogen, USA	88518
扫描电子显微镜	JEOL, 日本	JSM-IT800
戊巴比妥钠	Merck, Germany	Tc-P8411
Talos L120C透射电子显微镜	Thermo Fisher, USA	null
TMB显色液	天根，中国	PA107-01
龟试剂盒	厦门佰安德科技有限公司	ES80545
Tween-20	Macklin，中国	9005-64-5