本方案制备并评估物理特性、免疫反应及 体内 一种新型纳米乳剂佐剂疫苗的保护作用
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本方案制备并评估物理特性、免疫反应及 体内 一种新型纳米乳剂佐剂疫苗的保护作用
纳米乳佐剂疫苗因其粒径小、热稳定性高以及能够有效诱导免疫应答而受到广泛关注。然而,建立一套全面的评估新纳米乳佐剂疫苗免疫反应的实验方案至关重要。因此,本文介绍了一种严谨的方法,用于测定疫苗的理化特性(通过透射电子显微镜[TEM]、原子力显微镜[AFM]和动态光散射[DLS]),疫苗抗原及体系的稳定性(通过高速离心试验、热力学稳定性试验、SDS-PAGE和Western blot),以及特异性免疫应答(IgG1、IgG2a和IgG2b)。采用该方法,研究人员可对 准确地 一种新型纳米乳剂佐剂疫苗在致死性MRSA252小鼠模型中的保护作用。通过这些方案,可筛选出佐剂效应最显著的纳米乳剂疫苗佐剂,同时该方法有助于优化新型疫苗的后续研发。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种机会性病原体,在全球重症监护病房(ICU)病房1、心血管科和烧伤科中具有最高的感染率之一。MRSA感染率高、病死率高且具有广泛的耐药性,给临床治疗带来极大困难2。在世界卫生组织(WHO)于2017年发布的抗生素耐药细菌全球优先清单中,MRSA被列为最优先的类别3。因此,迫切需要研发一种针对MRSA感染的疫苗。
铝佐剂已被长期使用,其佐剂辅助机制相对明确,具有安全性高、效果良好且耐受性好的特点4。目前,铝佐剂是一类广泛应用的佐剂。普遍认为,吸附在铝盐颗粒上的抗原可提高稳定性,并增强注射部位对抗原的摄取能力,实现良好的吸附和缓慢释放5。目前,铝佐剂的主要缺点在于其对某些候选疫苗抗原缺乏佐剂效应,或仅表现出较弱的佐剂效应6。此外,铝佐剂可诱导IgE介导的超敏反应5。因此,有必要开发新型佐剂以激发更强的免疫应答。
纳米乳佐剂是由油相、水相、表面活性剂和助表面活性剂组成的胶体分散体系7。此外,这类佐剂具有热力学稳定性与各向同性,可通过高压灭菌或高速离心进行稳定处理,并可在温和的制备条件下自发形成。目前已有多种乳剂类佐剂(如MF59、NB001-002系列、AS01-04系列等)上市或处于临床研究阶段,但其粒径均大于 160 nm8,因而无法充分發揮纳米级(1–100 nm)药物制剂的优势(即较大的比表面积、小粒径、表面效应、高表面能、小尺寸效应以及宏观量子隧穿效应)。在本实验方案中,报道了一种基于纳米乳技术、粒径为1–100 nm的新型佐剂,其表现出良好的佐剂活性9。我们测试了重组亚单位疫苗抗原蛋白HI(α-溶血素突变体[Hla]与铁离子表面决定因子B[IsdB]亚单位N2活性片段融合蛋白);建立了一系列流程,用于检测该佐剂的物理性质与稳定性,评估其在肌内注射后诱导的特异性抗体反应,并利用小鼠全身感染模型验证疫苗的保护效果。
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动物实验根据实验动物使用与护理手册进行,并经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。本研究使用6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。实验动物购自商业来源(见材料表)。
1. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌HI抗原蛋白的制备
2. 纳米乳液疫苗的制备
3. 纳米乳佐剂疫苗的物理表征与稳定性
4. 肌肉注射后对该疫苗抗体免疫反应的评估
注意:小鼠通过肌肉注射纳米乳液疫苗进行免疫,方法参照已发表的文献11。以注射PBS的小鼠作为阴性对照。完成三次免疫后1周,采集小鼠血清11。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量检测血清中IgG及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的水平。
5. 评估 体内 新型佐剂疫苗的效果
注意:该纳米乳剂疫苗的保护效果在商业获取的致死性 MRSA252 小鼠模型中进行评估(见材料表)。根据我们研究团队先前的研究结果14,每只小鼠接种 1 × 108 菌落形成单位(CFU)是评估 MRSA252 细菌感染致死模型保护效果的最佳剂量。
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纳米乳佐剂疫苗的制备方案 体外 和 体内 对该疫苗进行了检测。采用透射电子显微镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)和动态光散射(DLS)技术,测定该样品表面的zeta电位和粒径等关键特性(图1)。SDS-PAGE 和 Western 印迹结果显示,沉淀和上清液中的抗原含量在离心后未发生显著降解,表明该疫苗结构完整、具有特异性和免疫原性(图2)。纳米乳佐剂疫苗显著提高了总IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度,疫苗的免疫原性显著增强。图3A-C)。抗原组在450 nm处的血清IgG2b OD值最高(用PBS按1:500稀释)(图3D)。致死性MRSA252小鼠模型最直接地反映出,纳米乳剂佐剂疫苗具有良好的保护作用,能有效抑制MRSA252细菌感染,提高感染小鼠的存活率(
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IsdB一种细菌细胞壁锚定且受铁调控的表面蛋白,在获取血红素铁的过程中发挥重要作用15. Hlaα毒素是已知耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中最有效的细菌毒素之一,可在真核细胞上形成孔道,并干扰细胞黏附及上皮细胞功能。16在本研究中,基于抗原基因,利用基因工程技术构建并表达了一种新型重组MRSA抗原蛋白(HI)。 IsdB 和 Hla然后,采用低能乳化法制备了一种纳米乳液疫苗,并对该疫苗的稳定性和有效性进行了评估。例如,某些特性,如长期稳定性、结构、形态、吸收及效应 体内,受乳液液滴的大小影响很大7结果表明,粒径是影响纳米乳剂转运的重要因素。 体内 及其被抗原呈递细胞的吞噬作用17关于细胞吞噬作用,尺寸小于1 µm的纳米颗粒更容易被树突状细胞(DCs)和巨噬细胞吞噬,也最有可能激发全身性免疫反应18
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作者声明本研究不存在任何利益冲突。
本研究得到中国国家重点研发计划项目 No. 2021YFC2302603、国家自然科学基金项目 No. 32070924 和 32000651,以及重庆市自然科学基金项目计划 No. 2019jcyjA-msxmx0159 的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5424-小型高速离心机 FA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96孔板 | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| 酒精灯 | 深圳易霸迅科技有限公司,中国 | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c小鼠 | 北京华阜生物科技股份有限公司 | ||
| BCIP/NBT | 福州迈新生物技术开发有限公司,中国 | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0酶标仪 | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21感受态细胞 | Merck millipore, Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| 考马斯亮蓝G-250染色液 | MIKX,中国 | DB236 | |
| 脱色液 | BOSTER,中国 | AR0163-2 | |
| 电热恒温培养箱 HH-B11-420 | 上海跃进医疗器械厂,中国 | null | |
| 电泳仪 | 北京六一仪器厂,中国 | DYCZ-25D | |
| 凝胶成像系统 | Tanon, USA | null | |
| 谷胱甘肽-Sepharose亲和层析树脂 GST | 美5生物,中国 | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | 成都科试化工有限公司,中国 | 7664-93-9 | |
| HI重组蛋白 | 第三军医大学,中国 | 110-27-0 | |
| HRP-山羊抗小鼠IgG | 百奥龙,中国 | BF03001 | |
| HRP-山羊抗小鼠IgG1 | 百奥龙,中国 | BF03002R | |
| HRP-山羊抗小鼠IgG2a | 百奥龙,中国 | BF03003R | |
| HRP-山羊抗小鼠IgG2b | 百奥龙,中国 | BF03004R | |
| 接种环 | 海门飞越有限公司,中国 | YR-JZH-1UL | |
| IsdB和Hla克隆 | 上海杰瑞生物技术有限公司,中国 | null | |
| 异丙基肉豆蔻酸(药用辅料) | SEPPIC, 法国 | null | |
| 异丙基-β-D-1-巯基半乳糖吡喃糖苷 | fdbio,中国 | FD3278-1 | |
| LB肉汤培养基 | 北京奥博兴生物技术有限公司,中国 | 02-136 | |
| 红外理疗灯 | 广州润曼医疗设备有限公司,中国 | 7600 | |
| 低温冷冻离心机 | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., 英国 | null | |
| MH(A)培养基 | 北京奥博兴生物技术有限公司,中国 | 02-051 | |
| MH(B)培养基 | 北京奥博兴生物技术有限公司,中国 | 02-052 | |
| 405 LSRS酶标洗板机 | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park, USA | null | |
| Mini-TBC紧凑型转膜仪 | 北京东方瑞利有限公司,中国 | 1658030 | |
| MMC填料 | 东曹(上海)有限公司 | 0022818 | |
| MRSA252 | 美国ATCC | null | |
| Nanodrop紫外分光光度计 | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE蛋白电泳凝胶试剂盒 | 达科为,中国 | 8012011 | |
| PBS | biosharp,中国 | null | |
| PCR扩增仪 | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-目的基因重组质粒 | 上海杰瑞生物技术有限公司,中国 | B3528G | |
| 磷钨酸 | G-CLONE,中国 | CS1231-25g | |
| 移液器 | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| 聚氧乙烯蓖麻油(药用辅料) | 阿拉丁,中国 | K400327-1kg | |
| 一抗 | 实验室自制:来自免疫小鼠的阳性血清 | null | 详见参考文献11 |
| 丙二醇(药用辅料) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| 蛋白Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF转印膜 | Invitrogen, USA | 88518 | |
| 扫描电子显微镜 | JEOL, 日本 | JSM-IT800 | |
| 戊巴比妥钠 | Merck, Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C透射电子显微镜 | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB显色液 | 天根,中国 | PA107-01 | |
| 龟试剂盒 | 厦门佰安德科技有限公司 | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin,中国 | 9005-64-5 |
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