在此，我们描述了一种对半体外 (SIV) 法用于观察花粉管导向与接收过程 拟南芥, 这会提高胚珠的接受性。高通量SIV 与隔膜 该方法可与配子体标记品系及基因编码的生物传感器联用，以监测受精过程的动态变化。
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本文内容
摘要
摘要
在开花植物中，花粉管（雄性配子体）在雌蕊内的生长与导向，以及雌性配子体对花粉管的接收，是实现双受精及后续种子发育的关键环节。雄性与雌性配子体在花粉管接收过程中的相互作用，最终导致花粉管破裂，释放出两个精子细胞以完成双受精。由于花粉管生长和双受精过程深藏于花部组织内部，该过程难以直接观察 体内.
一种用于模式植物 Arabidopsis thaliana 受精过程中活细胞成像的半体外（SIV）方法已被开发并应用于多项研究。这些研究有助于阐明开花植物受精过程的基本特征，以及雄性和雌性配子体相互作用期间发生的细胞和分子变化。然而，由于这些活细胞成像实验需要切除单个胚珠，每次成像的观察数量有限，使得该方法繁琐且耗时极长。此外，其他技术难题中常有报道指出花粉管在体外难以完成对胚珠的受精 ，这严重干扰了此类分析。
本文提供了一种详细的视频实验方案，用于以自动化和高通量的方式对花粉管接收及受精过程进行成像，每次成像可实现多达40次花粉管接收与破裂的观察。结合使用基因编码的生物传感器和标记品系，该方法能够在减少时间投入的同时生成大样本量的数据。本技术的关键细节与注意事项，包括花朵发育阶段的判定、组织解剖、培养基制备以及成像过程，均以视频形式进行了清晰展示，以促进未来在花粉管导向、接收及双受精动态研究领域的进一步探索。
引言
有性繁殖生物产生基因独特后代的过程依赖于雄性和雌性配子的成功融合。在开花植物中，双受精过程中两个雄性配子（精子细胞）与两个雌性配子（卵细胞和中央细胞）的结合依赖于精子从花粉管（雄配子体）中释放。这一过程称为花粉管接收，主要由位于胚囊（雌配子体）内的助细胞调控。1,2由于花粉管接收过程发生在花内部较深处，需要一种能够对这一过程进行活细胞成像的方法，称为半-体外 （SIV）花粉管接收机制已被建立3. 采用该方法，切除的 拟南芥 胚珠被置于半流体的花粉萌发培养基上，花粉管通过在花柱与维管束交界处切断的雌蕊的柱头和花柱生长，进而靶向胚珠3,4自该技术发展以来，细致的观察已推动了关于花粉管导向、识别与受精过程的多项发现。其中，这些发现包括花粉管通过柱头生长而获得靶向能力3，花粉管到达后协同细胞内钙振荡的起始5,6,7,8,9以及花粉管破裂时精子细胞释放与受精的动态过程10然而，由于该技术依赖于胚珠的切除，受精过程的观察数量有限，且花粉管接收常出现异常，导致花粉管破裂失败视频 1 和 补充文件 1因此，迫切需要一种更高效的方法，以实现对花粉管接收和受精过程的高通量分析。
在开发本实验方案的过程中，测试了多种分析花粉管接收的新方法，这些方法涵盖了从最接近"体外"到最接近"体内"的范围，并最终确定了一种基于完整切取胚珠隔膜的高效技术，该方法每天最多可实现40次受精过程的观察。本文详细阐述了该技术的关键细节与关键步骤，包括花朵发育阶段的判定、组织解剖、培养基制备以及成像参数设置。通过遵循本方案，有望促进针对花粉管导向、花粉管接收以及双受精过程的研究。该方法所允许的更高样本量，预计将增强基于活体成像实验所得结论的科学严谨性。该技术的潜在应用包括但不限于：利用基因编码的生物传感器，观察配子体相互作用过程中细胞质钙离子浓度（[Ca2+]cyt）、pH值或H2O2的分子与生理变化。此外，使用该优化方法可更方便地观察细胞学变化，例如受精前助细胞的退化、精细胞的迁移或核融合（karyogamy）。最后，可在宽场显微镜下监测受精各阶段的时间进程，随后可进一步采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或双光子激发显微镜（2PEM）进行高分辨率成像与三维重建的详细分析。
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方案
注意：本实验方案所用材料与设备的清单，请参见材料表。
1. 成像实验设计的注意事项
- 预先确定成像所需的时间和采样频率，以准确捕捉待观察的目标现象。例如，根据奈奎斯特采样定理，采样频率必须大于输入信号最高频率的两倍。因此，为准确记录助细胞中细胞质游离钙离子浓度（[Ca2+]cyt）的振荡，建议每约10秒进行一次成像；而若要测量花粉管释放精子细胞时的运动速度，则需确保时间分辨率小于1秒10。
- 选择目标细胞的荧光标记物，其荧光强度应显著高于背景自发荧光。若使用生物传感器，应选择荧光最强且不影响细胞正常功能的品系，因其通常具有更高的灵敏度，并可减少曝光时间。
- 考虑最适合捕捉目标现象的荧光显微镜类型及放大倍数。使用宽场显微镜和低倍物镜可获得更大的景深，便于长时间维持聚焦，适用于成像较大的结构（如整个胚珠），或使用对色差伪影敏感的比率型传感器。若需更高分辨率以观察细胞及亚细胞结构，可选用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或双光子激发显微镜（2PEM）配合高倍物镜，但需注意长时间成像过程中维持聚焦的难度。
- 估算每次实验需成像的样本数量。例如，使用10倍物镜时，由于自动对焦和多视野采集功能所需时间，每次实验成像三个隔膜并最多记录约40个受精事件，每个样本的最小采样时间约为30秒。
2. 花粉萌发培养基的制备
- 使用储存于 −20 °C 的各微量元素 1 M 母液，配制液体花粉萌发培养基（5 mM CaCl2、1 mM MgSO4、5 mM KCl、0.01% [w/v] H3BO3 和 10% [w/v] 蔗糖）。用 0.1 M KOH 将 pH 调至 7.5。培养基可于 4 °C 保存最多 2 周。
注意：pH 可能随时间下降。 - 向 10 mL 烧杯中加入 2.5 mL 液体培养基，并使用快速旋转的搅拌子缓慢加入约 32 mg 超低熔点琼脂糖（~1.3%），以避免结块。
- 在 65 °C 加热板上熔化琼脂糖，并轻轻旋转烧杯，使壁上的冷凝液回流至溶液中。
- 用移液器将 130 µL 培养基加入 35 mm 玻底培养皿的 14 mm 孔中，并旋转培养皿，使培养基均匀覆盖孔底。
- 用移液器从培养皿中央吸取总共 40 µL 培养基，使剩余总体积为 90 µL。
注意：可根据需要从孔中吸出更多培养基以进一步降低总体积；这对于工作距离较短的高倍物镜可能是必要的。但琼脂垫越薄，干燥速度越快。 - 将培养皿置于湿度培养箱中的铝块上冷却，以确保均匀降温。将制备好的培养皿于 4 °C 过夜保存，次日早晨使用。
3. 胚珠、柱头和花粉供体的花期阶段
图1: 隔膜供体、柱头供体和花粉供体的花期阶段鉴定。 (A) 阶段 拟南芥 花（Ler-0) 在一个花序内，应去雄处于12B阶段的花蕾，这些花蕾的花瓣即将开放，且具有黄色的闭裂花药。去雄时需去除所有的萼片、花瓣和雄蕊。24小时后，雌蕊（含有雌配子体发生器）即可用作隔膜供体。B) 阶段 拟南芥 花序中的花（Col-0）。应在花蕾处于12B阶段时去雄，此阶段花蕾具有黄色不裂的花药，柱头刚刚从花瓣中露出。去雄操作需去除所有萼片、花瓣和雄蕊。去雄后的雌蕊24小时后可用作柱头供体，此时应使用已开放并正在散粉的花（携带雄配子体标记）进行授粉。授粉后的柱头应在授粉后1小时内进行解剖。 请点击此处以查看此图的放大版本。
- 成像前一天早晨，选择 拟南芥 用于作为隔膜供体和柱头供体的植株；确保植株健康且 recently 开始产生角果。
注意：Landsberg erecta (Ler-0）是作为隔膜供体的优良材料，因为其隔膜坚固，且胚珠之间的节间较短。哥伦比亚（Col-0）是作为柱头供体的优良材料，因其似乎有利于花粉管的生长。 - 去雄至少三朵12B期隔膜供体花和12朵12B期柱头供体花，去除其雄蕊、萼片和花瓣（图1A，B同时去除同一花序上较老的花朵，以防其对去雄的花朵进行授粉。
- 第二天早晨，即24小时后，用已开始散粉的花粉供体花朵（例如，携带花粉管或精子细胞标记）对柱头供体进行授粉。当柱头几乎完全被花粉覆盖时，授粉完成。图1B).
4. 隔膜解剖
图2快速分离隔膜与柱头的指南 (A) 子房隔膜解剖步骤。用胰岛素注射针将雌蕊固定在双面胶带上，在花柱与子房交界处以及子房与花梗交界处进行切割，随后沿任一 carpel 的隔膜表面做浅切口（步骤1）。将 carpel 壁向后剥离并贴附于胶带上（步骤2）。在顶端隔膜下方切割 replum（步骤3）。在花柱处切割隔膜，并用镊子从花梗处将其移除（步骤4）。将隔膜置于琼脂培养基上，用镊子轻轻嵌入。B) 柱头解剖步骤。将雌蕊（已授粉）固定 <1 小时前）固定于双面胶带上，用剃刀片在花柱与子房连接处切割（步骤 6）。用胰岛素针将柱头置于琼脂培养基上，紧邻隔膜放置，并调整距离至约 250 µm （步骤7-8）。确保在卵孔周围及花柱基部形成半液体状的液滴（步骤9）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
- 授粉后30分钟，从果柄处采集健康且成熟的隔膜供体雌蕊，并将其放置在载玻片上新贴的双面胶带上，使柱头刚好位于胶带边缘之外。
注意：应尽量缩短雌蕊在胶带上的解剖时间。解剖过程应在高湿度环境中进行，可通过在载玻片旁放置加湿器来实现。 - 使用新的胰岛素注射器针头背面轻轻按压果柄及子房部位，将雌蕊牢固固定在胶带上，然后去除去雄后残留的萼片、花瓣和雄蕊残余物。
- 在体视显微镜下，用胰岛素注射器针头在每个心皮的花柱-子房连接处和子房-果柄连接处各做一切口，随后沿每个心皮的隔膜进行浅层切割（图2，步骤1）。
注意：沿隔膜切割过深会切断珠柄处的胚珠。 - 小心将子房壁向后剥离并贴附在胶带上（图2，步骤2），然后用针头轻轻滑入两个隔膜之间，从花柱端至果柄端全长切割中果轴，同时不扰动胚珠（图2，步骤3）。
注意：切割中果轴时应从花柱向果柄方向进行，以最大程度减少对上层隔膜上胚珠的扰动。 - 轻轻在上层隔膜与花柱及果柄的连接处进行切割，并从果柄一侧用镊子取出隔膜（图2，步骤4）。
注意：切割应保持平直且轻柔，以确保隔膜保持平整而不弯曲。 - 尽可能平整地将隔膜放置于培养基上，使胚珠的珠孔朝上并处于同一焦平面上。轻轻按压隔膜，直至胚珠略微嵌入培养基中（图2，步骤5）。
注意：必须确保隔膜放置位置使胚珠的珠孔能够被花粉管接触到（如有不可及的胚珠，可用针头轻轻调整其位置）。嵌入后，隔膜周围应形成少量液体积聚。 - 对另外最多两个雌蕊重复步骤4.1–4.6，将隔膜首尾相接放置。
5. 柱头解剖
- 将授粉后的柱头供体雌蕊放置在载玻片上新贴的双面胶带上，使子房-花柱连接处位于胶带边缘之外（图2，步骤6）。
- 使用新的剃须刀片沿花柱垂直向下切割，并将切下的部分抬起，使柱头保留在刀片上（图2，步骤6）。
注意：应在胶带边缘处切割，以获得最整齐的切口。 - 用胰岛素注射器针头将柱头从刀片上取下，并平放于距离胚珠约250–300 µm的位置（图2，步骤7–8）。
注意：花柱应水平侧向放置；否则，大多数花粉管将向下生长进入隔膜下方。当花柱在培养基上放置约1分钟后，其入口处应出现少量液体积聚；这是良好现象，表明花粉管可顺利从花柱中伸出。 - 重复步骤5.1–5.3，最多可处理12个柱头，每个隔膜两侧各放置两个。观察胚珠珠孔周围是否形成微小液滴；这有助于花粉管接近并准确靶向胚囊（图2，步骤9）。
注意：应尽量减少培养皿开启时间，以防培养基和胚珠干燥。
6. 成像
图3SIV 带有隔膜 成像方案 (A) 完整SIV 带有隔膜 通过体视显微镜观察到的结构，包含12个授粉后的柱头和3个隔膜。B) SIV 全病毒合并图像 带有隔膜 setup seen in A 孵育5小时后，使用10倍物镜观察，并标记五个概览区域（每个约1 mm），用于多阶段图像采集。绿色框显示的是花粉管在助细胞中发生爆发性破裂的胚珠。C) 不同时间点下概览区域2的近距离观察。在显微镜的保湿培养箱中孵育约3小时后，花粉管应已到达珠孔附近；至成像6小时时，大多数胚珠应已正确接收到花粉管（绿色方框）；随后这些胚珠会发生爆炸性花粉管破裂（星号）。比例尺 = (A）5 mm，（B,C) 500 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
- 完成解剖并准备好待成像的培养皿后，将其置于显微镜的湿度 chamber 中孵育，保持相对湿度为 92%，温度为 21 °C。
注意：若显微镜无可用的湿度 chamber，可在培养皿盖子和皿体外缘加入少量水，有助于维持培养皿内较高的湿度。 - 先在低光照强度下使用明场使样品聚焦，然后切换至荧光光源，并在载物台概览图中标记出需要成像的区域。
注意：在 10 倍放大倍数下，大约可标记五个区域，共覆盖三个心皮（图 3）。应尽量缩短标记概览区域所用的时间，以最大限度减少荧光光源引起的光毒性或样品升温。 - 采用多阶段采集方案开始成像，每个概览区域开始前启用自动对焦功能。由于花粉管通常在样品孵育约 1 小时后从花柱中伸出，因此可将采集时间推迟 2 小时，或等到花粉管到达珠孔后再开始。确保自动对焦设置的扫描范围为 100 µm（粗调步长 7 µm，细调步长 1 µm），以便在心皮随时间轻微移动和下沉时仍能保持胚珠处于焦点范围内。
- 在开始样品孵育后约 9 小时停止图像采集，此时大多数胚珠应已完成吸引并接收花粉管。
注意：若仅有少量胚珠成功吸引花粉管，建议使用体视显微镜仔细观察培养皿，以判断今后实验中胚珠或花柱的摆放方向是否可进一步优化。
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结果
为评估可接受助细胞核退化的时间点与花粉管破裂的关系 拟南芥， 并观察左侧或右侧助细胞是否注定会成为接受性助细胞， SIV 室间隔 此处所述方法采用了一种雌配子体核标记与助细胞胞质标记的组合。pFG:roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) 作为隔膜供体及雄性配子体标记物 (pLAT52:R-GECO)作为花粉供体。根据方案第4-5节，在去雄24小时后解剖隔膜和授粉柱头，并将其置于前一天制备好培养基的玻璃底培养皿中。每个培养皿置于显微镜上的湿度室中，使用10倍物镜（数值孔径：0.4）进行多阶段实验，共设置五个观察区域。图 3）。每个区域的图像以四个荧光通道每60秒采集一次，持续9小时：通道（1）560/640用于R-GECO（25毫秒），通道（2）488/520用于roGFP2-ORP1（60毫秒），通道（3）387/520用于roGFP2-ORP1（60毫秒），以及通道（4）387/640用于背景扣除（60毫秒）。表 1）。使用10...
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讨论
本文介绍了一种高效的小麦花粉管接收与双受精过程的成像方案 拟南芥改进的方法，SIV 有隔膜, 显著提高了每次成像过程中可观察到的成功花粉管接收事件的比例和总数。此处展示的代表性结果表明，在一次成像过程中记录到41次成功的花粉管接收事件，以及10个表现出接收缺陷的胚珠（效率约为80%）。这一成功事件数量超过采用原始SIV离体胚珠方法在总共八次成像会话中所捕获成功事件数量的两倍。视频 1）。使用SIV 带有隔膜 在五次技术重复中对共计八个隔膜进行该方法操作，与采用八次技术重复的SIV离体隔膜法相比，花粉管接收效率平均达到79%，而后者平均为28%图4).
尽管SIV cum septum 方法在花粉管接收效率方面显著更高，但花粉管过度生长的现象仍会以不同程度发生，其发生率受多种因素影响。最重要的是，助细胞必须在成像过程的数小时内保持存活并具有接受能力。在解剖和成像过程中维持湿润环境、使用新鲜配制的培养基、将胚珠和...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 Sara Simonini 和 Stefano Bencivenga 捐赠了 pFG:roGFP2-ORP1-NLS 载体，感谢 Christof Eichenberger、Johann Almendinger、Vincent Sutter 和 Celia Baroux 在显微镜技术方面提供的建议。我们诚挚感谢 Ravi Palanivelu、Philipp Denninger、Sharon Kessler、Mark Johnson、Tomokazu Kawashima 以及 2022 年国际植物有性生殖会议上的其他所有与会者，他们对本 SIV cum septum 实验方案表现出兴趣并提出了宝贵建议。本研究由苏黎世大学以及瑞士国家科学基金会授予 U.G. 的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mm 玻璃载片 | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿（14 mm 孔） | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 氯化钙 | Roth | CN93.1 | |
| 哥伦比亚型（Col-0） | 诺丁汉拟南芥种质中心（NASC） | 柱头供体 | |
| 解剖显微镜 | Olympus | SZX2-ILLT | |
| 胰岛素针头（0.3 G） | BD | 304000 | |
| 陆生生态型（Ler-0) | 诺丁汉拟南芥种质中心（NASC） | 隔膜供体 | |
| 硫酸镁 | Merck | 5886 | |
| 氯化钾 | Roth | 6781.1 | |
| 剃须刀片 | Beldura | 7026797 | |
| Scotch 双面胶带 | Scotch | 768720 | 较薄，适用于柱头解剖 |
| 氯化钠 | Roth | 3957.1 | |
| 蔗糖 | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa 双面胶带 | Tesa | 05681-00018 | 黏性很强，适用于隔膜解剖 |
| 超低凝胶化温度琼脂糖 | FMC SeaPrep | 50302 |
参考文献
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7(2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645(2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722(2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
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