在此，我们描述了一种对半体外 (SIV) 法用于观察花粉管导向与接收过程 拟南芥, 这会提高胚珠的接受性。高通量SIV 与隔膜 该方法可与配子体标记品系及基因编码的生物传感器联用，以监测受精过程的动态变化。
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本文内容
摘要
摘要
在开花植物中，花粉管（雄性配子体）在雌蕊内的生长与导向，以及雌性配子体对花粉管的接收，是实现双受精及后续种子发育的关键环节。雄性与雌性配子体在花粉管接收过程中的相互作用，最终导致花粉管破裂，释放出两个精子细胞以完成双受精。由于花粉管生长和双受精过程深藏于花部组织内部，该过程难以直接观察 体内.
一种用于模式植物 Arabidopsis thaliana 受精过程中活细胞成像的半体外（SIV）方法已被开发并应用于多项研究。这些研究有助于阐明开花植物受精过程的基本特征，以及雄性和雌性配子体相互作用期间发生的细胞和分子变化。然而，由于这些活细胞成像实验需要切除单个胚珠，每次成像的观察数量有限，使得该方法繁琐且耗时极长。此外，其他技术难题中常有报道指出花粉管在体外难以完成对胚珠的受精 ，这严重干扰了此类分析。
本文提供了一种详细的视频实验方案，用于以自动化和高通量的方式对花粉管接收及受精过程进行成像，每次成像可实现多达40次花粉管接收与破裂的观察。结合使用基因编码的生物传感器和标记品系，该方法能够在减少时间投入的同时生成大样本量的数据。本技术的关键细节与注意事项，包括花朵发育阶段的判定、组织解剖、培养基制备以及成像过程，均以视频形式进行了清晰展示，以促进未来在花粉管导向、接收及双受精动态研究领域的进一步探索。
引言
有性繁殖生物产生基因独特后代的过程依赖于雄性和雌性配子的成功融合。在开花植物中，双受精过程中两个雄性配子（精子细胞）与两个雌性配子（卵细胞和中央细胞）的结合依赖于精子从花粉管（雄配子体）中释放。这一过程称为花粉管接收，主要由位于胚囊（雌配子体）内的助细胞调控。1,2由于花粉管接收过程发生在花内部较深处，需要一种能够对这一过程进行活细胞成像的方法，称为半-体外 （SIV）花粉管接收机制已被建立3. 采用该方法，切除的 拟南芥 胚珠被置于半流体的花粉萌发培养基上，花粉管通过在花柱与维管束交界处切断的雌蕊的柱头和花柱生长，进而靶向胚珠3,4自该技术发展以来，细致的观察已推动了关于花粉管导向、识别与受精过程的多项发现。其中，这些发现包括花粉管通过柱头生长而获得靶向能力3，花粉管到达后协同细胞内钙振荡的起始5,6,7,8
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方案
注意：本实验方案所用材料与设备的清单，请参见材料表。
1. 成像实验设计的注意事项
- 预先确定成像所需的时间和采样频率，以准确捕捉待观察的目标现象。例如，根据奈奎斯特采样定理，采样频率必须大于输入信号最高频率的两倍。因此，为准确记录助细胞中细胞质游离钙离子浓度（[Ca2+]cyt）的振荡，建议每约10秒进行一次成像；而若要测量花粉管释放精子细胞时的运动速度，则需确保时间分辨率小于1秒10。
- 选择目标细胞的荧光标记物，其荧光强度应显著高于背景自发荧光。若使用生物传感器，应选择荧光最强且不影响细胞正常功能的品系，因其通常具有更高的灵敏度，并可减少曝光时间。
- 考虑最适合捕捉目标现象的荧光显微镜类型及放大倍数。使用宽场显微镜和低倍物镜可获得更大的景深，便于长时间维持聚焦，适用于成像较大的结构（如整个胚珠），或使用对色差伪影敏感的比率型传感器。若需更高分辨率以观察细胞及亚细胞结构，可选用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或双光子激发显微镜（2PEM）配合高倍物镜，但需注意长时间成像过程中维持聚焦的难度。
- 估算每次实验需成像的样本数量。例如，使用10倍物镜时，由于自动对焦和多视野采集功能所需时间，每次实验成像三个隔膜并最多记录约40个受精事件，每个样本....
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结果
为评估可接受助细胞核退化的时间点与花粉管破裂的关系 拟南芥， 并观察左侧或右侧助细胞是否注定会成为接受性助细胞， SIV 室间隔 此处所述方法采用了一种雌配子体核标记与助细胞胞质标记的组合。pFG:roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) 作为隔膜供体及雄性配子体标记物 (pLAT52:R-GECO)作为花粉供体。根据方案第4-5节，在去雄24小时后解剖隔膜和授粉柱头，并将其置于前一天制备好培养基的玻璃底培养皿中。每个培养皿置于显微镜上的湿度室中，使用10倍物镜（数值孔径：0.4）进行多阶段实验，共设置五个观察区域。图 3）。每个区域的图像以四个荧光通道每60秒采集一次，持续9小时：通道（1）560/640用于R-GECO（25毫秒），通道（2）488/520用于roGFP2-ORP1（60毫秒），通道（3）387/520用于roGFP2-ORP1（60毫秒），以及通道（4）387/640用于背景扣除（60毫秒）。表 1）。使用10.......
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讨论
本文介绍了一种高效的小麦花粉管接收与双受精过程的成像方案 拟南芥改进的方法，SIV 有隔膜, 显著提高了每次成像过程中可观察到的成功花粉管接收事件的比例和总数。此处展示的代表性结果表明，在一次成像过程中记录到41次成功的花粉管接收事件，以及10个表现出接收缺陷的胚珠（效率约为80%）。这一成功事件数量超过采用原始SIV离体胚珠方法在总共八次成像会话中所捕获成功事件数量的两倍。视频 1）。使用SIV 带有隔膜 在五次技术重复中对共计八个隔膜进行该方法操作，与采用八次技术重复的SIV离体隔膜法相比，花粉管接收效率平均达到79%，而后者平均为28%图4).
尽管SIV cum septum 方法在花粉管接收效率方面显著更高，但花粉管过度生长的现象仍会以不同程度发生，其发生率受多种因素影响。最重要的是，助细胞必须在成像过程的数小时内保持存活并具有接受能力。在解剖和成像过程中维持湿润环境、使用新鲜配制的培养基、将胚珠和.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 Sara Simonini 和 Stefano Bencivenga 捐赠了 pFG:roGFP2-ORP1-NLS 载体，感谢 Christof Eichenberger、Johann Almendinger、Vincent Sutter 和 Celia Baroux 在显微镜技术方面提供的建议。我们诚挚感谢 Ravi Palanivelu、Philipp Denninger、Sharon Kessler、Mark Johnson、Tomokazu Kawashima 以及 2022 年国际植物有性生殖会议上的其他所有与会者，他们对本 SIV cum septum 实验方案表现出兴趣并提出了宝贵建议。本研究由苏黎世大学以及瑞士国家科学基金会授予 U.G. 的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mm 玻璃载片 | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿（14 mm 孔） | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 氯化钙 | Roth | CN93.1 | |
| 哥伦比亚型（Col-0） | 诺丁汉拟南芥种质中心（NASC） | 柱头供体 | |
| 解剖显微镜 | Olympus | SZX2-ILLT | |
| 胰岛素针头（0.3 G） | BD | 304000 | |
| 陆生生态型（Ler-0) | 诺丁汉拟南芥种质中心（NASC） | 隔膜供体 | |
| 硫酸镁 | Merck | 5886 | |
| 氯化钾 | Roth | 6781.1 | |
| 剃须刀片 | Beldura | 7026797 | |
| Scotch 双面胶带 | Scotch | 768720 | 较薄，适用于柱头解剖 |
| 氯化钠 | Roth | 3957.1 | |
| 蔗糖 | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa 双面胶带 | Tesa | 05681-00018 | 黏性很强，适用于隔膜解剖 |
| 超低凝胶化温度琼脂糖 | FMC SeaPrep | 50302 |
参考文献
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control ....
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重印与许可
