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方法文章

建立一种用于小鼠睡眠剥夺的装置

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DOI：

10.3791/65157

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2023年9月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案介绍了一种基于经济型摇床平台装置的小鼠睡眠剥夺诱导方法。该装置已被证实可有效干扰小鼠脑电图（EEG）显示的睡眠模式，并诱导与睡眠剥夺相关的代谢和分子变化。

摘要

昼夜节律紊乱是指外部环境或行为与内源性分子钟之间失去同步，会显著损害健康。睡眠剥夺是导致昼夜节律紊乱最常见的原因之一。已有多种方法（例如水面平台、轻柔操作、滑动杆装置、旋转滚筒、轨道摇床等）被报道用于在小鼠中诱导睡眠剥夺，以研究其对健康的影响。本研究介绍了一种小鼠睡眠剥夺的替代方法。设计了一种基于自动化摇床平台的装置，该装置成本低廉，可高效地在可调节的时间间隔内对群养小鼠进行睡眠剥夺。该装置能诱导出典型的睡眠剥夺特征性变化，同时引发的应激反应最小。因此，该方法可能有助于研究人员探究睡眠剥夺对多种疾病发病机制的影响及其潜在机制。此外，当需要并行运行多个睡眠剥夺装置时，该方法提供了一种经济高效的解决方案。

引言

昼夜节律紊乱是指外部环境或行为与内源性生物钟之间的不同步。最常见的昼夜节律紊乱原因是睡眠剥夺1。睡眠剥夺不仅对人类健康产生负面影响，还显著增加多种疾病的风险，包括癌症2和心血管疾病3。然而，睡眠剥夺有害作用的潜在机制在很大程度上仍不清楚，建立睡眠剥夺模型对于深入理解这一问题至关重要。

已报道多种用于小鼠睡眠剥夺的方法，例如使用水平台4、轻柔干预5、滑动横杆装置6、旋转滚筒7以及笼具震荡方案5,8,9。滑动横杆装置通过自动推动横杆在笼底来回移动，迫使小鼠不断跨越横杆而保持清醒。笼具震荡方案则是将笼具置于实验室轨道摇床上，从而高效干扰睡眠。尽管这些方法具有自动化和高效的特点，但在需要并行运行多个设备时成本较高，尤其对于需要大量睡眠剥夺小鼠进行昼夜节律基因谱分析的特定研究设计而言更为显著。另一方面，水平台法和轻柔干预法成本较低且操作简便，是常用的睡眠剥夺诱导方法。然而，水平台法无法实现对预设的剥夺-休息周期的自动控制10,11，而轻柔干预则需要研究人员持续保持警觉以干扰小鼠睡眠。此外，其他方法如旋转滚筒可能因社会隔离或应激因素而产生混杂效应12。

受轨道摇床法的启发，我们旨在介绍一种基于摇摆平台装置的小鼠睡眠剥夺实验方案。该方法成本低廉、效果显著、应激性小、可控性强且可实现自动化。根据我们的实际条件，当前方案所构建的摇摆平台装置成本约为轨道摇床的十分之一。该装置能有效干扰群养小鼠的睡眠，并在应激反应最小的情况下诱导出典型的睡眠剥夺特征性变化。该方法特别适用于致力于研究睡眠剥夺对多种疾病发病机制的影响及其潜在机制的研究人员，尤其是在需要同时进行多组睡眠剥夺实验的研究中具有重要应用价值。

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方案

本研究中的所有动物实验方案均经上海交通大学医学院仁济医院实验动物福利伦理委员会批准。实验选用8至10周龄的雄性C57BL/6J小鼠。动物购自商业来源（见材料表）。构建该装置所需的主要部件列于图1A中。

1. 睡眠剥夺装置的制备

  1. 使用螺丝（参见材料表）将一根50 cm带槽钢制导轨的一端固定在一根40 cm带槽钢制导轨的中部，形成T形结构；重复此步骤，制作两个相同的T形结构（图1B-a）。
  2. 将两个T形结构平行竖立，相距30 cm，并使用螺丝通过一根30 cm可与螺丝配合的钢制圆柱体（参见材料表）连接两个T形结构的底部（图1B-b）。
  3. 在两个T形结构之间放置一个钢制矩形平台（20 × 25 cm）（参见材料表）（图1B-c）。
    注意：若无法获得指定尺寸的现成钢制矩形平台，可通过焊接2 mm厚的扁钢自行制作。
  4. 使用螺丝将平台上的30 cm可与螺丝配合的钢制圆柱体两端分别固定在两个T形结构顶部下方10 cm处安装的轴承上（图1B-d）。
  5. 使用螺丝将一个电机支架（参见材料表）固定在其中一个T形结构顶部下方25 cm处（图1B-e）。
    注意：也可使用结构胶替代螺丝，将电机支架固定在T形结构上。
  6. 使用螺丝将电机（参见材料表）安装在电机支架上（图1B-f）。
  7. 使用自锁带将一个散热风扇（参见材料表）固定在T形结构上，位于电机下方（图1B-g）。
  8. 使用螺丝将连杆的轴承端固定在面向电机的平台角落处（图1B-h）。
  9. 使用螺丝将连杆的另一端固定在电机的转轴上（图1B-i）。
  10. 使用电钻在塑料容器或标准动物笼具（参见材料表）的四个角各钻两个4 mm的孔，并在笼具左侧钻两个4 mm的孔和一个下方的6 mm孔（图1B-j）。
  11. 通过角落的孔，使用自锁带将笼具固定在矩形平台上（图1B-k）。
  12. 使用电钻在50 mL离心管盖上钻一个5 mm的孔，并插入带有球阀的长喷嘴以防止漏水。
    注意：若定制水瓶存在困难，水凝胶可作为供水的替代方案。
  13. 通过左侧的两个4 mm孔，使用自锁带将定制的水瓶固定在笼具左侧，使喷嘴穿过6 mm的孔（图1B-l）。
  14. 将电源适配器的输出电线连接至电机的两个接线端（图1B-l）。
    注意：将电线连接至电机接线端时无特定极性要求。
  15. 将电源适配器的输入电线连接至时间接触器（图1B-m）。

2. 诱导睡眠剥夺

  1. 分别按下时间接触器左侧和右侧最右侧的加号按钮（参见材料表），直至两侧机械计数器上均显示"M"（图1C-a）。
  2. 分别按下时间接触器左侧和右侧中间的加号按钮，直至两侧机械计数器上均显示"5M"（图1C-b）。
  3. 按下时间接触器左侧最左侧的加号按钮，直至左侧机械计数器上显示"15M"（图1C-c）。
    ​注意：此时时间接触器将以循环模式运行，开启15分钟，关闭5分钟。
  4. 将小鼠放入笼中，并自由供应水和食物。
  5. 为时间接触器和冷却风扇接通电源。
    注意：平台现在将以10 rpm的转速摆动。
  6. 每天在授时因子时间0（ZT0）称量每只小鼠的体重。
    ​注意：光照时间为上午8点（ZT0）至晚上8点（ZT12）。

3. 口服葡萄糖耐量试验

  1. 通过尾静脉采血，测定禁食小鼠的空腹血糖水平。
  2. 使用1 mL注射器，按每公斤体重2 g的剂量，将葡萄糖溶液腹腔注射至每只小鼠体内。
  3. 在注射葡萄糖后15分钟、30分钟、60分钟和120分钟，分别通过尾静脉采集血样，并检测血糖水平。
  4. 实验结束后，将小鼠放回笼中，自由摄食和饮水。

4. 脑组织的采集

  1. 将小鼠暴露于异氟烷（2%）中3-5分钟，待充分麻醉后断头处死。
  2. 暴露颅骨，并使用手术剪在颅骨上做1厘米的垂直切口。
  3. 使用蚊式止血钳（见材料表）移除颅骨，以暴露脑组织。
  4. 用弯头镊子轻柔地将整个脑组织从颅腔中取出。
    注：脑组织的移除应遵循当地的政策规定。
  5. 用冷的磷酸盐缓冲液（1x PBS，4 °C）清洗脑组织。
  6. 将完整的脑组织在液氮中速冻，然后转移至-80 °C长期保存。
    ​注：在-80 °C保存条件下，速冻脑组织至少可稳定保存6个月。

5. 采用聚合酶链式反应（PCR）检测基因表达

  1. 在 4 °C 或冰上解冻脑组织。
  2. 将组织转移至 1.5 mL 微量离心管中，并使用基于 TRIzol 的方法提取总 RNA13。
  3. RNA 提取后，使用分光光度计（参见 材料表）测定 RNA 浓度。
  4. 使用商业试剂盒将总 RNA（1 µg）逆转录为互补 DNA（cDNA）14。
  5. 通过实时逆转录聚合酶链反应测定基因表达水平15。

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结果

用于小鼠睡眠剥夺的既定装置如图1D所示。在开始睡眠剥夺后的第7天，脑电图（EEG）和肌电图（EMG）监测16结果显示，该装置显著减少了小鼠的睡眠时间并延长了清醒时间（图2A-D）。同时，当前实验方案显著增加了脑内腺苷的累积以及Homer1a的mRNA水平（图2E，F），这两者是睡眠剥夺成功实施的标志物17。使用ELISA试剂盒18检测发现，当前睡眠剥夺方案对血清皮质酮水平无显著影响（图2G）。经过7天的睡眠剥夺后，小鼠的体重和胸腺重量均显著下降（图3A-

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讨论

小鼠睡眠剥夺模型对于研究睡眠紊乱对多种疾病的影响至关重要，包括心血管疾病21、精神疾病22和神经系统疾病23。在现有小鼠睡眠剥夺策略中，通过反复短期中断睡眠的物理方法最为常用5,7,12。这些物理方法包括使用水平台4、轻柔干预5、滑动横杆装置6,24、旋转滚筒7或轨道摇床8,9,2...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了国家自然科学基金（82230014、81930007、82270342）、上海市优秀学术带头人计划（18XD1402400）、上海市科学技术委员会（22QA1405400、201409005200、20YF1426100）、上海浦江人才计划（2020PJD030）、上海市卫生健康系统优秀青年人才计划（2023-62）、上海老年医学与医学临床研究中心（19MC1910500）以及蚌埠医学院研究生创新计划（Byycxz21075）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管AxygenMCT-150-C-S
50 mL 离心管NEST602002
腺苷 ELISA 试剂盒瑞凡科技RF8885
动物笼具泽亚科技MJ2
血糖仪鱼跃580
C57BL/6J 小鼠杰思杰实验动物N/A年龄：8–10 周
连杆盛翔科技N/A长度：  20 cm
冷却风扇黎明EFB0805VH供电电压：5 V；功耗：1.2 W；风量：26.92 cfm；尺寸：40 mm × 40 mm × 56 mm
皮质酮 ELISA 试剂盒ElabscienceE-OSEL-M0001
脑电图/肌电图记录与分析系统Pinnacle Technology8200-K1-iSE3
异氟烷RWD20071302
蚊式止血钳FST13011-12手术器械
电机及电机支架明阳MY36GP-555供电电压：24 V 直流；轴径：8 mm；最大输出扭矩：100 Kgf·cm；最大输出转速：10 rpm
NanoDrop 2000cThermo ScientificNanoDrop 2000c
电源适配器明阳QiYe-0243输入电压：110–220 V 交流；输出电压：24 V 直流；输出电流：2 A；线缆长度：2 m
qPCR 商业试剂盒诺唯赞Q711-02
qPCR 检测设备罗氏480
带螺钉兼容钢制圆筒的矩形平台定制N/A宽度：20 cm；长度：25 cm；圆筒长度：30 cm；厚度：2 mm
逆转录 RNA 为 cDNA 商业试剂盒诺唯赞R323-01
螺钉与螺母固万基N/A内径：6 mm，12 mm
螺钉兼容钢制圆筒定制N/A长度：300 mm
带槽钢制通道定制N/A长度：400 mm 或 500 mm，厚度：2 mm
时间继电器力翔DH48S-S供电电压：110–220 V 交流；计量单位：小时、分钟、秒；触点配置：双刀双掷（DPDT）
TRIzol诺唯赞R401-01

参考文献

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