通过仪器工程实现柑橘接穗加工自动化以进行下游病原体检测

摘要

我们设计、制造并验证了一种可快速处理富含韧皮部的柑橘接穗组织的仪器。与现有方法相比，接穗组织提取仪（BTE）提高了样品通量，同时降低了所需的人力和设备成本。

摘要

柑橘的嫁接传播性韧皮部限制病原体，如病毒、类病毒和细菌，已在全球范围内引发严重流行病并造成重大经济损失。例如，柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus）已导致全球超过1亿棵柑橘树死亡，而"Candidatus Liberibacter asiaticus"仅在佛罗里达州就造成了90亿美元的损失。使用经病原体检测的柑橘接穗进行苗木繁殖，是防控此类病原体的关键措施。加州大学河滨分校的柑橘无性系保护计划（Citrus Clonal Protection Program, CCPP）每年利用聚合酶链式反应（PCR）检测技术，对来自柑橘接穗母树的数千个样本进行检测，以保护加利福尼亚州的柑橘产业，并向国家无病植株网络提供无病繁殖材料。然而，柑橘病毒和类病毒高通量分子检测中的一个严重瓶颈是植物组织处理步骤。

适当的组织制备对于提取高质量核酸并用于后续PCR检测至关重要。植物组织的切碎、称重、冷冻干燥、研磨以及低温离心等防止核酸降解的操作耗时且劳动强度大，并需要昂贵且专用的实验设备。本文介绍了专门设计用于快速处理富含韧皮部的柑橘接穗树皮组织的一种仪器——接穗组织提取仪（budwood tissue extractor, BTE）的验证结果。与现有方法相比，BTE使样本通量提高了100%，同时降低了人力成本和设备费用。本研究中，BTE提取样本的DNA得率为80.25 ng/µL，与CCPP手工切碎法（77.84 ng/µL）相当。该仪器及快速植物组织处理方案可惠及加利福尼亚州多家柑橘诊断实验室和项目，并有望成为全球其他木本多年生作物组织处理的示范系统。

引言

柑橘韧皮部限制性、可嫁接传播的病原体，如类病毒、病毒和细菌，已在全球所有柑橘种植区引发毁灭性流行病，并造成严重的经济损失。柑橘类病毒因其对具有重要经济价值的柑橘类型（如枳、枳杂交种、宽皮橘、克莱门蒂橘和柑橘）引起碎皮病和萎黄病，已成为限制生产的因素^1,2,3。在加利福尼亚州，随着消费者对易剥皮、分瓣和无籽果实的偏好转变，这些对类病毒敏感的柑橘类型构成了不断增长且盈利的“易剥柑橘”市场基础^4,5,6。因此，加利福尼亚州食品与农业部（CDFA）通过“柑橘苗圃种苗病虫害清洁计划—参议院法案140”对柑橘类病毒进行监管，CDFA植物病虫害诊断科的实验室每年进行数千次柑橘类病毒检测^7,8,9,10。自20世纪30年代全球疫情暴发以来，柑橘衰退病毒（CTV）已导致超过1亿棵柑橘树死亡^3,9,10,11。在加利福尼亚州，该病毒的茎陷点株系和破坏枳抗性的株系对价值36亿美元的加州柑橘产业构成严重威胁^12,13,14。因此，CDFA将CTV列为管制性A类植物害虫，中央加利福尼亚衰退病根除机构（CCTEA）的实验室每年开展广泛的田间调查并进行数千次病毒检测^15,16。据估计，细菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”（CLas）及其引起的黄龙病（HLB）已导致佛罗里达州柑橘种植面积减少40%、柑橘运营减少57%、近8,000个工作岗位流失，造成近90亿美元的经济损失^17,18。在加利福尼亚州，假设因HLB导致柑橘种植面积减少20%，预计将造成超过8,200个工作岗位流失，并使该州国内生产总值减少逾5亿美元。因此，柑橘病虫害预防计划每年投入超过4,000万美元用于调查、检测和根除加州境内的CLas^14,17,19,20。

管理柑橘类病毒、病毒和细菌的关键措施是使用经过病原体检测的繁殖材料（即接穗）进行植株培育。经过病原体检测的柑橘接穗是在综合性的检疫项目中生产并维持的，这些项目采用了先进的病原体清除与检测技术^10,21。位于加州大学河滨分校的柑橘克隆保护计划（Citrus Clonal Protection Program, CCPP）每年对大量新引入加州及美国的柑橘品种接穗样本以及柑橘接穗母树进行检测，以保护加州的柑橘产业，并支持国家清洁植株网络（National Clean Plant Network for Citrus）的运行^10,17,22。为了应对大规模的柑橘检测需求，高通量、可靠且成本效益高的病原体检测方法是CCPP等项目成功实施的基本组成部分^7,10,22。

尽管基于分子的病原体检测方法（如聚合酶链式反应，PCR）已显著提高了植物诊断实验室的检测通量，但根据我们的经验，高通量检测流程实施过程中最关键的瓶颈之一是植物组织样本的前处理步骤。这一问题在柑橘检测中尤为突出，因为目前可用于富含韧皮部组织（如叶片叶柄和接穗树皮）处理的方案均耗时耗力，且需要昂贵且专用的实验设备。这些方案通常包括手工切碎、称重、冷冻干燥、研磨以及低温离心，以避免核酸降解^8,23,24。例如，在CCPP诊断实验室中，样本前处理包括以下步骤：(i) 手工切碎（每位操作人员每小时处理6–9个样本），(ii) 冷冻干燥（16–24小时），(iii) 粉碎（30–60秒），以及(iv) 离心（1–2小时）。该过程还需要专用耗材（如高强度安全锁螺帽管、不锈钢研磨珠、适配器、刀片、手套）以及多种昂贵的实验设备（如超低温冰箱、冷冻干燥机、组织粉碎仪、液氮冷冻站、冷藏离心机）。

与任何行业一样，设备工程和流程自动化是降低成本、提高通量并提供高质量、均一产品与服务的关键。柑橘产业亟需低成本的组织处理设备，这类设备应操作简便、对操作人员技术要求低，便于推广至诊断实验室和田间现场应用，从而实现高通量样本处理，以支持下游病原体的快速检测。Technology Evolving Solutions（TES）与CCPP共同研发（即设计与制造）并验证（即使用柑橘样本进行测试，并与标准实验室流程进行比较）了一款低成本（即无需依赖专业实验室设备）的仪器，用于快速处理富含韧皮部的柑橘组织（即接穗枝条），该仪器被命名为接穗组织提取仪（budwood tissue extractor, BTE）。如图1所示，BTE包含一个用于供电和控制的底座组件，以及一个可拆卸的腔室，用于处理柑橘接穗。BTE腔室配备有专门设计的研磨轮，可有效剥离柑橘接穗上富含韧皮部的树皮组织。被粉碎的树皮组织通过滑道迅速排入含有提取缓冲液的注射器中，经过过滤后即可直接用于核酸的提取与纯化，无需额外的人工操作或预处理步骤（图1）。BTE系统还配备无纸化样本追踪应用程序和集成称重功能，可将样本处理信息实时记录至在线数据库中。

BTE 系统使 CCPP 的实验室诊断能力提高了 100% 以上，持续生产出适合纯化高质量核酸的柑橘组织提取物，并可用于通过 PCR 检测柑橘嫁接传播病原体的下游分析。更具体而言，BTE 将组织处理时间从 24 小时以上缩短至每样本约 3 分钟，替代了成本超过 60,000 美元的实验室仪器（图 2，步骤 2-4），并实现了更大样本量的处理。

本文展示了利用来自母树的柑橘接穗样品，通过BTE高通量柑橘树皮组织处理、核酸提取及病原体检测所获得的验证数据，样品包括分别来自CCPP Rubidoux检疫中心和Lindcove基础育种中心的所有相应阳性和阴性对照。我们还展示了与当前实验室流程相比的通量及处理时间的变化（图2）。此外，本研究为柑橘病原体检测实验室提供了详细的分步操作方案，并展示了BTE如何支持无病原体苗圃材料、病原体调查及根除计划的相关功能。

图1：接穗组织提取装置。 BTE包含一个用于供电和控制的底座组件，以及一个可拆卸的腔室，用于处理柑橘接穗。BTE腔室配备有专门设计的研磨轮，可剥离富含韧皮部的柑橘接穗树皮组织。粉碎后的树皮组织通过滑动出口快速排入注射器，经过滤后即可用于核酸提取与纯化，无需额外操作或预处理。缩写：BTE = budwood tissue extractor（接穗组织提取装置）。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：传统手工切碎实验流程与BTE处理方法的逐步对比。 BTE处理包括高通量柑橘树皮组织处理、核酸提取和病原体检测。各步骤所需时间在括号中注明。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 采集待运输的柑橘接穗样品

1. 向 Technology Evolving Solutions 发送一份包含树木信息的电子表格，以便其加载到网络服务器上（最终用户将能够创建新的树木记录）。
2. 使用手机应用程序 TES tracker 选择一棵树，并将一个近场通信（NFC）项圈标签靠近手机，以将树木信息写入该标签。
3. 将三至四段柑橘接穗样本插入兼容 BTE 的塑料袋载体中，并盖上盖子密封。
   1. 确保接穗长度不超过 8 英寸，且不短于 5 英寸。
      1. 如果接穗长度超过 8 英寸，使用无菌的一次性剃须刀片或经 10% 漂白剂溶液（1% 次氯酸钠）消毒过的修枝剪将其剪短。
      2. 如果接穗长度小于 5 英寸，则另取一段符合长度要求的接穗样本放入袋中。
   2. 用手或经 10% 漂白剂消毒的切割工具（1% 次氯酸钠）去除任何腋生枝条或大型刺状结构。
      注：此步骤至关重要，以确保接穗在腔室开口中更容易操作。
   3. 确保所用接穗无弯曲部分。若存在弯曲，应使用经 10% 漂白剂消毒的切割工具（1% 次氯酸钠）将其切除，仅将样本的直段部分放入 BTE 袋中。
      注：弯曲的接穗极难顺利插入仪器，可能导致树皮剥离不均匀。
4. 使用手机应用程序 TES tracker 扫描树木的 NFC 项圈标签，并将其与样本袋上的 NFC 夹式标签进行关联。
5. 注意接穗的粗细程度，因其决定了操作人员在 BTE 腔室内剥离富含韧皮部的接穗树皮的方式。
   1. 若接穗直径小于 0.20 英寸，剥离时需格外小心，因为腔室内高速旋转的线束可能将整个接穗从表层树皮一直粉碎至木质部和髓部等非富含韧皮部的组织。
   2. 优先选择较粗的接穗，因其更易于剥离树皮组织，同时避免损伤非富含韧皮部的内部组织。
6. 将样本放入带有若干冰袋的保温运输容器中。

2. 在通风橱中设置

注意：建议在通风橱内操作BTE。这将降低植物组织交叉污染和实验室污染的风险。

1. 使用10%（1%次氯酸钠）的喷雾瓶进行消毒。
   1. 喷洒生物安全柜表面，并让漂白剂停留约1分钟，然后用纸巾擦拭。
   2. 用漂白剂溶液喷湿一张纸巾，擦拭组织提取仪底座、电子天平组件（天平、防风罩和称量塔）以及记号笔。
2. 根据待处理样本的数量，拆开相应数量的一次性注射器套装，并将其放入一个带盖的纸盒中。
3. 在生物安全柜外准备一包棉签，以备需要时使用。
4. 准备电子天平。
   1. 将称量塔从天平上取下，按住电源按钮开机，待天平显示为0后，将称量塔放回天平中心位置。
   2. 将天平的防风罩从前方向滑动覆盖至天平上。
5. 通过翻转设备背面的开关来启动组织提取仪底座。确保盒子左侧的开关已按到底部位置。等待绿色LED灯闪烁，表明腔室已准备就绪。

3. 设置清洁站（补充图 S1）。

1. 在超声波清洗机中加入1升水。
2. 在超声波清洗机顶部覆盖两层垃圾袋。
3. 向超声波清洗机中倒入约5升10%次氯酸钠溶液（1%有效氯）。
4. 向水槽中加水，水量需足以浸没一个培养腔室。
5. 打开空气压缩机并开启阀门。
6. 设置挡板以承接腔室干燥过程中滴落的液体。

4. 用于柑橘接穗脱皮的BTE材料处理

1. 将腔室装载到 BTE Base 上。
   1. 准备BTE室。
      1. 将一个空的样品袋连接到腔室后端。使用两个O形圈将空袋固定在BTE腔室的后端喷嘴上。
      2. 检查刀片是否有磨损或损坏迹象，例如刀片与塑料连接处出现切口或刀尖出现切口。确保刀片上的箭头与单锁符号对齐。
      3. 确保腔室底部的排气阀朝向 O 符号。将透明盖子盖在腔室开口上，然后利用腔室右侧的轨道将透明的BTE滑块推入腔室。将腔室底部的锁扣尽可能推入滑块中。确保柱塞帽已安装在滑块顶部。
   2. 将腔室放置在BTE底座上，使BTE底座的喷嘴插入腔室后部。等待蓝色LED闪烁，表示放置成功。
2. 将样本加载到BTE底座上，通过移动NFC夹子标签上的白色贴纸至盒子右侧的Z区域。在Z区域以缓慢的圆周运动移动标签，直到黄灯开始闪烁。将样本固定到BTE底座上，并确保样本袋无破损；若发现破洞，请用胶带封补。将O型圈套在样本袋上，以将其牢固固定在BTE喷嘴前端。
3. 装载未使用的注射器组件。
   1. 将注射器套装去皮归零。将未使用的注射器套装放置于电子天平支架上。当红灯开始闪烁或天平显示为0时，取下注射器套装。
   2. 从带有滤器的注射器中取出活塞。确保液体位于底部（无滤器）的注射器中。将活塞放置在纸巾上或支架上，确保黑色活塞部分不接触任何表面。
   3. 将注射器连接至玻片出口端口，将出口端口插入注射器并旋转90°。
4. 处理接穗样品。
   警告：BTE 含有高速运动部件。所有操作必须在通风橱内进行。操作人员应佩戴护目镜、耳罩（或耳塞）以及其他所有个人防护装备（PPE），如手套和实验服。
   1. 按下顶部的黑色按钮以启动机器。在运行过程中的任意时刻，再次按压该按钮即可停止电机。
      注意：该设备具有速度和温度感应功能，以确保其正常运行。
   2. 通过袋子抓住一根接穗枝条，并将其穿过 顶部 BTE喷嘴的
   3. 用另一只手握住室另一侧的接穗枝条，缓慢地将其向下推进刀片中。注意听轻柔的嗡嗡声，这表明接穗的树皮正在被剥离。在推进过程中，缓慢地前后移动并同时旋转接穗。
      1. 如果听到响亮且剧烈的 chopping 声音，应迅速将枝条移至顶部和/或按下顶部按钮以停止电机。要停止电机，需使用右侧开关完成处理（见步骤 4.4.3.2）。
      2. 若切割时出口无物料排出，则表明腔室发生堵塞。关闭电机，取下滑动推杆盖，使用棉签的塑料部分将堵塞物从机器出口推出。使用右侧开关完成加工：上档 = 正向切割；中档 = 电机关闭；下档 = 反向切割。
   4. 对剩余的分支重复步骤 4.4.2 和步骤 4.4.3。
      注意：当注射器中植物组织填充量达到其容量的25%时，通常表明已剥离足够的接穗树皮。柑橘类植物的可嫁接传播病原体在树体内的分布可能不均，因此需从柑橘树冠的不同位置采集3至4份接穗样品。为确保最终研磨所得组织样本能全面代表整棵树的病原体状况，BTE载体袋中的每份接穗样品都必须参与最终组织样本的制备。
   5. 按下顶部黑色按钮以停止处理。等待指示灯再次开始黄色闪烁。
5. 核实样品重量。
   1. 将注射器旋转90°，向下拉动使其脱离。将活塞重新装回注射器，并将注射器放回支架上。
   2. 等待天平自动检测样品，并确定其是否在合适的重量范围内（0.25 ± 0.05 g）。如果样品重量过低（<0.20 g），重复步骤 4.4；红色 LED 将开始闪烁。如果样品重量过高（>0.30 g），则移除部分样品材料，此时黄色LED将开始较慢地闪烁。如果样品重量在称量范围内，绿色LED将开始闪烁。
6. 均质化接穗样本
   1. 从装有样品的注射器中取出活塞，将液体推入装有样品的注射器中，然后重新插入活塞。活塞推动缓冲液和植物汁液通过网状滤膜（截留较大的树皮组织碎片）并 通过 将橡胶管插入空的注射器中。
   2. 通过将缓冲液和植物汁液在两个注射器之间来回推注，混合样品。重复约3至4次，直至样品成为均一的绿色液体混合物。
   3. 充分匀浆后，将植物汁液样品推入无滤网的注射器中，然后拆下带滤网的橡胶管和注射器，与装有样品的注射器分离。
   4. 将植物汁液样品从注射器中推出，注入一个2 mL无菌微量离心管中，于−20 °C保存备用。使用永久性记号笔根据袋子编号标记样品。
      注意：步骤 4.6.5 获得的植物样品汁液现在可采用任何可用的基于苯酚-氯仿、硅胶柱或磁珠的核酸、RNA 或 DNA 提取方法进行处理^9,25,26,27 用于核酸提取与纯化（见步骤7）以及柑橘嫁接传播病原体的下游检测（见步骤8）。

5. 清洁BTE可拆卸腔室

警告：如果注射器套装中的缓冲液沾到腔室或载玻片上，应立即冲洗，并在清洁前遵守实验室的所有安全规则。注射器套装中含有硫氰酸胍。若该缓冲液与漂白剂接触，将产生氰化物气体。

1. 在腔室处理完第10个样本后执行以下步骤。注意绿色LED灯将持续闪烁，而不会转为蓝色闪烁。
2. 拆卸BTE腔室以清除所有可能的污染物；取下透明塑料盖，清洁腔室载片，并清理腔室载片上的堵塞口。
3. 将腔室底部的排气阀转至开启位置（打开挂锁标记）。将腔室组件放入已准备好的超声波清洗机中（参见步骤3.1）。将盖子置于腔室下方，防止其漂浮。运行超声波清洗机15分钟。
   注意：超声波清洗浴槽（5 L）最多可容纳两个腔室。
4. 将腔室组件在水浴中（步骤3.4）冲洗至少30秒。将腔室组件转移至干燥站。
   警告：干燥过程可能导致腔室内高速运动部件、产生较大噪音（约85分贝[dB]）以及可能的液体飞溅。所有操作人员应佩戴防护眼镜、耳罩（或耳塞）、实验服，以及根据实验室安全规定要求的其他个人防护装备（PPE）。
5. 干燥BTE腔室。
   1. 将气枪对准腔室上部开口的凹槽（即通常放置载片的位置）。按下气枪扳机，吹气约30秒。
      注意：确保开口方向远离操作人员朝向背景板。此操作应使刀片组旋转，以去除其下方滞留的液体。
   2. 将气枪对准腔室顶部的喷嘴。按下气枪扳机，缓慢地在每个喷嘴入口处完整绕行三圈。
   3. 将气枪置于BTE中心位置。从最内侧开始，持续按住扳机，移动气枪直至其指向载片所在位置。
   4. 快速对整个腔室的前后面吹气，以去除外部表面的水分。
6. 干燥BTE载片。
   1. 将气枪插入载片的推杆槽中，按下扳机，将水从载片出口吹出。
   2. 用气枪沿载片内表面吹气以进行干燥。
   3. 用气枪沿载片凹槽吹气，以排出残留水分。
   4. 快速对整个载片外表面吹气，以去除表面水分。
7. 干燥其他组件。
   1. 用手握住载片推杆帽和O型圈，按下气枪扳机进行吹干。
   2. 用气枪对准盖子内表面吹气。
   3. 将组件放回腔室和载片中继续干燥，或进行重新组装。
      ​注意：对于具有多个功能正常BTE的高通量组织处理环境，可提供批量消毒系统，该系统能够同时对10个腔室进行去污处理。

6. 处置与消毒

1. 将注射器和橡胶管弃置于指定的胍废液容器中。
2. 将任何植物材料弃置于生物危害废物容器中。
3. 从BTE底座上取下BTE腔室。
4. 拆解BTE腔室，并按照步骤5所述进行去污染处理。

7. BTE 柑橘接穗提取物中组织处理及纯化 RNA 质量的评估

注意：在本实验方案中，我们使用了来自255棵柑橘树的接穗样品，比较了采用BTE方法处理柑橘接穗组织所需的时间以及从树皮组织提取物中纯化RNA的质量（图2右侧，步骤1、步骤5和步骤6），与Dang等人²³所述的经监管批准的柑橘接穗组织处理方法（包括手工剥皮和切碎、冷冻干燥、研磨及树皮组织离心）所制备样品的相应指标（图2左侧，步骤1-6）。

1. 当前实验室操作流程：按照监管机构批准的方法准备接穗样本以进行组织处理²³。
   1. 根据 Dang 等人所述方法进行手工剥皮和切碎树皮组织、冷冻干燥、研磨、离心，并将植物汁液转移至RNA提取管中²³（图2，左侧，步骤1-6）。
   2. 从每棵待测树木中手工剥离三到四个接穗样本后，将所有接穗放入与BTE兼容的塑料袋载体中，并于4 °C保存，直至进行BTE处理（步骤7.2）。
2. BTE操作流程：启动BTE柑橘接穗组织处理（第4节，步骤4.1–4.6；图2，右侧，步骤1、步骤5和步骤6）。
   1. 使用步骤7.1.2中保存在BTE载体袋内的接穗样本。
3. 采用监管机构批准的基于磁珠的半自动化方法，从当前实验室流程（步骤7.1.1）和BTE流程（步骤7.2.2）获得的植物汁液中提取并纯化RNA^8,23,28。
4. 通过测定RNA的浓度、纯度和完整性来评估其质量^{8,23,24,29,33,31}。
   1. 使用260 nm波长下的分光光度法和光密度（OD）测定值计算浓度。
   2. 使用分光光度法测定260/280的OD比值评估纯度。
   3. 通过靶向柑橘NADH脱氢酶基因mRNA的反转录（RT）定量聚合酶链式反应（qPCR）检测完整性^24,32。

8. 利用从BTE柑橘接穗提取物中纯化的RNA评估交叉污染及检测柑橘病毒和类病毒

注意：在本实验方案中，我们使用了来自72棵无病毒感染的柑橘树和1棵混合感染病毒与类病毒的柑橘树的接穗材料，以评估在使用BTE处理样本时（图2右侧，步骤1、步骤5和步骤6）样本间发生交叉污染的可能性，以及通过BTE从树皮组织提取物中纯化的RNA是否适合作为逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测柑橘病毒和类病毒的模板。

1. 首次BTE样品处理：使用72个未感染样品进行基线实验。
   1. 准备三个（A-C）BTE腔室（步骤4.1.1）。
   2. 将所有未感染的柑橘接穗样品（1-72）分别装入BTE载体袋中，并使用双注射器BTE样品采集系统准备相同数量（72个）的样品，每个样品对应一套注射器系统（步骤2.4）。
   3. 将样品载体袋和样品采集注射器分为六批（I-VI），每批包含12个样品。
   4. 按照以下顺序启动BTE柑橘接穗组织处理（步骤4）（见步骤8.1.4.1-8.1.4.6）（参见表1，首次BTE样品处理）。
      1. 对于第I批/样品1-12，使用腔室A处理12个样品。在处理完第12个样品后对腔室A进行消毒（步骤5）。
      2. 对于第II批/样品13-24，使用腔室B处理12个样品。在处理完第24个样品后对腔室B进行消毒（步骤5）。
      3. 对于第III批/样品25-36，使用腔室C处理12个样品。在处理完第36个样品后对腔室C进行消毒（步骤5）。
      4. 对于第IV批/样品37-48，使用已消毒的腔室A处理12个样品（步骤8.1.4.1）。
      5. 对于第V批/样品49-60，使用已消毒的腔室B处理12个样品（步骤8.1.4.2）。
      6. 对于第VI批/样品60-72，使用已消毒的腔室C处理12个样品（步骤8.1.4.3）。
   5. 将装有所有样品的BTE载体袋于4 °C保存，直至步骤8.2中使用。
   6. 采用经监管批准的半自动化磁珠法，从步骤8.1.4.1-8.1.4.6生成的72个植物汁液样品中提取并纯化RNA^8,23,28。
   7. 按照先前描述的方法进行RT-qPCR，以检测柑橘病毒和类病毒^8,33。
2. 第二次BTE样品处理：使用70个未感染样品和两个混合感染样品进行交叉污染实验。
   1. 准备三个（A-C）BTE腔室（步骤4.1.1）。
   2. 将混合感染的柑橘接穗样品（73）装入两个BTE载体袋中（步骤1.3），共获得两个感染样品。
   3. 从步骤8.1.5中收集装有未感染柑橘接穗样品的BTE载体袋，但排除样品3（第I批）和样品51（第V批）（见步骤8.2.4中的样品替换），共计70个未感染样品。
   4. 将第一个含混合感染样品73的BTE载体袋替换至第I批的样品3位置，第二个替换至第V批的样品51位置，共组成72个样品。
   5. 使用双注射器BTE样品采集系统准备相同数量（72个）的样品，每个样品配备一套双注射器系统（步骤2.4）。
   6. 将72个样品载体袋和样品采集注射器分为六批（I-VI），每批12个样品。
   7. 按照与步骤8.1.4.1-8.1.4.6相同的顺序启动BTE柑橘接穗组织处理（步骤4）。
      注：唯一区别是将第I批的样品3和第V批的样品51替换为感染样品73（步骤8.2.4）（表1，第二次BTE样品处理）。
   8. 按照步骤8.1.6的方法，从步骤8.2.7生成的72个植物汁液样品中提取并纯化RNA。
   9. 按照步骤8.1.7的方法进行RT-qPCR，以检测柑橘病毒和类病毒。

结果

利用BTE处理的接穗柑橘组织进行RNA提取、纯化及质量评估，并比较组织处理所需时间
本实验采用255株代表性柑橘植株的接穗样品，比较BTE法与标准方法所提取RNA的质量。样品通过接穗组织提取仪（BTE）进行处理（操作步骤4.1–4.6及图2右侧的步骤1、步骤5和步骤6），或按照监管机构批准的柑橘接穗组织处理方法制备，后者包括手工剥皮与切碎、冷冻干燥、研磨粉碎以及树皮组织的离心，具体方法见Dang等人的文献²³（图2左侧，步骤1–6）。

将BTE与传统的手工切碎及实验室设备方案在柑橘组织处理中进行并行比较，结果表明，所提取的核酸质量（即浓度、纯度和完整性）（图3A-C）以及用于柑橘病原体PCR检测的适用性（数据未显示）相当。同时，采用TE/BTE系统显...

讨论

随着柑橘黄龙病（HLB）的出现，为了减少损失，柑橘产业、监管机构和诊断实验室被敦促依赖高通量核酸提取方法，结合低通量的手动样品处理和病原体检测分析技术（如qPCR³⁴），对单株柑橘树进行检测，同时配合病害管理措施³⁵。加利福尼亚州的HLB阳性率已从2012年的0.01%上升至2020年的1.2%。尽管qPCR是一种强大且可靠的病原体检测工具，但目前可用的技术无法采集和处理足够量的植物组织，导致对加利福尼亚州柑橘树中的亚洲韧皮杆菌（CLas）存在明显的采样不足和检测不足。采样不足和检测不足既体现在被检测树木的数量上，也体现在每棵树所处理的植物材料数量（即叶片数量）上；并且由于受感染叶片在树冠内的分布具有随机性，早期或轻度感染极易被遗漏。当前的采样和CLas检测方法因成本（如人力和设备）限制，难以随检测需求的增加而扩大规模。目前，加利福尼亚州大多数柑橘诊断实验室用于获取适合柑橘病原体检测的核酸的样品处理方法，需要超过17小时的手动操作，以及成本超过10万美元的专业耗材和设备。

本文介绍了用于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.08" 六角割草线	PowerCare	FPRO07065	更换刀片时需要使用
1 马力，8 加仑空气压缩机	California Air Tools	8010	冲洗后快速干燥腔室
1.5 mL 微量离心管	Globe Scientific	111558B	用注射器冲洗后储存样品
10 mL 注射器套装	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	用于切割注射器材料。含硫氰酸胍缓冲液的 1 L 瓶装。警告——含有硫氰酸胍，需使用危险废物处理服务——切勿与漂白剂混合
12" 尺子	Westcott	‎16012	切割前测量割草线长度
12% 次氯酸钠	Hasa	1041	处理后对腔室进行消毒
-20 °C 冰箱	Insignia	NS-CZ70WH0	处理后储存样品
4" × 12" 塑料袋	Plymor	FP20-4x12-10	运输过程中用于盛放枝条。O型圈将袋子连接到BTE腔室以实现密封
6" 棉签	Puritan	806-PCL	用于清除堵塞的棉签
7 加仑储物箱	HDX	206152	用于盛放次氯酸钠溶液以消毒腔室，以及用于冲洗腔室的水
气动吹枪	JASTIND	‎JTABG103A	将高压空气导入腔室
黑色记号笔	Sharpie	S-19421	标记1.5 mL离心管，以便后续识别样品
瓶口分液器	Brand	Z627569	可调节的瓶口分液器，用于将硫氰酸胍加入注射器中
BTE腔室	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	用于处理接穗枝条。包含O型圈、BTE滑块、滑动活塞、排水阀、盖子、刀片组及刀片组拆卸工具
洗洁精	Dawn	57445CT	表面活性剂，可增强次氯酸钠对腔室的渗透性
带HEPA过滤器的通风橱	Air Science	P5-36XT-A	带HEPA过滤器的通风橱（ASTS-030） ，用于减少可能的污染并防止化学液体溅出
隔热泡沫运输容器	PolarTech	261/J50C	隔热运输容器，用于采集后在冰上运送样品
实验服	Red Kap	KP14WH LN 46	实验服，用于减少可能的污染并防止化学液体溅出
笔记本电脑	Microsoft	Surface	具备Wi-Fi功能的笔记本电脑，用于运行TES图形用户界面。初始设置需要使用，可提供有关组织处理底座的更详细信息
支持NFC功能的手机	Samsung	Galaxy S9	用于下载并使用TES手机应用程序的手机
NFC夹式标签	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	可与树木关联的样品标签。设计用于与TES手机应用程序配合使用
NFC颈圈标签	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	固定在树木上的标签。设计用于与TES手机应用程序配合使用
腈类手套	Usa Scientific	3915-4400	手套，用于减少可能的污染并防止化学液体溅出
降噪耳罩	3M	90565-4DC-PS	操作空气压缩机和组织处理底座时保护耳朵
聚氨酯回弹空气软管	FYPower	‎510019	连接气枪与压缩机
安全护目镜	Solidwork	SW8329-US	防护眼睛免受化学和物理危害
喷雾瓶	JohnBee	B08QM81BJV	喷洒漂白剂以对表面进行去污
组织提取底座	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	用于处理植物组织的系统。需配合BTE或LTE腔室使用。包含电源线、刀片适配器和8/32" 内六角扳手
组织处理底座称重秤	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	量程200 g、分辨率为0.01的称重秤，可连接至组织处理底座以强制执行重量范围和/或关联样品重量。包含秤体、电源线、连接线缆、5 mL注射器支架和塔式气流屏蔽罩
蛭石	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	使用危险废物处理服务运输危险废物（硫氰酸胍）时所需
电线剪	Boenfu	‎BOWC-06002-US	用于剪断割草线的剪线钳