新生小鼠耳蜗全组织外植体作为 体外 模型

摘要

本方案更新了以往的实验方法，纳入了相对简便的高质 Cochlear 外植体培养技术。该方法可实现活细胞和固定细胞的可靠数据采集与高分辨率成像，支持对内耳细胞持续深入的研究趋势。

摘要

未经治疗的听力损失给全球医疗保健系统带来巨大负担，并损害个人的生活质量。感音神经性听力损失的特点是耳蜗内感觉毛细胞和听觉神经发生累积性且不可逆的丧失。完整且有活性的耳蜗组织外植体是听力研究中的基本工具之一，可用于检测毛细胞的丢失，并表征内耳细胞的分子机制。多年前已建立了一种针对新生期耳蜗分离的实验方案，尽管该方案历经多次改进，但仍具有进一步优化的潜力。

本文介绍了一种优化的方案，用于在多孔培养板中分离和培养完整的新生耳蜗组织块，从而能够研究耳蜗全长上的毛细胞与螺旋神经节神经元细胞。该方案已在小鼠和大鼠的耳蜗组织块中进行了验证。所获得的健康耳蜗组织块可用于研究毛细胞、螺旋神经节神经元细胞及其周围支持细胞之间的相互作用。

该方法的主要优势之一在于，它在不降低外植体质量的前提下简化了器官培养的步骤。耳蜗柯蒂器官的三个螺旋圈均贴附于培养腔底部，这有利于 体外 实验及外植体的综合分析。我们提供了一些来自不同实验的耳蜗图像示例，包括活体和固定外植体，证明外植体在接触耳毒性药物后仍能保持其结构完整性。该优化方案可广泛用于哺乳动物耳蜗的整合分析。

引言

大多数感音神经性听力损失病例是由于感觉毛细胞、听觉神经细胞和/或听觉突触的退化所致¹。感觉细胞中的这种退行性过程是渐进性的，通常不可逆，从而导致听力下降²。因此，了解感觉细胞在应激条件下的存活状态以及信号通路的变化，对于保护细胞免受损伤及防止听力丧失至关重要。通过体外培养耳蜗组织外植体，可以重现耳蜗组织的复杂结构并维持正常的细胞间网络，从而更准确地描述信号传导过程。为了建立耳毒性实验模型，常使用抗生素庆大霉素和化疗药物顺铂，因为它们已知具有耳毒性副作用³。

体外耳蜗组织块培养系统已历经开发与改进；然而，许多出版物中常常缺少对完整耳蜗组织块培养的逐步操作方案的详细描述。Parker 等人曾发表首个关于小鼠柯蒂氏器原代培养的视频方案，其中作者描述了感觉上皮的分离步骤、在玻璃盖玻片上的培养方法，以及通过电穿孔对组织块进行转染实验的操作⁴。此前还发表过另一项使用玻璃盖玻片的方案，该方案考虑了内耳细胞结构的组织排列方式⁵。另有报道采用 Millicell 膜作为培养基底，用于小鼠柯蒂氏器及前庭器官组织块的培养⁶。这些视频报告推动了该技术方法的优化，但仍存在一些亟待解决的挑战。为解决使用玻璃盖玻片和插入式培养装置所带来的一系列问题，本方案旨在简化器官培养流程，并获得高质量的耳蜗组织，以获取可靠的数据。该目标通过在实验过程中尽量减少对器官的直接操作，并在获取活细胞或固定细胞的高分辨率图像前避免器官转移来实现。

本方案更新了先前发表的体外培养系统，在耳蜗器官的分离及其转移至培养腔室方面引入了多项优化，并整合了一种新型载玻片培养腔室，以改善培养条件并便于后续分析。该优化方案降低了操作过程中对器官造成损伤的风险，此类损伤可能发生在更换培养基时使用玻璃盖玻片，或在将器官从盖玻片或膜上转移用于进一步分析的过程中^4,5,6。玻璃盖玻片相较于塑料材质具有更优的折射率，但其质地较脆，更容易破裂。本方案所使用的多孔培养腔固定于显微镜载玻片上，非常适合器官培养及高分辨率成像。分离后的器官通过刮勺进行转移，可确保器官以正确方向被置入腔室并滑入到位，而无需像以往推荐方法那样使用移液器施加外力^4,5,6。

含足够培养基的多孔聚-D-赖氨酸包被培养板，有助于器官转移并使外植体准确定位，无需施加黏附压力，同时避免器官重叠，如前所述。⁶此外，通过共聚焦Z轴层扫技术可解决意外的器官重叠和结构不均问题。该方案已针对多种应用进行了优化，包括小鼠和大鼠的组织块、耳蜗及柯蒂氏器的组织块、含血清与无血清培养基中的培养、耳毒性评估以及常规药物反应实验。耳蜗组织块被固定并孵育在底部为盖玻片的培养腔室中，这有助于耳蜗组织块在腔室中的贴附，从而在后续操作过程中实现最佳处理效果 体外 实验、耳蜗组织外植体的后期处理，以及活体和固定耳蜗外植体的成像。该方法简化了对柯蒂氏器全长的可视化及毛细胞的定量分析。此外，对支持细胞、螺旋神经节神经元细胞及神经突的评估也具有较高准确性。因此，本方案可用于哺乳动物耳蜗细胞的全面分析。

方案

所有动物实验均按照瑞士巴塞尔市动物福利委员会的指南和规定进行。实验使用出生后3-5天、性别不限的C57BL/6JR小鼠、Wistar大鼠以及STAT1缺陷型小鼠（混合C57BL/6-129/SvEv背景）⁷。

1. 包被多孔板室

1. 配制完全培养基。
   1. 对于耳蜗柯蒂氏器外植体，配制含有杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）、10% 胎牛血清（FBS）、25 mM HEPES 和 30 U/mL 青霉素的培养基。
   2. 对于耳蜗柯蒂氏器外植体和耳蜗外植体，配制含有 DMEM/F12、1× N2 添加剂、1× 不含抗氧化剂的 B27 添加剂以及 30 U/mL 青霉素的培养基。
2. 在超净工作台中，将 10 mL 细胞培养用水加入 5 mg 多聚-D-赖氨酸中，配制多聚-D-赖氨酸储备液。多聚-D-赖氨酸的终浓度为 0.5 mg/mL。
   注意：将剩余的储备液分装后，于 −20 °C 保存。
   1. 用无菌水将储备液按 1:10 比例稀释，配制多聚-D-赖氨酸工作液。
3. 在 8 孔板中每孔加入 150 µL 多聚-D-赖氨酸工作液，于室温孵育 30 分钟。
   注意：若使用 4 孔板，则每孔加入 300 µL 多聚-D-赖氨酸工作液。
4. 通过抽吸或移液方式吸除溶液。
5. 用 200 µL 无菌水洗涤 2 次，再用 200 µL 完全培养基或 DMEM 洗涤 1 次。
6. 每孔加入 150 µL 完全培养基。
   注意：若使用 4 孔板，则每孔加入 250 µL 完全培养基。
7. 将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中，至少预热 30 分钟后再接种外植体。

2. 颞骨的解剖

1. 用70%乙醇对手术台进行消毒，并将所有器械在玻璃微珠灭菌器中灭菌。
2. 在装有冰块的容器上放置一个无菌的60 mm培养皿。
3. 倒入几毫升1×磷酸盐缓冲液（PBS），并置于冰上保存。
   注意：在1×PBS中使用30 U/mL青霉素以避免细菌污染。
4. 在无菌托盘上放置无菌垫，用手术剪迅速将幼年动物头部剪下。如果污染频繁发生，可将头部浸入70%乙醇中5秒。
   注意： 本方案已针对出生后3至5天（P3-P5）的小鼠和大鼠进行过测试。较年长小鼠和大鼠的耳蜗组织更难解剖，且外植体在培养中的存活能力有限。
5. 将动物头部置于无菌垫上。去除下颌骨，提起皮肤并从颅骨上剥离。 
6. 用镊子夹住眼眶部位以固定颅骨。
7. 用锋利的手术刀沿矢状缝小心切开颅骨，然后在冠状缝区域切开，注意不要损伤耳蜗。
   注意：避免施加过大压力，避免手术刀前后移动，以免损伤耳蜗骨及耳蜗导管。
8. 小心地从两侧颅骨半片中移除脑组织。
9. 将颅骨半片转移至步骤2.3中准备好的含冰冻PBS的60 mm培养皿中。

3. 耳蜗的分离

1. 在显微镜下定位颞骨中的耳蜗。将镊子插入上半规管。
2. 使用胰岛素注射器（小鼠）或镊子（大鼠）松解耳蜗与颞骨之间的周围组织。
3. 小心地将颞骨从耳蜗上拉开，保持耳蜗与前庭相连，同时颞骨被移开。在推动颞骨之前，确保耳蜗已完全脱离周围组织。
   注意：施加过大的力量会损伤耳蜗管。
4. 固定耳蜗位置，另一只手小心去除软骨性耳蜗囊。将镊子尖端小心插入耳蜗顶部区域或各回旋之间（可见为一条白线），逐块去除囊膜，暴露耳蜗管。
5. 将镊子小心置于耳蜗下方，将其从前庭器官和颞骨上分离。
6. 将耳蜗转移至一个新的含有冰冻 PBS 的 60 mm 培养皿中。
7. 调整显微镜放大倍数，以便更清晰地观察组织块。
8. 进行柯蒂氏器组织块操作时，请遵循以下步骤：
   1. 用镊子夹住器官基部。在基部钩状区域用镊子轻轻夹取并去除耳蜗管。
   2. 将耳蜗管从蜗轴上小心展开，避免撕裂。
   3. 夹住器官基部，小心将螺旋韧带连同血管纹一并拉离去除。
      注意：也可通过夹住顶部区域而非基部区域来实现组织分离。此方法在分离大鼠器官或较年长的小鼠幼崽（>P5）时可能更有帮助。
   4. 夹住器官基部，小心地将前庭膜逐块撕除。
      注意：此步骤为可选，因为前庭膜通常不会干扰成像获取。
9. 进行耳蜗组织块操作时，请遵循以下步骤：
   1. 使用胰岛素注射器（小鼠）或镊子（大鼠）将螺旋神经节从骨性螺旋板上分离。
   2. 在分离过程中轻柔地展开蜗轴。
      注意：组织块可分割为两部分，以便于操作。
   3. 用镊子夹住钩状区域。
   4. 小心地将螺旋韧带连同血管纹一并拉除。
   5. 夹住器官基部，小心地将前庭膜逐块撕除。
      ​注意：建议执行此步骤，因为前庭膜通常会折叠并覆盖神经纤维，从而可能影响实验结果。

4. 耳蜗外植体的培养

1. 用实验 spatula 将培养皿中的组织块转移至多孔培养板中，使毛细胞朝上。转移时保留 几微升 1× PBS，以防止样品粘附在 spatula 上。
   注意：严重受损的组织块会粘附在 spatula 上。
2. 轻轻晃动 spatula，使组织块随培养液滑入孔中。每个 8 孔板的孔中放置一个组织块。
   注意：若组织块粘附在 spatula 上，可将 spatula 保持在培养液中，用镊子将其分离。操作时始终将镊子置于组织块内侧边缘（远离毛细胞一侧）。
3. 在显微镜下检查，确认组织块已正确放置（毛细胞朝上）并位于孔中央。
   注意：若组织块方向错误（毛细胞朝下），其横向常呈 U 形向上弯曲。可通过将 组织块移至孔的角落（此处培养液较多）并引导其旋转来纠正方向。
4. 使用 100 µL 移液器吸除 80 µL 培养液，并弃去。
5. 在显微镜下检查毛细胞和螺旋神经节神经元细胞是否可见。如有必要，可用镊子轻轻分开部分重叠的组织。
6. 吸除剩余培养液，静置约 10 秒。
7. 将培养液重新加入。先在组织块旁加入一至两滴培养液，其余培养液加在距离组织块较远的位置，以防止组织块脱落。
   注意：即使组织块已贴附于孔底，也应首先在组织块附近加入一至两滴培养液。这样可避免在加入剩余全部培养液 时将组织块冲起。
8. 将培养板放回培养箱，孵育 2 小时，使组织器官牢固贴附于孔底。
9. 吸除培养液，使用 100 µL 或 200 µL 移液器小心加入 300 µL 预先温育的新鲜完全培养液。请勿使用 1 mL 移液器。
   ​注意：如需进行预处理，可在贴附 2 小时后，加入含目标物质的 300 µL 完全培养液。若使用 4 孔板，则每孔可加至 500 µL。
10. 将培养板放回培养箱。

5. 耳毒性试剂的检测

1. 将外植体放置过夜，以适应培养条件并恢复。
2. 配制不同浓度的耳毒性试剂，以确定建立耳毒性模型的合适浓度，目标为约50%毛细胞丢失。庆大霉素使用50 µM至250 µM，顺铂使用40 µM至320 µM。顺铂溶液需新鲜配制，并避光保存。
3. 移除培养基，小心加入300 µL含有目标耳毒性药物的培养基。
4. 在37 °C下用庆大霉素和顺铂孵育外植体24至48小时，以评估毛细胞存活情况。
   注意：药物浓度和暴露时间应根据研究目的进行选择。本实验中外植体的保存时间最长测试至72小时。若计划进行长期培养，请勿使用血清。
5. 按照下一节步骤对耳蜗细胞进行染色。

6. 固定与免疫荧光

1. 实验结束时弃去培养基，并立即用 200 µL 预热的 1× PBS 清洗组织块。
2. 在通风橱中加入 200 µL 4% 多聚甲醛（PFA）固定组织块，固定 15 分钟。
   注意：PFA 为危险化学品，首次使用前请阅读材料安全数据表（MSDS）。
3. 用 200 µL 1× PBS 洗涤组织块两次。如需推迟染色步骤，可将组织块保存在 4 °C 的 1× PBS 中。
4. 配制通透液，成分为 1× PBS 和 1%–5% Triton-X100。
5. 弃去 1× PBS，加入 200 µL 通透液，孵育 15 分钟。
6. 配制封闭液。
   1. 对于耳蜗柯蒂氏器组织块，配制含 1× PBS、10% 正常山羊血清（NGS，若使用山羊来源的二抗，或与二抗同源物种的其他血清）的封闭液。若仅使用鬼笔环肽染色细胞，则可使用含 1%–5% 牛血清白蛋白（BSA）的封闭液。
   2. 对于耳蜗组织块，若使用小鼠来源的一抗（如小鼠抗 TuJ1 抗体）染色螺旋神经节细胞，需配制含 1× PBS、10% NGS 和 Fab 片段（山羊抗小鼠 IgG H+L Fab 片段，稀释比例 1:200）的封闭液。
7. 加入 200 µL 封闭液，孵育 1 小时。
8. 弃去封闭液。对于使用了 Fab 片段的组织块，加入 200 µL 4% PFA，孵育 5 分钟。
9. 用 1× PBS 洗涤组织块 5 分钟。
10. 配制抗体稀释液，成分为 1× PBS、5% NGS 和 0.1%–0.25% Triton-X100。
11. 将一抗用抗体稀释液稀释（MYO7A 抗体 ab3481 稀释比例为 1:500，或 MYO7A 138-1 稀释比例为 1:100）以标记毛细胞，TuJ1 抗体稀释比例为 1:400 以标记螺旋神经节神经元。
    注意：若毛细胞仅用鬼笔环肽标记，则将鬼笔环肽以 1:150 比例稀释于 1× PBS 中，室温孵育 40 分钟至 1 小时，随后进入步骤 6.22。
12. 设置阴性对照，即省略一抗，以检测二抗的非特异性结合。
13. 向相应孔中加入 170 µL 含一抗的抗体稀释液，于 4 °C 轻柔振荡（40–60 rpm）孵育过夜。
14. 用 1× PBS 洗涤组织块，每次 5 分钟，共洗涤 4 次。
15. 将二抗用抗体稀释液稀释（如山羊抗兔 Alexa Fluor 488 或山羊抗小鼠 Alexa Fluor 568 IgG，稀释比例为 1:500）。
16. 加入 170 µL 含二抗的抗体稀释液，室温孵育 1 小时。
    注意：从本步骤开始，需避免组织块长时间暴露于光照下。
17. 用 1× PBS 洗涤组织块，每次 5 分钟，共洗涤 2 次。
18. 如需对组织块进行连续双重标记，请继续下一步。加入第二种感兴趣的一抗（如用于标记毛细胞的 MYO7A 抗体），于 4 °C 轻柔振荡（40–60 rpm）孵育过夜。或者，可加入鬼笔环肽（1:150），室温孵育 40 分钟至 1 小时，随后进入步骤 6.22。
    注意：若两种一抗来自同一宿主物种，应采用连续标记法。在多重免疫荧光染色中，鬼笔环肽染色应在最后进行。
19. 用 1× PBS 洗涤组织块，每次 5 分钟，共洗涤 4 次。
20. 将二抗用抗体稀释液稀释（如山羊抗兔 Alexa Fluor 488 或山羊抗小鼠 Alexa Fluor 568 IgG，稀释比例为 1:500）。
21. 加入 170 µL 二抗溶液，室温孵育 1 小时。
22. 用 1× PBS 洗涤组织块，每次 5 分钟，共洗涤 2 次。
23. 配制 DAPI 储存液（1 mg/mL），于 −20 °C 保存。将储存液按 1:10 稀释，配制工作液（0.1 mg/mL），于 4 °C 保存。
    注意：若使用含 DAPI 的封片剂，则跳过步骤 23，直接进入步骤 26。
24. 将 DAPI 工作液用 1× PBS 按 1:100 稀释，加入 200 µL DAPI 溶液，孵育 5 分钟。
25. 用 1× PBS 洗涤组织块，每次 5 分钟，共洗涤 2 次。
26. 尽可能吸除 1× PBS，使腔室底部干燥，但切勿让组织块干燥。
27. 等待 2–5 秒，直接在组织块上滴加一滴封片剂。
    注意：由于表面张力作用，封片剂会停留在组织块上。可使用固化型封片剂。
28. 将腔室置于 4 °C 保存，待成像时取出。

7. 来自外植体的活细胞免疫荧光染色

1. 使用经过过夜培养后的分离外植体。
2. 移除培养基，并小心加入含有 125 µM 顺铂的 300 µL 培养基。
3. 将外植体继续培养 18 小时，以检测活体外植体中的线粒体超氧化物水平。
4. 药物处理结束后，弃去培养基。
5. 加入 300 µL 可渗透探针溶液，用于检测细胞内活性氧（ROS）（例如 250 nM 的 mito-hydroethidine）和/或 Caspase-3 活性（例如 2 µM 与核酸结合染料偶联的 DEVD 肽）。
6. 在 37 °C 下孵育 30 分钟。
7. 用 200 µL 预热的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）或适当的缓冲液轻轻洗涤外植体两次。
8. 在 2 小时内进行荧光成像，激发波长为 400 nm，发射光检测波长为 590 nm。
9. 实验结束后弃去培养基，并立即用 200 µL 预热的 1× PBS 洗涤外植体。
10. 固定外植体，并按照上述方法对外毛细胞进行染色。

8. 共聚焦成像观察

1. 使用配备转盘共聚焦单元的显微镜或配备点扫描共聚焦单元的共聚焦显微镜对耳蜗组织块进行成像。
2. 细胞计数时，使用配备20倍空气物镜（数值孔径：0.75）的转盘共聚焦系统采集图像；或者，使用配备40倍空气物镜（数值孔径：0.95）或100倍油镜（数值孔径：1.45）的点扫描共聚焦显微镜观察并计数突触，或对静纤毛进行成像。
   注意：应针对每个荧光通道调整激光强度和曝光时间，以避免图像过饱和或欠饱和。同一实验中的所有组织块应使用相同的成像参数。
3. 使用20倍空气物镜，结合z轴层扫（z-stack）和自动拼接工具，在显微镜上设置参数以获取整个耳蜗组织块的三维图像。小鼠组织块采用3 × 3个相邻视野（重叠15%），大鼠组织块采用4 × 4个相邻视野进行图像采集并拼接。
4. 使用显微镜配套软件或免费开源的FIJI软件⁸对图像进行处理。
   注意：去卷积（deconvolution）是一种图像处理技术，可用于共聚焦图像以增强其对比度和分辨率^9-11。

结果

本方案已在新生小鼠和大鼠的耳蜗上进行过测试。本文展示了来自不同实验的组织外植体图像。科尔蒂器官的外植体经庆大霉素或顺铂处理后，可观察到毛细胞丢失。在正常和应激条件下，科尔蒂器官的外植体均能保持其结构完整性和总长度（图1 和 图2）。先前暴露于顺铂的大鼠外植体中，沿其全长存活的毛细胞均可被单独识别（图1）。除了检测存活的毛细胞外，还可检测到正在经历凋亡的毛细胞（图2）。该方法有助于对存活细胞进行可视化和计数，且可采用深度学习方法完成，具体如先前所述¹²。此外，使用适当的细胞膜通透性探针，还可检测活体耳蜗细胞中的生物学过程（图3）。

对于包含螺旋神经节神经元的耳蜗外植体，可将外植体切成两部分，或切除顶区以提供更好的培养条件。本研究选择分离顶区，因为该区域在应激条件下受影响较小。图4展示了耳蜗外植体的基底区和中区。利用毛细胞标志物MYO7A标记出毛细胞。同样，利用神经元标志物TuJ1可识别健康的和受损的螺旋神经节细胞胞体及其神经突。螺旋神经节区域的分析可手动完成，也可使用开源软件（如FIJI）配合NeuronJ插件进行神经突追踪¹³，或使用TrackMate和Cellpose等扩展工具进行形态学分割^14,15。对小鼠外植体的进一步观察显示，耳蜗细胞及毛细胞静纤毛具有较高的分辨率（图5）。

图1：暴露于庆大霉素的大鼠耳蜗柯蒂氏器外植体。 代表性图像（最大强度投影）显示了（A）对照组和（B）庆大霉素暴露组（200 µM，持续24小时）的外植体。毛细胞用鬼笔环肽标记，可在整个耳蜗长度上清晰可见。为便于说明，图像以灰度显示。图像使用配备20倍物镜（数值孔径：0.75）的转盘共聚焦显微镜采集。比例尺 = 500 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：顺铂暴露后小鼠柯蒂氏器的组织块。 典型图像（最大强度投影）显示：（A）对照组和（B）顺铂暴露组（160 µM，持续48小时）的组织块。毛细胞用鬼笔环肽标记（红色），凋亡的毛细胞用荧光素标记。图像使用点扫描共聚焦显微镜和20倍物镜（数值孔径：0.75）采集。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：活体成像实验中来自耳蜗柯蒂氏器的组织块。 来自野生型小鼠的组织块代表性图像（最大强度投影），显示（A）对照组组织块和（B）经 125 µM 顺铂处理 18 小时的组织块。毛细胞使用 mito-hydroethidine 和 caspase-3 进行标记。图像使用转盘共聚焦显微镜和 20 倍物镜（数值孔径：0.75）采集。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：暴露于顺铂的STAT1基因敲除小鼠耳蜗外植体。 代表性图像（最大强度投影）显示（A）对照组外植体和（D）暴露于40 µM顺铂48小时的外植体。毛细胞胞体用MYO7A抗体标记（绿色），螺旋神经节细胞用TuJ1抗体（红色）以及DAPI核染色（蓝色）标记。图像使用点扫描共聚焦显微镜，配备20倍物镜（数值孔径：0.75），并附加2.15倍缩放（B、C、E、F）采集。比例尺 = （B、C、E、F）50 µm 和（A、D）200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：小鼠柯蒂氏器组织块。（A-D）来自野生型小鼠的全长组织块的代表性图像（最大强度投影）。（A、B）组织块经MYO7A抗体、鬼笔环肽及DAPI核染色标记。（B）在放大后的概览图中，可见由MYO7A抗体（绿色）标记的毛细胞胞体清晰可辨。（C、D）鬼笔环肽标记毛细胞的静纤毛和顶板。组织块经鬼笔环肽标记。（D）在放大后的概览图中，单个内毛细胞的静纤毛去卷积图像可被明确识别（下排），而单个外毛细胞的静纤毛则较难分辨（上排）。图A和C的图像使用转盘共聚焦显微镜配合20倍物镜（数值孔径：0.75）采集。图B的图像使用同一台显微镜，但采用40倍空气物镜（数值孔径：0.95）采集。图D的图像使用点扫描共聚焦显微镜配合100倍油镜（数值孔径：1.45）并附加3.46倍放大采集。每个XY层面扫描平均4次，像素大小为0.02 µm。比例尺 = （D）3 µm，（B）100 µm，以及（A、C）200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

更新本实验方案的目的是简化从组织块分离到活体及固定耳蜗细胞成像的各个步骤。我们在分离过程中优化了部分步骤，并引入了一些创新工具，旨在建立一个高效且顺畅的实验流程，以获得高质量的组织块。本方法是在以往报道^4,5基础上优化而成的实验方案。此外，目前一些研究缺乏逐步更新的操作流程。通过简化的组织块培养步骤，本方案可实现对保存良好的组织块进行便捷操作，这对于获得可重复的数据至关重要。采用带有聚合物盖玻片的多孔培养板用于内耳组织块培养，可改善器官的贴附性并有助于维持组织块的完整性。本文展示了在应激条件下进行的多个实验示例，以证明即使在毛细胞丢失和神经突受损的情况下，培养中的器官仍能保持其细胞结构的完整性。

培养内耳器官时面临的一个挑战是避免器官脱落和漂浮，因为这会影响外植体的完整性、对处理的反应以及后续的检测。此前，外植体通常在玻璃盖玻片上进行培养^4,5。尽管在玻璃表面培养似乎是一种可行的替代方法，但玻璃的包被过程耗时较长，且盖玻片本身易碎且操作困难。另一种使用Millipore细胞培养插入式小室的方案试图解决这一问题⁶。然而，该方案中将带有外植体的膜进行切割和转移的步骤仍较为精细且易损。此外，外植体在盖玻片的安装和封固过程中也可能受到损伤。在我们提出的方法中，一旦外植体被转移至聚-D-赖氨酸包被的培养腔室并放置于正确位置后，便无需进一步转移或加盖盖玻片。该方案的另一优势在于使用带有薄型透气性聚合物盖膜的腔室，可为器官外植体提供最佳的培养条件。该聚合物具有与玻璃相似的光学质量，因此适用于高分辨率显微镜下的细胞成像。

在大多数细胞和组织培养方案中，包括内耳外植体培养，均使用在培养基中添加血清的方法，通常添加1%-10%的胎牛血清（FBS）^4,5,6,16。血清的存在会影响实验的培养条件；因此，在某些情况下，更倾向于无血清培养。在耳蜗外植体的无血清培养中，可通过向DMEM中添加N2，或向Neurobasal-A培养基中添加N2来替代血清^5,6。为此，我们测试了外植体在有血清和无血清条件下的培养效果。在两种条件下，内耳细胞均保持活性，并对耳毒性条件产生反应。我们对这些条件测试了72小时，但外植体在体外培养中可维持更长时间，尤其是当使用无血清培养基并联合添加N2、B27及生长因子时，正如其他研究中所建议的那样^5,16。

除了耳蜗外植体分离过程中的一些常规关键步骤（如器官分离时长和所用抗生素）之外，本方案中还存在其他一些关键步骤，但这些问题均可控。本方法中的一个关键步骤与器官植入后腔室内残留的培养基体积有关，该体积已优化至可维持外植体存活并使其附着于底部表面的程度。另一个关键步骤是孵育时间，需保证足够时间使外植体附着于腔室底部。若孵育时间超过2小时且仅使用数微升培养基，可能会影响外植体的健康状态；而较短的孵育时间（如1小时）也可采用，前提是操作时需小心避免使外植体脱落。另一个重要方面是聚-D-赖氨酸的残留问题。必须严格遵循聚-D-赖氨酸的洗涤步骤，因其溴化物盐残留可能对细胞具有毒性。在精确完成洗涤步骤后，聚-D-赖氨酸涂层有助于外植体顺利贴附于腔室表面，从而可在其牢固附着于腔室底部前调整其位置。

该方法的一个局限性在于使用直立显微镜进行细胞成像。这对于仅配备倒置显微镜的实验室可能是一个重要问题。带有可拆卸硅胶腔室的玻片可用于直立和倒置显微镜观察；然而，我们使用聚-D-赖氨酸的包被条件需先进行测试。另一个局限性是腔室的储存问题，因为插入件不可移除，且单个腔室带盖的总高度接近11 mm，而标准显微镜载玻片的高度仅为1 mm。然而，8孔腔室比之前建议使用的4孔板占用空间更小¹⁶。

本文展示了使用两种显微镜获取的图像。点扫描共聚焦显微镜由于具有较薄的光学切片能力，可提供高分辨率的组织图像；而转盘共聚焦显微镜则在保持良好分辨率的同时，实现了更快的成像速度。内毛细胞（IHCs）和外毛细胞（OHCs）的静纤毛通过共聚焦显微镜得以观察。由于IHCs的静纤毛比OHCs的大，因此在本研究中能够反复且清晰地观察到。对于OHC的静纤毛，可采用其他替代型显微镜以改善可视化效果，例如超分辨率显微镜（SRM）。使用转盘显微镜获取的耳蜗组织块图像已足以支持利用深度学习方法进行自动毛细胞计数的便捷整合¹²。此外，较短的图像采集时间对于活细胞和活体组织实验尤为重要。本方案不仅限于新生小鼠耳蜗组织块，经过适当优化后，也可应用于前庭器官或胚胎组织等其他类型组织块的培养。

耳蜗细胞（如毛细胞和神经元）的定量分析 体外 对于评估细胞活力以及受损或丢失细胞的比例具有重要意义。对信号通路和细胞功能的研究有助于揭示细胞死亡与存活的机制。对胚胎期和新生期耳蜗组织的检测有助于研究耳蜗的发育阶段。因此，本方案将有助于优化 体外 内耳外植体研究，例如用于建立耳毒性模型、探究发育阶段、评估信号通路以及开展药物筛选研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 高透明度聚丙烯锥形管 17 x 120 mm 型号	FALCON	352096
45° 角度镊子	Fine Science Tools	11251-35
50 mL 聚丙烯锥形管 30 x 115 mm 型号	FALCON	352070
抗荧光淬灭封片剂	VECTASHIELD	H-1000
Alexa Fluor 568 鬼笔环肽	Thermofisher	2151755
抗 βIII 微管蛋白抗体 [TUJ-1]	Abcam	ab14545
含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂	VECTASHIELD	H-1200
抗肌球蛋白 VII 兔多克隆抗体	Abcam	ab3481
B-27 添加剂（50 倍浓度），不含抗氧化剂	Thermofisher	10889038
碳素钢手术刀片 23 号	Swann Moiton	210
CellEvent™ Caspase-3/7 绿色检测试剂	Thermofisher	C10723
DMEM/F-12 (1:1) (1 倍浓度) + GlutaMAX	Thermofisher	31331028
双头刮勺，一端弯曲	VWR	RSGA038.150
70% 体积比乙醇溶液 1,000 mL	bichsel	160 0 106 00
胎牛血清，经认证	Thermofisher	16000036
固定液：4% 多聚甲醛 PBS 溶液	Thermofisher	201255309/201255305
高强度冷卤素光源	Intralux®	5100
Huygens Professional 版本 21.10	Scientific Volume Imaging
ibidi µ-Slide 8 孔板	ibidi	80826
显微镜	LEICA	M80
显微镜	LEICA	MS5
MitoSOX™ 红色线粒体超氧化物指示剂，用于活细胞成像	Thermofisher	M36008
N2 添加剂（100 倍浓度）	Thermofisher	17502048
配备 Yokogawa CSU-W1 转盘共聚焦单元和 Photometrics Prime 95B 相机的 Nikon Eclipse Ti 显微镜	NIKON
配备 A1 点扫描共聚焦单元的 Nikon Eclipse Ti 显微镜	NIKON
手术剪刀	Fine Science Tools	14005-16
手术剪刀	Fine Science Tools	14088-10
手术镊子	Fine Science Tools	11008-15
PBS 缓冲液 pH 7.2 (1 倍浓度)，500 mL	Thermofisher	20012-019
青霉素	Sigma-Aldrich	P3032
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐，分子量 ≥ 30	Sigma-Aldrich	P7405
4 号手术刀柄	Fine Science Tools	10004-13
Steri 250 第二代灭菌器	Simon Keller AG	031100
灭菌器，干燥剂颗粒	Simon Keller AG	31120
组织培养皿 60 x 15 mm	FALCON	353802
组织培养皿 60 x 15 mm	FALCON	353004
Trito X-100	Sigma	T9284
非常规肌球蛋白-VIIa	发育研究杂交瘤库	138-1s
细胞培养级无菌水（不含抗菌剂），500 mL	Thermofisher	A12873-01