方法文章

利用藻红蛋白和藻蓝蛋白的强自发荧光对蓝细菌细胞中蛋白质进行免疫细胞化学可视化

DOI：

10.3791/65168

⸱

2023年9月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Microbiology, The Czech Academy of Sciences, 2Japan Fisheries Research and Education Agency, 3National Marine Fisheries Research Institute, 4Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University

本文内容

摘要

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本方案概述了在含有藻红蛋白的蓝细菌 Crocosphaera watsonii 中，在细胞水平上对特定蛋白质进行可视化和定量分析的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

展示了一种在细胞水平上对海洋蓝细菌细胞内特定蛋白质进行可视化和定量的实验方案 Crocosphaera watsonii，一种在贫营养海洋中至关重要的初级生产者和固氮生物。海洋自养型N固定研究中的一个挑战是2 区分探针来源的荧光信号与自发荧光是固氮菌（diazotrophs）研究中的一个关键问题。 C. watsonii 被选为代表含叶绿素、藻红蛋白和藻蓝蛋白的蓝细菌。该方案可实现蛋白质的简单且半定量可视化 C. watsonii 在单细胞水平上，该方法能够研究不同环境条件下目标蓝细菌中蛋白质的产生情况，从而评估其代谢活性。此外，固定和透化方法经过优化，可增强目标蛋白的荧光信号，以区分来自藻红蛋白和藻蓝红胆素的自发荧光。增强后的信号可通过共聚焦或宽场荧光显微镜进行观察。同时，使用Fiji软件对荧光强度进行半定量分析。这一单细胞分析流程可用于评估特定蛋白质含量在细胞间的异质性。该实验方案仅需常规设备，可在任何生命科学实验室中实施，并可轻松适配于其他含有藻红蛋白的蓝细菌细胞。

引言

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细胞间的生理差异（通常称为 "异质性"在包括蓝细菌在内的微生物代谢活动中的作用已通过克隆培养研究得到证实1,2,3,4。这种异质性包含了多种多样的代谢活动，例如细胞分裂5碳同化6,7,8和氮同化9,10例如，最近的研究表明 N2 固氮活性在群体蓝细菌中的研究 C. watsonii 和 C. subtropica (Cyanothece表现出单细胞水平的异质性，在群落中的部分细胞亚群中存在，而在其他细胞中则缺失。值得注意的是，氮吸收或氮2 细胞间的固定活性也存在差异 原位11,12

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方案

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1. 蓝细菌培养

  1. 培养 Crocosphaera watsonii PS0609 细胞在含 YBCII 培养基的锥形瓶或光生物反应器中27为确定培养物密度，可选用适当方法（如显微镜计数、流式细胞术、细胞计数器等）测定细胞密度。
  2. 保持细胞密度在约 ~1 × 104 至约 5 × 106 细胞/mL-1.

2. 试剂的制备

  1. 将100%甲醇保存在-20 °C。
  2. 磷酸盐缓冲液（PBS）：将1.36 g KH2PO4、1.42 g Na2HPO4、8.0 g NaCl和0.224 g KCl溶于0.8 L蒸馏水中，加水定容至1 L，调节pH至7.4，并进行高压灭菌（参见材料表）。
  3. PBS中的1%多聚甲醛（PFA）
    1.  在通风橱内的搅拌器上，将50 mL PBS加入玻璃烧杯中，加热至60 °C，并用搅拌器混合。
    2. 将0.5 g多聚甲醛粉末加入温热的PBS溶液中。通过移液管逐滴加入1 N NaOH，逐渐....

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结果

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在阴性对照中，观察到来自细胞外物质的荧光信号，其中 1st 未使用抗体（图1A-C）。与Rubisco蛋白大亚基（RbcL）结合的酪酰胺信号放大试剂的荧光信号在 C. watsonii 在荧光显微镜下使用DAPI滤光片进行紫外激发观察（图1D-F）。此外，还可观察到胞外聚合物（EPS）产生的荧光信号（图1C，F).

接下来，该方案被应用于固氮酶铁蛋白（NifH）的检测。为确认免疫化学反应所产生的荧光信号的特异性，使用Fiji软件对荧光强度进行定量分析。经完整方案处理的细胞所获得的信号强度显著高于未进行完整处理的细胞st 和/或 2nd 抗体（

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讨论

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对于蓝细菌，TSA 系统已在TSA-荧光中得到广泛应用 原位 杂交（TSA-FISH、CARD-FISH），靶向特定rRNA。然而，其在蛋白质检测方面的应用仍较为有限26在本研究中，采用TSA方法以实现细胞全层的N免疫检测2固氮蓝细菌 C. watsonii，结合基于先前文献的修改方案20显著的修订包括通透化步骤，通过溶菌酶和无色肽酶联合处理实现22，以及使用TSA系统进行信号增强23此外，利用TSA技术结合Fiji软件进行RGB图像分离，能够在藻红蛋白和藻蓝蛋白固有的自发荧光背景下，实现对抗体偶联荧光信号的可视化与定量分析。

在单细胞蓝细菌中对蛋白质进行可视化，可揭示细胞间蛋白质含量的差异。以往对蓝细菌细胞间代谢异质性的分析依赖于同位素比值质谱仪（NanoSIMS）11

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披露

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我们确认本研究不存在任何利益冲突。

致谢

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我们感谢 Radek Kana 博士和 Barbora Šedivá 在共聚焦显微分析方面的协助，以及 Roman Sobotka 博士和 Kateřina Bišová 博士在免疫检测和荧光显微分析方面的建议。本研究得到了捷克研究基金会 GAČR（项目编号 20-17627S，资助 OP 和 TM）、 日本学术振兴会（JSPS）与捷克科学院之间的 Mobility plus 项目（JPJSBP 120222502）以及 JSPS 科研费（项目编号 23H02301）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无色肽酶FUJIFILM014-09661
Alexa Fluor350Thermo ScientificB40952酪酰胺-350
Alexa Fluor405Thermo ScientificB48254酪酰胺-405
Alexa Fluor488 酪酰胺 SuperBoost 试剂盒Thermo ScientificB40922山羊抗兔 IgG
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA2153
离心机Eppendorf5804 R
离心管（15 mL）VWR525-1085用于收集细胞
共聚焦显微镜ZeissLSM880 配备 Airyscan
荧光显微镜OlympusBX51DAPI 滤光片：激发波长 360-370 nm，发射波长 420-460 nm
明胶Merk4070
共聚焦显微镜用高精度显微镜盖玻片DeckgläserNo. 1.5H
液体阻断剂 常规/迷你型大同产业株式会社Part 6505用于将细胞固定在载玻片上
溶菌酶ITW ReagentsA4972
甲醇Carl Roth67-56-1
磷酸二氢钾Penta12290
封片介质Sigma-Aldrich345789-20MLFluorSave 试剂
封片剂VectashildH-1300
共聚焦显微镜所用物镜ZeissPlan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
多聚赖氨酸包被载玻片Sigma-AldrichP0425-72EA
氯化钾 Lach-Ner
防漏管（1.5 mL）Eppendorf0030 120.086用于细胞处理和化学试剂储存
氯化钠 Penta16610
磷酸氢二钠 Penta15130
Triton X-100Sigma-AldrichX100

参考文献

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  1. Ackermann, M. A functional perspective on phenotypic heterogeneity in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 13 (8), 497-508 (2015).
  2. Schreiber, F., Ackermann, M. Environmental drivers of metabolic heterogeneity in clonal micro....

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Crocosphaera watsonii Fiji
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