方法文章

利用藻红蛋白和藻蓝蛋白的强自发荧光对蓝细菌细胞中蛋白质进行免疫细胞化学可视化

DOI：

10.3791/65168

⸱

2023年9月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Microbiology, The Czech Academy of Sciences, 2Japan Fisheries Research and Education Agency, 3National Marine Fisheries Research Institute, 4Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案概述了在含有藻红蛋白的蓝细菌 Crocosphaera watsonii 中，在细胞水平上对特定蛋白质进行可视化和定量分析的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

展示了一种在细胞水平上对海洋蓝细菌细胞内特定蛋白质进行可视化和定量的实验方案 Crocosphaera watsonii，一种在贫营养海洋中至关重要的初级生产者和固氮生物。海洋自养型N固定研究中的一个挑战是2 区分探针来源的荧光信号与自发荧光是固氮菌（diazotrophs）研究中的一个关键问题。 C. watsonii 被选为代表含叶绿素、藻红蛋白和藻蓝蛋白的蓝细菌。该方案可实现蛋白质的简单且半定量可视化 C. watsonii 在单细胞水平上，该方法能够研究不同环境条件下目标蓝细菌中蛋白质的产生情况，从而评估其代谢活性。此外，固定和透化方法经过优化，可增强目标蛋白的荧光信号，以区分来自藻红蛋白和藻蓝红胆素的自发荧光。增强后的信号可通过共聚焦或宽场荧光显微镜进行观察。同时，使用Fiji软件对荧光强度进行半定量分析。这一单细胞分析流程可用于评估特定蛋白质含量在细胞间的异质性。该实验方案仅需常规设备，可在任何生命科学实验室中实施，并可轻松适配于其他含有藻红蛋白的蓝细菌细胞。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞间的生理差异（通常称为 "异质性"在包括蓝细菌在内的微生物代谢活动中的作用已通过克隆培养研究得到证实1,2,3,4。这种异质性包含了多种多样的代谢活动，例如细胞分裂5碳同化6,7,8和氮同化9,10例如，最近的研究表明 N2 固氮活性在群体蓝细菌中的研究 C. watsonii 和 C. subtropica (Cyanothece表现出单细胞水平的异质性，在群落中的部分细胞亚群中存在，而在其他细胞中则缺失。值得注意的是，氮吸收或氮2 细胞间的固定活性也存在差异 原位11,12,13这些发现已通过稳定实验得到证实 15使用同位素比值质谱仪（NanoSIMS）进行的氮同位素分析14,15然而，尽管纳米二次离子质谱技术（NanoSIMS）为在单细胞水平上分析同位素组成提供了新的途径，但其应用仍受限于技术复杂性和高昂成本。

观察细胞内代谢活性异质性的另一种方法是通过免疫检测。早期研究已证实可在单个细胞中进行固氮酶的免疫检测，但由于光合色素产生的自发荧光，该方法面临挑战16,17,18。海洋蓝细菌，特别是适应大洋环境的主要固氮蓝细菌C. watsonii和Trichodesmium，含有大量藻胆素，可在较短波长下发射自发荧光：如藻红蛋白和藻蓝尿胆素19。为避免这种自发荧光干扰，蓝细菌研究中通常优先选用紫外激发的蓝光发射荧光染料16,20,21。然而，该策略并未始终取得成功，因为仅用一抗处理的细胞在紫外激发下会发出强烈的蓝色至蓝黄色自发荧光20,21。已有研究尝试通过在观察前对细胞进行蓝光或紫外光照射，以及使用半导体纳米晶体来减轻这一问题22。本研究采用了一种不同的策略，即利用酪胺信号放大系统（TSA）增强蛋白荧光信号，以实现对细胞内含量较低的蛋白质的可视化检测。

TSA（也称为催化报告分子沉积，CARD）是一种高灵敏度的酶促方法，可在免疫细胞化学中用于检测低丰度靶标。该技术利用过氧化物酶的催化活性，在过氧化氢存在下，将标记的酪胺原位共价沉积于靶蛋白附近in situ23,24。在过氧化氢存在时，过氧化物酶催化酪胺发生氧化缩合反应，生成具有反应活性的酪胺自由基，后者可与富含电子的基团（如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）结合25。与常规方法相比，该技术可将信号增强10至200倍，从而使信号可通过标准的显色或荧光技术进行检测。因此，该方法能够对异质细胞群体及稀有细胞亚群中的多种蛋白与表型标志物进行快速、同步的评估。值得注意的是，截至目前，免疫标记与TSA系统在蓝细菌中的联合应用仅见于一项研究，该研究实现了对Cylindrospermopsis raciborskii中石房蛤毒素的可视化26。

本文所述方法能够在单细胞水平上研究不同环境条件下蛋白质的产生情况，从而评估目标蓝细菌的代谢活性。C. watsonii 的全细胞免疫荧光蛋白检测技术可实现对单个细胞中蛋白质的快速且半定量的可视化观察。此外，该方法还可轻松适用于其他含有藻红蓝蛋白和藻红蛋白的蓝细菌细胞。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 蓝细菌培养

  1. 培养 Crocosphaera watsonii PS0609 细胞在含 YBCII 培养基的锥形瓶或光生物反应器中27为确定培养物密度，可选用适当方法（如显微镜计数、流式细胞术、细胞计数器等）测定细胞密度。
  2. 保持细胞密度在约 ~1 × 104 至约 5 × 106 细胞/mL-1.

2. 试剂的制备

  1. 将100%甲醇保存在-20 °C。
  2. 磷酸盐缓冲液（PBS）：将1.36 g KH2PO4、1.42 g Na2HPO4、8.0 g NaCl和0.224 g KCl溶于0.8 L蒸馏水中，加水定容至1 L，调节pH至7.4，并进行高压灭菌（参见材料表）。
  3. PBS中的1%多聚甲醛（PFA）
    1.  在通风橱内的搅拌器上，将50 mL PBS加入玻璃烧杯中，加热至60 °C，并用搅拌器混合。
    2. 将0.5 g多聚甲醛粉末加入温热的PBS溶液中。通过移液管逐滴加入1 N NaOH，逐渐提高pH值，直至溶液变透明。多聚甲醛完全溶解后，降低温度，然后过滤溶液。
    3. 用PBS将溶液体积调至40 mL。用少量稀盐酸调节pH至约6.9。将溶液保存于-20 °C。
  4. PBG封闭液（0.2%明胶 + 0.5%牛血清白蛋白；BSA，参见材料表）
    1. 在200 mL玻璃烧杯中，将0.2 g明胶和0.5 g BSA溶于100 mL PBS中。将混合物加热至60 °C并搅拌。然后分装至15 mL离心管中，于-20 °C保存。
  5. PBS中的0.2% Triton X-100：将20 µL Triton X-100加入10 mL PBS中。在15 mL离心管中配制，并于-20 °C保存。
  6. 0.5 M EDTA：将1.46 g EDTA溶于10 mL蒸馏水（DW）中，并调节pH至8.0（EDTA在pH < 8.0时不会溶解）。在15 mL离心管中配制，并于-20 °C保存。
  7. 1 M Tris HCl：将1.58 g Tris HCl溶于10 mL DW中，并调节pH至8.0。在15 mL离心管中配制，并于-20 °C保存。
  8. 50 mM Tris HCl：将0.079 g Tris HCl溶于10 mL DW中，并调节pH至7.0。在15 mL离心管中配制，并于-20 °C保存。
  9. 配制10 mg/mL溶菌酶：在15 mL离心管中加入100 mg溶菌酶、1 mL 0.5 M EDTA（pH 8）和1 mL 1 M Tris HCl（pH 8），再加入蒸馏水至总体积为10 mL。于使用当天新鲜配制。
  10. 10,000单位/mL无色肽酶：将0.011 g比活性为900单位/mg的无色肽酶（参见材料表）溶于1 mL DW中，充分混匀，并于-20 °C保存。
  11. 60单位/mL 无色肽酶工作液：将3 µL 10,000单位/mL无色肽酶加入0.5 mL 50 mM Tris HCl中。 于使用当天新鲜配制。
  12. 配制100倍浓度的酪胺储备液：将酪胺试剂溶于150 µL二甲基亚砜（DMSO）中。于2–8 °C保存，有效期最长6个月。
  13. 1倍反应缓冲液：将1滴20倍浓度的反应缓冲液加入1 mL DW中。也可用pH 7.4的Tris缓冲液替代。
  14. 反应终止试剂 溶液
    1. 反应终止试剂储备液：将1.45 mL 95%乙醇 加入酪胺信号放大试剂盒中的反应终止试剂小瓶中（参见材料表）。于-20 °C保存6个月。
    2. 反应终止试剂工作液：将反应终止试剂储备液用PBS稀释（1:11）。 于使用当天新鲜配制。
  15. 100倍浓度H2O2溶液：将1滴（约50 µL）H2O2加入1 mL DW中。 于使用当天新鲜配制。
  16. 酪胺工作液（终体积为510 µL）：按顺序在1.5 mL离心管中加入5 µL 100倍浓度酪胺储备液、5 µL 100倍浓度H2O2溶液和500 µL 1倍反应缓冲液，用移液器轻轻混匀。 于使用当天新鲜配制。

3. 收集细胞

  1. 将10 mL的C. watsonii培养物收集至15 mL离心管中，在4 °C条件下以5,500 × g离心8分钟收集细胞，弃去上清液。操作过程中样品需保持在冰上。
  2. 用残留的上清液重悬沉淀，将重悬后的样品转移至1.5 mL离心管中，并加入1 mL PBS进行洗涤。在4 °C条件下以5,500 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液。

4. 细胞的固定与保存

  1. 加入 1 mL 1% PFA 溶液，在室温下孵育 15 分钟。
  2. 在 5,500 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，用移液器吸除上清液并弃入指定的化学废液桶中，加入 1 mL PBS，重悬细胞。
  3. 再次在 5,500 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，用移液器吸除上清液并弃去。加入 1 mL 预冷至 -20 °C 的 100% 甲醇，使用涡旋振荡器重悬细胞。将样品置于 -20 °C 保存 15 分钟至过夜。

5. 透化与封闭

  1. 离心细胞（5,500 × g，4 °C，5 分钟），用移液器吸除上清液（甲醇），弃入指定的化学废液桶中，加入 1 mL PBS 重悬。
  2. 离心细胞（5,500 × g，4 °C，5 分钟），用移液器吸去上清液并弃去，加入 1 mL 0.2% Triton X-100，室温孵育 15 分钟。
  3. 离心细胞（5,500 × g，4 °C，5 分钟），用移液器吸除含 Triton X-100 的上清液并弃去，加入 1 mL PBS 重悬沉淀。
  4. 离心细胞（5,500 × g，4 °C，5 分钟），用移液器吸去上清液，加入 0.5 mL 溶菌酶（见 材料表) 和 0.5 mL PBG（步骤 2.4），在 37 °C 下孵育 3 小时。
  5. 离心细胞（5,500 × g，4 °C，5 分钟），用移液器小心吸去上清液并弃入指定的废液桶中，加入 0.5 mL 60 单位的无色肽酶（步骤 2.10）和 0.5 mL PBG，于 37 °C 孵育 30 分钟。
  6. 离心细胞（5,500 × g，4 °C，5 分钟），用移液器吸除无色肽酶上清液，弃入指定的废液桶中，并加入所需量的 PBS。
    ​注意：所需用量应根据待观察的子样品数量确定（一个子样品为90 µL，形成直径约2 cm的圆）。务必设置阴性对照；不加1st nor 2nd 抗体，且不含 1st 抗体

6. 成像样品的制备

  1. 将样本置于玻璃载玻片上，加入第一抗体28.
    1. 用防液体笔在多聚赖氨酸包被的载玻片上画两个直径约 2 cm 的圆（参见 材料表）。将90 µL的样品分装液加入圆圈内，在通风橱中干燥，约需30–60分钟。
    2. 将样品重悬并用90 µL PBS洗涤，孵育2分钟，弃去PBS。重复该步骤2次。
    3. 稀释1st 抗体28 (1 mg mL-1在PBG封闭液中重复洗涤200次。根据样本数量调整溶液用量。
      1. 加入90 µL一抗（1st）抗体28 在每个亚样本上进行操作，阴性对照除外。将蒸馏水浸湿的滤纸放入孵育室中，盖上盖子，并用嫁接膜密封。于4 °C孵育过夜。
  2. 应用 2nd 抗体
    1. 去除过量的1st 将玻璃片长边朝下立于纸巾上，翻转使其细胞面朝上，用移液器向每个圈内加入0.2% Triton X-100，孵育2分钟以洗涤细胞，重复5次。
    2. 轻柔加入与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（2nd）抗体（山羊抗兔IgG）（参见 材料表），室温孵育60分钟。用PBS轻轻冲洗细胞10分钟，重复3次。
  3. 酪胺信号放大
    1. 加入90 µL的酪胺工作液至样本上，室温孵育10分钟。将玻片长边朝下立于吸水纸上，弃去溶液。加入90 µL反应终止试剂，室温孵育3分钟。弃去溶液。
      ​注意：每种靶蛋白或每台显微镜均需测试孵育时间。为避免信号过饱和，可缩短孵育时间或省略该步骤，直接使用共聚焦显微镜观察蛋白质定位。
  4. 用 PBS 每 30 分钟冲洗细胞一次，共冲洗 5 次。用去离子水冲洗细胞。迅速除去水分。加入一滴封片剂（见 材料表）并盖上盖玻片。
  5. 轻轻按压盖玻片以去除多余的封片剂，并静置干燥约30分钟。用透明指甲油封片后避光保存。

7. 使用荧光显微镜检测荧光信号

  1. 打开荧光显微镜、计算机和紫外光源。启动与显微镜连接的相机软件（参见材料表），设置为实时显示图像模式，并关闭房间内的照明。
    1. 将载有细胞的玻片放置在载物台上。先使用放大倍数最小的物镜，调节物镜和聚光镜以精确对焦，然后依次更换为更高放大倍数的物镜。
    2. 在盖玻片上滴加镜油，切换至100倍油镜。遮蔽光源处的光线，选择DAPI滤光片组用于Tyramide-350分析，并打开紫外激发光快门。
    3. 测试3-4种不同的曝光时间，确定最佳曝光时间，确保图像无过饱和现象。切换至FITC滤光片组以观察藻红蛋白 信号，重复上述步骤并确定最佳曝光时间。可考虑在相机上使用增益增强或像素合并（binning）模式以加快成像过程，并减少光毒性导致的信号衰减。在正式采集图像前，将增益和像素合并模式恢复至设定值。
  2. 选择合适的视野，分别以各自确定的最佳曝光时间，采集明场图像、Tyramide图像和藻红蛋白 图像的单帧图像。

8. 共聚焦显微镜下的检测

  1. 打开共聚焦显微镜和计算机，启动显微镜软件。将激光预热60分钟。关闭房间内的灯光。在物镜上使用浸油后，将含有细胞的玻片放置在样品台上。
  2. 选择405 nm激光，并设置主分光镜（MBS）为405。将激光功率设为0.5%。设置测量参数以获得0.03 µm的像素尺寸，放大倍数为10（图像尺寸为512 × 512像素）。将像素驻留时间设为0.02 ms，总扫描时间为5.06 s。
  3. 在GaAsP光谱探测器上设置检测范围为410 nm至695 nm，实现9 nm的光谱分辨率。将增益设为最佳值（800–900）。开始lambda扫描。
    ​注意：最佳增益应根据每台显微镜进行优化。

9. 使用 Fiji 量化信号强度

  1. 在荧光显微镜下打开使用DAPI滤光片拍摄的图像。在明场图像中选择细胞，并定义感兴趣区域（ROI）。对所有细胞定义ROI后，保存该ROI。
  2. 关闭明场图像，打开荧光图像。将RGB图像拆分为红色、蓝色和绿色通道，以提取Tyramide-350信号。
  3. 将明场图像中制备的ROI应用于蓝色通道图像，并测量信号强度29。保存结果。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在阴性对照中，观察到来自细胞外物质的荧光信号，其中 1st 未使用抗体（图1A-C）。与Rubisco蛋白大亚基（RbcL）结合的酪酰胺信号放大试剂的荧光信号在 C. watsonii 在荧光显微镜下使用DAPI滤光片进行紫外激发观察（图1D-F）。此外，还可观察到胞外聚合物（EPS）产生的荧光信号（图1C，F).

接下来，该方案被应用于固氮酶铁蛋白（NifH）的检测。为确认免疫化学反应所产生的荧光信号的特异性，使用Fiji软件对荧光强度进行定量分析。经完整方案处理的细胞所获得的信号强度显著高于未进行完整处理的细胞st 和/或 2nd 抗体（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对于蓝细菌，TSA 系统已在TSA-荧光中得到广泛应用 原位 杂交（TSA-FISH、CARD-FISH），靶向特定rRNA。然而，其在蛋白质检测方面的应用仍较为有限26在本研究中，采用TSA方法以实现细胞全层的N免疫检测2固氮蓝细菌 C. watsonii，结合基于先前文献的修改方案20显著的修订包括通透化步骤，通过溶菌酶和无色肽酶联合处理实现22，以及使用TSA系统进行信号增强23此外，利用TSA技术结合Fiji软件进行RGB图像分离，能够在藻红蛋白和藻蓝蛋白固有的自发荧光背景下，实现对抗体偶联荧光信号的可视化与定量分析。

在单细胞蓝细菌中对蛋白质进行可视化，可揭示细胞间蛋白质含量的差异。以往对蓝细菌细胞间代谢异质性的分析依赖于同位素比值质谱仪（NanoSIMS）11

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们确认本研究不存在任何利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Radek Kana 博士和 Barbora Šedivá 在共聚焦显微分析方面的协助，以及 Roman Sobotka 博士和 Kateřina Bišová 博士在免疫检测和荧光显微分析方面的建议。本研究得到了捷克研究基金会 GAČR（项目编号 20-17627S，资助 OP 和 TM）、 日本学术振兴会（JSPS）与捷克科学院之间的 Mobility plus 项目（JPJSBP 120222502）以及 JSPS 科研费（项目编号 23H02301）的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无色肽酶FUJIFILM014-09661
Alexa Fluor350Thermo ScientificB40952酪酰胺-350
Alexa Fluor405Thermo ScientificB48254酪酰胺-405
Alexa Fluor488 酪酰胺 SuperBoost 试剂盒Thermo ScientificB40922山羊抗兔 IgG
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA2153
离心机Eppendorf5804 R
离心管（15 mL）VWR525-1085用于收集细胞
共聚焦显微镜ZeissLSM880 配备 Airyscan
荧光显微镜OlympusBX51DAPI 滤光片：激发波长 360-370 nm，发射波长 420-460 nm
明胶Merk4070
共聚焦显微镜用高精度显微镜盖玻片DeckgläserNo. 1.5H
液体阻断剂 常规/迷你型大同产业株式会社Part 6505用于将细胞固定在载玻片上
溶菌酶ITW ReagentsA4972
甲醇Carl Roth67-56-1
磷酸二氢钾Penta12290
封片介质Sigma-Aldrich345789-20MLFluorSave 试剂
封片剂VectashildH-1300
共聚焦显微镜所用物镜ZeissPlan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
多聚赖氨酸包被载玻片Sigma-AldrichP0425-72EA
氯化钾 Lach-Ner
防漏管（1.5 mL）Eppendorf0030 120.086用于细胞处理和化学试剂储存
氯化钠 Penta16610
磷酸氢二钠 Penta15130
Triton X-100Sigma-AldrichX100

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ackermann, M. A functional perspective on phenotypic heterogeneity in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 13 (8), 497-508 (2015).
  2. Schreiber, F., Ackermann, M. Environmental drivers of metabolic heterogeneity in clonal microbial populations. Current Opinion in Biotechnology. 62, 202-211 (2020).
  3. Takhaveev, V., Heinemann, M. Metabolic heterogeneity in clonal microbial populations. Current Opinion in Microbiology. 45, 30-38 (2018).
  4. van Heerden, J. H., et al. Lost in transition: start-up of glycolysis yields subpopulations of nongrowing cells. Science. 343 (6174), 1245114(2014).
  5. Lindemann, D., Westerwalbesloh, C., Kohlheyer, D., Grunberger, A., von Lieres, E. Microbial single-cell growth response at defined carbon limiting conditions. RSC advances. 9 (25), 14040-14050 (2019).
  6. Kotte, O., Volkmer, B., Radzikowski, J. L., Heinemann, M. Phenotypic bistability in Escherichia coli's central carbon metabolism. Molecular Systems Biology. 10 (7), 736(2014).
  7. Nikolic, N., et al. Cell-to-cell variation and specialization in sugar metabolism in clonal bacterial populations. PLoS Genetics. 13 (12), 1007122(2017).
  8. Solopova, A., et al. Bet-hedging during bacterial diauxic shift. The Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7427-7432 (2014).
  9. Schreiber, F., et al. Phenotypic heterogeneity driven by nutrient limitation promotes growth in fluctuating environments. Nature Microbiology. 1, 16055(2016).
  10. Zimmermann, M., et al. Substrate and electron donor limitation induce phenotypic heterogeneity in different metabolic activities in a green sulphur bacterium. Environmental Microbiology Reports. 10 (2), 179-183 (2018).
  11. Masuda, T., et al. Heterogeneous N2 fixation rates confer energetic advantage and expanded ecological niche of unicellular diazotroph populations. Communications Biology. 3, 172(2020).
  12. Mohr, W., Vagner, T., Kuypers, M. M., Ackermann, M., Laroche, J. Resolution of conflicting signals at the single-cell level in the regulation of cyanobacterial photosynthesis and nitrogen fixation. PLoS One. 8 (6), 66060(2013).
  13. Polerecky, L., et al. Temporal patterns and intra- and inter-cellular variability in carbon and nitrogen assimilation by the unicellular cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Frontiers in Microbiology. 12, 620915(2021).
  14. Berthelot, H., et al. NanoSIMS single cell analyses reveal the contrasting nitrogen sources for small phytoplankton. ISME Journal. 13, 651-662 (2019).
  15. Foster, R. A., Sztejrenszus, S., Kuypers, M. M. Measuring carbon and N2 fixation in field populations of colonial and free-living unicellular cyanobacteria using nanometer-scale secondary ion mass spectrometry. Journal of Phycology. 49 (3), 502-516 (2013).
  16. Lin, S., Henze, S., Lundgren, P., Bergman, B., Carpenter, E. J. Whole-cell immunolocalization of nitrogenase in marine diazotrophic cyanobacteria, Trichodesmium spp. Applied and Environmental Microbiology. 64, 3052-3058 (1998).
  17. Berman-Frank, I., et al. Segregation of nitrogen fixation and oxygenic photosynthesis in the marine cyanobacterium Trichodesmium. Science. 294, 1534-1537 (2001).
  18. El-Shehawy, R., Lugomela, C., Ernst, A., Bergman, B. Diurnal expression of hetR and diazocyte development in the filamentous non-heterocystous cyanobacterium Trichodesmium erythraeum. Microbiology. 149, 1139-1146 (2003).
  19. Webb, E. A., Ehrenreich, I. M., Brown, S. L., Valois, F. W., Waterbury, J. B. Phenotypic and genotypic characterization of multiple strains of the diazotrophic cyanobacterium, Crocosphaera watsonii, isolated from the open ocean. Environmental Microbiology. 11 (2), 338-348 (2009).
  20. Taniuchi, Y., Murakami, A., Ohki, K. Whole-cell immunocytochemical detection of nitrogenase in cyanobacteria: improved protocol for highly fluorescent cells. Aquatic Microbial Ecology. 51, 237-247 (2008).
  21. Ohki, K., Taniuchi, Y. Detection of nitrogenase in individual cells of a natural population of Trichodesmium using immunocytochemical methods for fluorescent cells. Journal of Oceanography. 65, 427-432 (2009).
  22. Orcutt, K. M., Ren, S., Gundersen, K. Detecting proteins in highly autofluorescent cells using quantum dot antibody conjugates. Sensors. 9 (9), 7540-7549 (2009).
  23. Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to immunoassays. Journal of Immunological Methods. 125, 279-285 (1989).
  24. Bobrow, M. N., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. II. Application to membrane immunoassays. Journal of Immunological Methods. 137, 103-112 (1991).
  25. Bobrow, M. N., Litt, G. J., Shaughnessy, K. J., Mayer, P. C., Conlon, J. The use of catalyzed reporter deposition as a means of signal amplification in a variety of formats. Journal of Immunological Methods. 150, 145-149 (1992).
  26. Piccini, C., Fabre, A., Lacerot, G., Bonilla, S. Combining immunolabeling and catalyzed reporter deposition to detect intracellular saxitoxin in a cyanobacterium. Journal of Microbiol Methods. 117, 18-21 (2015).
  27. Chen, Y. B., Zehr, J. P., Mellon, M. Growth and nitrogen fixation of the diazotrophic filamentous nonheterocystous cyanobacterium Trichodesmium sp. IMS 101 in defined media: evidence for a circadian rhythm. Journal of Phycology. 32, 916-923 (1996).
  28. Ohki, K. Intercellular localization of nitrogenase in a non-heterocystous cyanobacterium (Cyanophyte), Trichodesmium sp. NIBB1067. Journal of Oceanography. 64, 211-216 (2008).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. McKnight, P. E., Najab, J. Mann-Whitney U Test. The Corsini Encyclopedia of Psychology. , John Wiley & Sons, Ltd. 1(2010).
  31. Steel, R. G. D. Some rank sum multiple comparison tests. Biometrics. 17, 539-552 (1961).
  32. M, S. H. K. Standard Deviation. International Encyclopedia of Statistical Science. Lovric, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
  33. Gross, A. J., Sizer, I. W. The oxidation of tyramine, tyrosine, and related compounds by peroxidase. Journal of Biological Chemistry. 234 (6), 1611-1614 (1959).
  34. Eling, T. E., Thompson, D. C., Foureman, G. L., Curtis, J. F., Hughes, M. F. Prostaglandin H synthase and xenobiotic oxidation. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 30, 1-45 (1990).
  35. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry Part A. 77 (11), 1020-1031 (2010).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Crocosphaera watsonii Fiji
视频即将推出

相关文章