渗透压微型泵植入法用于提高小鼠脑脊液中的葡萄糖浓度

摘要

本文介绍了一种提高小鼠脑脊液（CSF）中葡萄糖浓度的详细实验方案。该方法可用于研究高脑脊液葡萄糖水平对小鼠神经退行性病变、认知功能及外周葡萄糖代谢的影响。

摘要

糖尿病会增加认知功能下降的风险，并损害大脑功能。高血糖与认知缺陷之间是否存在因果关系，目前尚不明确。此外，这些缺陷是否由脑脊液（CSF）和/或血液中葡萄糖水平升高所介导，同样尚不清楚。由于现有的糖尿病模型尚不足以回答此类研究问题，因此极少有研究探讨高脑脊液葡萄糖水平对中枢神经系统（CNS）功能，尤其是学习与记忆功能的直接影响。本文介绍了一种通过在小鼠侧脑室内使用渗透压微泵持续输注葡萄糖，从而在4周内长期升高脑脊液葡萄糖水平的方法。该方案通过检测脑脊液中的葡萄糖浓度进行了验证。在以0.25 µL/h流速输注50%葡萄糖溶液后，脑脊液葡萄糖水平升至约328 mg/dL，而接受人工脑脊液（aCSF）的小鼠脑脊液葡萄糖浓度约为56 mg/dL。此外，该方案对血糖水平无影响。因此，该方法可用于独立于血糖变化，研究高脑脊液葡萄糖对脑功能或特定神经通路的直接作用。总体而言，本文所述方法将有助于建立动物模型，以检验高脑脊液葡萄糖在介导阿尔茨海默病和/或糖尿病相关其他神经退行性疾病特征中的作用。

引言

1型和2型糖尿病均会损害大脑功能^1,2,3。例如，糖尿病会增加认知功能下降和神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病）的风险^3,4。此外，糖尿病患者大脑中的葡萄糖感知功能存在缺陷^5,6。这种缺陷可导致低血糖感知障碍以及对低血糖缺乏足够的反向调节反应^7,8，若不立即治疗，可能危及生命。

鉴于糖尿病会升高血液以及脑脊液（CSF）中的葡萄糖水平⁹，确定其中一个或两个因素是否导致脑功能受损显得尤为重要。糖尿病是否仅由脑脊液中高葡萄糖水平引起脑损伤，还是与胰岛素缺乏或胰岛素抵抗等其他因素共同作用所致，目前仍是一个未解的问题。1型和2型糖尿病的动物模型除了表现出能量平衡和外周葡萄糖代谢异常外，还显示出认知功能下降和神经退行性病变¹⁰

方案

所有小鼠操作均经罗切斯特大学机构动物照护与使用委员会批准，并依照美国公共卫生服务局关于实验动物人道照护与使用的指南进行。本研究所用的6周龄C57BL/6J雄性小鼠购自商业供应商。所有动物均以每笼5只的群居方式饲养于12小时昼夜循环环境中，并可自由获取食物和饮水。ad libitum。在小鼠植入用于向侧脑室输注葡萄糖的导管后，改为单只单独饲养，以防止其他小鼠对植入装置造成损伤。

1. 渗透压微型泵的组装

1. 根据以下步骤配制人工脑脊液（aCSF）。将 NaCl（8.66 g）、KCl（0.224 g）、CaCl₂·2H₂O（0.206 g）和 MgCl₂·6H₂O（0.163 g）溶解于 500 mL 无菌水中，配制成溶液 A。将 Na₂HPO₄·7H₂O（0.214 g）和 NaH₂PO₄·H₂O（0.027 g）溶解于 500 mL 无菌水中，配制成溶液 B。然后将溶液 A 和溶液 B 按 1:1 体积比混合，得到 aCSF。
   注意：该配方的 aCSF 不含葡萄糖。
2. 配制 50% 葡萄糖溶液时，将 50 g 葡萄糖加入盛有 50 mL aCSF 的烧杯中....

结果

雄性小鼠被植入与渗透压微型泵连接的导管（图 1)以持续向其侧脑室灌注人工脑脊液（aCSF）或50%葡萄糖溶液（图2手术后10天采集脑脊液（CSF）。图3) 以验证该操作的有效性。结果显示，输注50%葡萄糖的小鼠脑脊液葡萄糖水平（平均值：327.7 mg/dL）高于输注aCSF的小鼠（平均值：56.5 mg/dL）。与对照组同窝小鼠相比，实验组小鼠脑脊液葡萄糖水平约升高了六倍（图 4A各组之间的血糖水平无差异（图4B).

讨论

本文报道了一种通过将渗透压微型泵连接至植入侧脑室的导管来提高小鼠脑脊液葡萄糖水平的详细实验方案。通过该方法在小鼠脑内进行葡萄糖的慢性灌注，将有助于阐明长期高脑脊液葡萄糖对认知功能、全身葡萄糖代谢和能量平衡的影响 ，并有助于更深入理解糖尿病并发症的发病机制 。

慢性糖尿病会导致脑损伤，从而中断大脑与外周器官之间的通信¹⁵。糖尿病还会增加神经退行性疾病的风险，包括阿尔茨海默病^3,4。链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病一直是糖尿病研究中的标准啮齿类动物模型¹⁶；STZ会损伤胰腺中的β细胞，导致类似1型糖尿病的病理变化。此外，在一种改良版本中，联合使用STZ与烟酰胺可诱导出2型糖尿病。另一种在动物中产生类似2型糖尿病表型的方法是通过高脂饮食喂养¹⁶。然而，在研究高血糖对脑功能影响的背景下，这些技术在控制大量因素.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 注射器滤器	膜溶液	SFPES030022S
1 mL 无菌注射器（鲁尔锁头）	BD	309628
1 mL TB 注射器	BD	309659
100 mL 玻璃烧杯	Fisher	N/a
100% 乙醇（Koptec）	DLI	UN170	使用 70% 稀释液清洁手术区域
50 mL 锥形管	Fisher	N/A
对准指示器	KOPF	1905
Alzet 脑部输注套件	DURECT	Kit # 3; 0008851	将套件中的管路剪成 1 英寸长度
Alzet 渗透压泵	DURECT	2004	流速 0.25 µL/h
麻醉系统	Kent Scientific	SomnoSuite
聚维酮碘溶液	Avrio Health	N/A
CaCl2 · 2H2O	Fisher	C79-500
套管固定器	KOPF	1966
中心定位镜	KOPF	1915
牙科水泥液体	Lang Dental	REF1404
牙科水泥粉末	Lang Dental	REF1220-C
D-葡萄糖	Sigma	G8270
电动钻	KOPF	1911	钻孔时避免刺破硬脑膜
眼用润滑剂（Optixcare）	CLC Medica	N/A
玻璃珠灭菌器（Germinator 500）	VWR	101326-488	将器械置于无菌水中冷却后再进行手术
葡萄糖检测试剂盒	Cayman chemical	10009582
H2O2	Sigma	H1009-500ml	在颅骨表面使用 3% H2O2 以使颅缝清晰可见。
毛发剪刀	WAHL	N/A
加热垫	Heatpax	19520483
止血钳	N/A	N/A
异氟烷（Fluriso）	Zoetis	NDC1385-046-60
KCl	VWR	0395-500g
磁力架	WPI	M1
带放大功能的台灯	Brightech	LightView Pro Flex 2
金属刮刀	N/A	N/A
MgCl2 · 6H2O	Fisher	BP214-500
显微操作器（右手型）	WPI	M3301R
带数字显示的显微操作器	KOPF	1940
Na2HPO4 · 7H2O	Fisher	S373-500
NaCl	Sigma	S7653-5Kg
NaH2PO4 · H2O	Fisher	S369-500
新孢霉素（Neosporin）	Johnson & Johnson	N/A	涂抹外用软膏以预防感染
Parafilm 封口膜	Bemis	DM-999
Rimadyl（卡洛芬）50 mg/mL	Zoetis	N/A	5 mg/kg，皮下注射，用于镇痛
手术刀	N/A	N/A
立体定位对准系统	KOPF	1900
无菌 27 号针头	BD	305109
无菌棉签（Solon）	AMD Medicom	56200
无菌尼龙缝线（5.0）	Oasis	MV-661	使用不可吸收缝线关闭伤口
无菌锐利剪刀	N/A	N/A
无菌外科刀片	VWR	55411-050
外科手套（腈类）	Ammex	N/A	如怀疑污染，应更换手套
托盘	N/A	N/A