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方法文章

渗透压微型泵植入法用于提高小鼠脑脊液中的葡萄糖浓度

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DOI：

10.3791/65169

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2023年4月7日

 , 
1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes and Metabolism, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

本文内容

摘要

本文介绍了一种提高小鼠脑脊液（CSF）中葡萄糖浓度的详细实验方案。该方法可用于研究高脑脊液葡萄糖水平对小鼠神经退行性病变、认知功能及外周葡萄糖代谢的影响。

摘要

糖尿病会增加认知功能下降的风险，并损害大脑功能。高血糖与认知缺陷之间是否存在因果关系，目前尚不明确。此外，这些缺陷是否由脑脊液（CSF）和/或血液中葡萄糖水平升高所介导，同样尚不清楚。由于现有的糖尿病模型尚不足以回答此类研究问题，因此极少有研究探讨高脑脊液葡萄糖水平对中枢神经系统（CNS）功能，尤其是学习与记忆功能的直接影响。本文介绍了一种通过在小鼠侧脑室内使用渗透压微泵持续输注葡萄糖，从而在4周内长期升高脑脊液葡萄糖水平的方法。该方案通过检测脑脊液中的葡萄糖浓度进行了验证。在以0.25 µL/h流速输注50%葡萄糖溶液后，脑脊液葡萄糖水平升至约328 mg/dL，而接受人工脑脊液（aCSF）的小鼠脑脊液葡萄糖浓度约为56 mg/dL。此外，该方案对血糖水平无影响。因此，该方法可用于独立于血糖变化，研究高脑脊液葡萄糖对脑功能或特定神经通路的直接作用。总体而言，本文所述方法将有助于建立动物模型，以检验高脑脊液葡萄糖在介导阿尔茨海默病和/或糖尿病相关其他神经退行性疾病特征中的作用。

引言

1型和2型糖尿病均会损害大脑功能1,2,3。例如，糖尿病会增加认知功能下降和神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病）的风险3,4。此外，糖尿病患者大脑中的葡萄糖感知功能存在缺陷5,6。这种缺陷可导致低血糖感知障碍以及对低血糖缺乏足够的反向调节反应7,8，若不立即治疗，可能危及生命。

鉴于糖尿病会升高血液以及脑脊液（CSF）中的葡萄糖水平9，确定其中一个或两个因素是否导致脑功能受损显得尤为重要。糖尿病是否仅由脑脊液中高葡萄糖水平引起脑损伤，还是与胰岛素缺乏或胰岛素抵抗等其他因素共同作用所致，目前仍是一个未解的问题。1型和2型糖尿病的动物模型除了表现出能量平衡和外周葡萄糖代谢异常外，还显示出认知功能下降和神经退行性病变10,11,12,13。然而，利用这些模型难以区分高脑脊液葡萄糖水平与高血糖水平在介导糖尿病对脑功能影响中的独立作用。

本方案描述了建立高脑脊液葡萄糖小鼠模型的方法，用于研究长期高脑脊液葡萄糖水平对脑功能、能量平衡及葡萄糖稳态的影响。通过该技术建立的小鼠模型为探讨葡萄糖稳态失调在神经和行为功能异常中的病因学作用提供了研究工具。

因此，该研究方法将有助于理解脑脊液葡萄糖水平升高在各种病理生理条件下的直接效应。

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方案

所有小鼠操作均经罗切斯特大学机构动物照护与使用委员会批准，并依照美国公共卫生服务局关于实验动物人道照护与使用的指南进行。本研究所用的6周龄C57BL/6J雄性小鼠购自商业供应商。所有动物均以每笼5只的群居方式饲养于12小时昼夜循环环境中，并可自由获取食物和饮水。ad libitum。在小鼠植入用于向侧脑室输注葡萄糖的导管后，改为单只单独饲养，以防止其他小鼠对植入装置造成损伤。

1. 渗透压微型泵的组装

  1. 根据以下步骤配制人工脑脊液（aCSF）。将 NaCl（8.66 g）、KCl（0.224 g）、CaCl2·2H2O（0.206 g）和 MgCl2·6H2O（0.163 g）溶解于 500 mL 无菌水中，配制成溶液 A。将 Na2HPO4·7H2O（0.214 g）和 NaH2PO4·H2O（0.027 g）溶解于 500 mL 无菌水中，配制成溶液 B。然后将溶液 A 和溶液 B 按 1:1 体积比混合，得到 aCSF。
    注意：该配方的 aCSF 不含葡萄糖。
  2. 配制 50% 葡萄糖溶液时，将 50 g 葡萄糖加入盛有 50 mL aCSF 的烧杯中。将烧杯置于加热板上，将悬液温度升至 60 °C。使用磁力搅拌器搅拌，直至葡萄糖完全溶解。
  3. 向烧杯中加入 aCSF，使最终体积达到 100 mL。用孔径为 0.22 µm 的滤膜过滤溶液，以实现灭菌。
  4. 配制 0.9% 生理盐水（NaCl 溶液），并通过 0.22 µm 滤膜过滤。
  5. 将微型泵及输注套件的所有组件置于无菌托盘中，使用无菌剪刀将脑部输注套件的导管剪至 1 英寸长度。用无菌止血钳夹住导管，将其套在套管一端的顶端。将导管另一端连接至流量调节器的顶部。在导管两端涂少量胶水，以增强连接牢固性。
  6. 将 27 G 针头连接至 1 mL 注射器，并吸入 aCSF 或葡萄糖溶液。将 27 G 针头插入一小段导管中，然后将该导管连接至流量调节器的开放端，用相应溶液充满导管，直至溶液从套管末端开始滴出。排除导管中残留的任何气泡。
  7. 为微型泵注液时，将泵垂直持握，将注射器针头插入泵体，注入相应溶液，直至泵体开口处出现液滴。
  8. 缓慢将流量调节器插入泵体，注意避免在组装过程中引入气泡。
  9. 微型渗透泵组装完成后，将其转移至 50 mL 锥形管中。向管内加入无菌生理盐水，使泵体完全浸没，但确保套管部分不接触盐水。每个 50 mL 锥形管中可放置四个组装好的微型泵。
  10. 将管盖轻轻盖上（不拧紧），在 37 °C 条件下孵育至少 48 小时，以启动泵体。

2. 植入渗透压泵的手术操作

  1. 术前准备
    1. 将手术器械在高压灭菌器中灭菌，并在使用前至少冷却30分钟。灭菌条件为121 °C湿热灭菌30分钟。
    2. 用70%乙醇对手术区域进行消毒。擦拭旋钮、耳杆和立体定位仪表面。
      注意：手术应在无菌环境中进行，注意避免在操作过程中接触非无菌表面。若怀疑手套被污染，应立即更换。
    3. 将小鼠放入麻醉诱导舱中，用含3%异氟烷的空气麻醉3-5分钟。随后将小鼠从舱中取出，置于无菌手术巾上，并通过鼻罩维持1.5%-2%的异氟烷麻醉。
    4. 轻捏小鼠后肢足垫，观察是否存在反射，以确认麻醉深度。
    5. 皮下注射5 mg/kg卡洛芬以提供镇痛。
    6. 使用清洁的毛发剪修剪小鼠头部手术区域的毛发。先用聚维酮碘溶液擦拭头皮，再用酒精棉片彻底擦拭至少2分钟。此过程至少重复三次。
    7. 涂抹眼用润滑剂，防止手术期间眼睛干涩。
  2. 手术操作
    1. 将小鼠固定于立体定位仪上，使其门齿挂于门齿杆。鼻部覆盖鼻罩，并用无菌手术巾覆盖以固定手术区域。
    2. 将异氟烷气流切换至鼻罩，继续以 1.5%-2%异氟烷维持麻醉。
    3. 在小鼠身下放置加热垫，以维持其体温。
    4. 戴上新的无菌手套，使用手术刀在头皮正中线处做一长约10-15 mm的切口。用刮匙暴露颅骨表面，同时用棉签清除出血。
      注意：若出现大量出血（罕见），可使用电凝器止血。
    5. 用蘸有3%过氧化氢的棉签擦拭，以暴露颅骨缝线。
    6. 记录前囟（bregma）和后囟（lambda）位置，用于确定颅骨坐标。将所有坐标在前囟处设为零点。
      注意：这些坐标数据来源于小鼠脑图谱14。图谱中前囟-后囟参考距离为4.21 mm。为校正因年龄和性别差异导致的颅骨大小变化，测量每只小鼠的前囟-后囟距离，并除以4.21 mm，得到一个乘法校正因子。例如，若某小鼠前囟与后囟距离为4.65 mm，则除以4.21 mm后得到校正因子1.10。随后将图谱中所有坐标乘以该因子，以确定实际钻孔坐标。以上例而言，所得前后（AP）和内外侧（ML）坐标分别为0.55 mm和1.1 mm（即1.1 × 0.5 或 1 mm）。
    7. 使用电动钻在以下坐标位置钻孔：前囟后方0.5 mm，中线向右1 mm处。 
      注意：钻颅骨孔时需小心，避免刺破硬脑膜。确保钻头已灭菌，可与其他器械一同置于同一高压灭菌袋中进行灭菌。
    8. 将止血钳插入切口皮肤下方，并推送至微型渗透泵拟植入位置。轻柔开合止血钳，以形成容纳泵体的皮下囊袋。
    9. 使用无菌止血钳从流量调节器末端夹取 已预充的微型渗透泵，并将其经皮肤切口推入囊袋中。
      注意：操作过程中应避免泵体和导管接触任何非无菌表面。
    10. 在导管底面涂抹少量胶水，并将其固定于导管固定座中。缓慢将导管经钻孔插入，深入颅骨表面下方2 mm。保持该位置至少5分钟，使胶水充分固化。
    11. 在将导管插入脑组织前，需确认导管未堵塞，且溶液流动通畅。
      注意：由于流速极低，葡萄糖可能在导管尖端沉积，从而阻塞液体流动。
    12. 借助剪刀剪除导管顶端多余部分，注意避免其从颅骨表面移位。
    13. 在导管周围覆盖一层牙科水泥，以提供额外支撑。
    14. 使用尼龙缝线（5-0规格，长度30英寸）缝合伤口，并在伤口处涂抹局部抗生素以预防感染。
    15. 关闭异氟烷气流，让动物从麻醉中恢复，随后将其转移至新的清洁笼具中。
  3. 术后护理
    1. 术后至少连续观察小鼠1周。
    2. 术后连续三天，每天皮下注射5 mg/kg卡洛芬一次。
    3. 待伤口完全愈合后，于术后7-10天拆除缝线。
      ​注意：观察发现，脑脊液葡萄糖水平较高的小鼠愈合时间较长。修剪小鼠后肢指甲可减少因抓挠行为导致切口部位受伤的风险。

3. 更换微型泵

注意：由于本研究中使用的微型泵仅能持续工作4周，因此也测试了微型泵的更换方法，以延长葡萄糖输注时间，这在长期研究中可能是必要的。该过程包括以下步骤。

  1. 按照上述步骤准备小鼠进行手术。
  2. 在泵上方稍偏位置的皮肤上做一个约1 cm的垂直小切口。
  3. 将止血钳插入切开的皮下，将泵拉出。
  4. 将泵从管路中移除，并将一个新的已预充泵连接至管路。
  5. 将泵重新置入皮下，并缝合皮肤。
  6. 术后护理遵循上述相同的指导说明。

4. 脑脊液采集步骤

  1. 准备
    1. 使用微量移液器拉制仪将直径为1 mm的玻璃毛细管拉制成尖端直径为0.5 mm的毛细管。仪器参数设置为：加热温度 = 800，拉力 = 15，速度 = 5，时间 = 200单位。将拉制好的毛细管置于无菌盒中备用。
    2. 将27 G针头连接至1 mL注射器上。将拉制好的毛细管插入针头，并用少量胶带固定连接处。
    3. 将注射器牢固地固定在显微操作仪的毛细管夹持器中。
    4. 接下来，按照上述术前操作步骤准备小鼠。
  2. 手术操作
    1. 将小鼠置于立体定位仪上。如前所述固定头部后，旋转旋钮使头部倾斜，使鼻部朝下。使用无菌 手术巾覆盖以固定手术区域。
    2. 在背侧表面做一小切口，从耳间平面开始向尾侧延伸。
      注意：切口时需小心，避免损伤导管。
    3. 移除小鼠身体下方的支撑物，使小鼠垂直放置，以便颈部充分向背侧伸展。
    4. 借助弯头钝头镊子，从正中线轻轻分离后颈部肌肉，形成一个小窗口。 然后使用湿润的棉签轻轻将颈部肌肉从 正中线 向周围推开。
    5. 观察小脑延髓池是否暴露，其表现为一个具有透明硬脑膜的三角形区域。
    6. 将显微操作仪组件放置在立体定位仪上小鼠旁边，确保毛细管尖端不接触任何表面。
    7. 轻轻折断毛细管尖端，同时不扰动整体装置。
    8. 在放大镜（放大倍数2.25倍）下观察，旋转显微操作仪上的相应旋钮，缓慢调整并移动毛细管尖端对准小脑延髓池。
    9. 当毛细管尖端接触小脑延髓池膜时会感到一定阻力。借助旋钮非常缓慢地将尖端压向膜面。
      注意：需小心避免损伤膜内的任何血管。此步骤至关重要，以防止脑脊液中出现血液污染。
    10. 极其轻柔地刺穿膜。由于毛细管内存在负压，脑脊液将立即开始流入毛细管。
    11. 保持装置静置数分钟，直至毛细管中收集约10 µL脑脊液。
    12. 随后，缓慢将毛细管从小脑延髓池中抽出，并用无菌棉签轻轻按压小脑延髓池开口处，以阻止脑脊液泄漏。
    13. 小心地将毛细管从注射器上取下，并连接至微毛细管吹吸装置。按压吹吸球，将脑脊液转移至无菌微量离心管中。
    14. 在小鼠下方放置支撑物，并旋转立体定位仪旋钮使头部恢复水平。
    15. 使用尼龙缝线缝合伤口。
    16. 在将小鼠移出装置前，皮下注射300 µL无菌生理盐水。
    17. 按照上述方法对动物进行术后护理 ，直至拆线时间——术后约7–10天。

5. 葡萄糖检测

  1. 按照葡萄糖比色测定试剂盒中所述的方案进行操作。
  2. 用超纯水将试剂盒中提供的磷酸钠缓冲液母液稀释至 50 mM 浓度。
  3. 用试剂盒中提供的 1,000 mg/dL 母液在稀释后的缓冲液中配制浓度为 0、2.5、5、7.5、10、15、20、25 和 50 mg/dL 的葡萄糖标准品。
  4. 用缓冲液对脑脊液（CSF）样本进行 7 倍 稀释。 例如，若采集的脑脊液总体积为 10 µL，则 7 倍稀释后的体积为 70 µL。
  5. 在 96 孔板中，每孔加入 15 µL 葡萄糖标准品和稀释后的脑脊液样本，每个样本设复孔。
  6. 在含有标准品和脑脊液的各孔中，每孔加入 85 µL 稀释缓冲液。
  7. 向葡萄糖比色酶反应混合物小瓶中加入 6 mL 稀释缓冲液，涡旋震荡数秒以充分混匀。
  8. 向每孔中加入 100 µL 酶反应混合液以启动反应。
  9. 用封板膜密封板孔，轻轻敲击板面以混匀试剂。
  10. 将板置于 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟。葡萄糖浓度较高的小瓶会立即开始变为紫色。
  11. 孵育 10 分钟后，移除封板膜，使用酶标仪在 500–520 nm 波长下测定吸光度。
  12. 根据标准曲线插值计算脑脊液样本中的葡萄糖浓度。

6. 血糖检测

  1. 使用剃须刀片在小鼠尾部做一小侧切口，取一滴血，按照血糖仪说明书的操作步骤测量血糖水平。

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结果

雄性小鼠被植入与渗透压微型泵连接的导管（图 1)以持续向其侧脑室灌注人工脑脊液（aCSF）或50%葡萄糖溶液（图2手术后10天采集脑脊液（CSF）。图3) 以验证该操作的有效性。结果显示，输注50%葡萄糖的小鼠脑脊液葡萄糖水平（平均值：327.7 mg/dL）高于输注aCSF的小鼠（平均值：56.5 mg/dL）。与对照组同窝小鼠相比，实验组小鼠脑脊液葡萄糖水平约升高了六倍（图 4A各组之间的血糖水平无差异（图4B).

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讨论

本文报道了一种通过将渗透压微型泵连接至植入侧脑室的导管来提高小鼠脑脊液葡萄糖水平的详细实验方案。通过该方法在小鼠脑内进行葡萄糖的慢性灌注，将有助于阐明长期高脑脊液葡萄糖对认知功能、全身葡萄糖代谢和能量平衡的影响 ，并有助于更深入理解糖尿病并发症的发病机制 。

慢性糖尿病会导致脑损伤，从而中断大脑与外周器官之间的通信15。糖尿病还会增加神经退行性疾病的风险，包括阿尔茨海默病3,4。链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病一直是糖尿病研究中的标准啮齿类动物模型16；STZ会损伤胰腺中的β细胞，导致类似1型糖尿病的病理变化。此外，在一种改良版本中，联合使用STZ与烟酰胺可诱导出2型糖尿病。另一种在动物中产生类似2型糖尿病表型的方法是通过高脂饮食喂养16。然而，在研究高血糖对脑功能影响的背景下，这些技术在控制大量因素...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

美国国立卫生研究院资助项目 DK124619，授予 KHC。

启动资金及试点研究奖，纽约罗切斯特大学医学院，授予 KHC。

罗切斯特大学德蒙特神经科学研究所试点研究奖，授予 KHC。

纽约罗切斯特大学研究副校长办公室授予 KHC 大学研究奖。

MUR 设计并实施了该方法，分析了结果，绘制了图表，并撰写和修改了论文。KHC 构思并监督了本研究，分析了结果，并撰写和修改了论文。KHC 是本研究的负责人。所有作者均批准了论文的最终版本。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 注射器滤器膜溶液SFPES030022S
1 mL 无菌注射器（鲁尔锁头）BD309628
1 mL TB 注射器BD309659
100 mL 玻璃烧杯Fisher N/a
100% 乙醇（Koptec）DLIUN170使用 70% 稀释液清洁手术区域
50 mL 锥形管Fisher N/A
对准指示器KOPF1905
Alzet 脑部输注套件DURECTKit # 3; 0008851将套件中的管路剪成 1 英寸长度
Alzet 渗透压泵DURECT2004流速 0.25 µL/h
麻醉系统Kent ScientificSomnoSuite
聚维酮碘溶液Avrio HealthN/A
CaCl2 · 2H2OFisher C79-500
套管固定器KOPF1966
中心定位镜KOPF1915
牙科水泥液体Lang DentalREF1404
牙科水泥粉末Lang DentalREF1220-C
D-葡萄糖  SigmaG8270
电动钻KOPF1911钻孔时避免刺破硬脑膜
眼用润滑剂（Optixcare）CLC MedicaN/A
玻璃珠灭菌器（Germinator 500）VWR101326-488将器械置于无菌水中冷却后再进行手术
葡萄糖检测试剂盒Cayman chemical10009582
H2O2SigmaH1009-500ml在颅骨表面使用 3% H2O2 以使颅缝清晰可见。
毛发剪刀WAHLN/A
加热垫Heatpax19520483
止血钳N/AN/A
异氟烷（Fluriso）ZoetisNDC1385-046-60
KClVWR0395-500g
磁力架WPIM1
带放大功能的台灯BrightechLightView Pro Flex 2
金属刮刀N/AN/A
MgCl2 · 6H2OFisher BP214-500
显微操作器（右手型）WPIM3301R
带数字显示的显微操作器KOPF1940
Na2HPO4 · 7H2OFisher S373-500
NaClSigmaS7653-5Kg
NaH2PO4 · H2OFisher S369-500
新孢霉素（Neosporin）Johnson & JohnsonN/A涂抹外用软膏以预防感染
Parafilm 封口膜BemisDM-999
Rimadyl（卡洛芬）50 mg/mLZoetisN/A5 mg/kg，皮下注射，用于镇痛
手术刀N/AN/A
立体定位对准系统KOPF1900
无菌 27 号针头BD305109
无菌棉签（Solon）AMD Medicom56200
无菌尼龙缝线（5.0）OasisMV-661使用不可吸收缝线关闭伤口
无菌锐利剪刀 N/AN/A
无菌外科刀片VWR55411-050
外科手套（腈类）AmmexN/A如怀疑污染，应更换手套
托盘N/AN/A

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