本研究介绍了通过结合微型计算机断层扫描（micro-CT）与对比剂获取新生小鼠脑部高分辨率图像的步骤 离体 样本。我们描述了用于量化这些图像中脑大小和形状的基本形态测量分析方法。
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本文内容
摘要
摘要
神经影像学是利用动物模型研究脑形态的重要工具。磁共振成像（MRI）已成为软组织研究的标准方法，但其空间分辨率较低，限制了在小型动物中的应用。本文介绍了一种利用显微计算机断层扫描（micro-CT）获取新生小鼠脑和颅骨高分辨率三维（3D）信息的实验方案。该方案包括样本解剖、脑组织染色与扫描，以及对整个器官和感兴趣区域（ROIs）进行形态测量的全部步骤。图像分析涵盖结构分割和坐标点的数字化处理。综上所述，本研究证明，将显微CT与卢戈氏碘液（Lugol's solution）作为对比剂结合使用，是成像小型动物围产期脑组织的一种可行替代方法。该成像流程可广泛应用于发育生物学、生物医学及其他关注遗传和环境因素对脑发育影响的科学研究领域。
引言
微型计算机断层扫描（micro-CT）成像技术是多个研究领域中的重要工具。在生物学中，由于矿化组织对X射线具有吸收特性，该技术特别适用于骨组织研究。基于这一特点，研究人员已利用micro-CT探讨了骨发育1、骨代谢2以及骨的进化3,4等多个科学问题。2008年，de Crespigny 等人5证明，使用碘作为对比剂可获得成年小鼠和兔脑的micro-CT图像。这项研究拓展了该成像技术的新应用，因为碘的使用使得原本对X射线不敏感的软组织也能被成像。因此，将micro-CT与碘基对比剂结合的主要目标是获得高分辨率图像，从而在中观或宏观解剖学水平上区分并识别软组织结构。
该技术在需要对小型标本（如小鼠胚胎）进行详细离体（ex vivo）表型表征的研究中具有显著潜力，而小鼠胚胎在实验设计中被广泛使用6。碘染色结合显微CT成像已被用于获取器官的体积定量数据7以及关键的三维（3D）结构信息8,
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方案
所有实验操作均遵循加拿大动物护理委员会的指南。
1. 样品采集与制备
- 配制 500 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液。
- 在通风柜内的通风橱中，将 20 g PFA 粉末加入装有 250 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）的 1 L 玻璃烧杯中。将烧杯置于磁力搅拌器上，并放入搅拌子。
- 边加热边搅拌。使用温度计持续监测溶液温度，确保温度低于 60 °C。
- 用塑料巴斯德吸管向溶液中逐滴加入 1 M NaOH，以溶解 PFA。待 PFA 粉末完全溶解后，将溶液冷却至室温（RT）。
- 用 1×PBS 定容至 500 mL。用塑料巴斯德吸管逐滴加入 1 M HCl，调节 pH 至 7.2–7.3。
- 使用滤纸和玻璃漏斗，将溶液过滤至 1 L 玻璃瓶中。
- 盖紧玻璃瓶，从通风柜中取出，于 -4 °C 冰箱中保存。
- 采集脑组织样本。
- 为获取样本，在出生后次日早晨（出生后 0.5 天，P 0.5）处死新生小鼠，使用手术剪进行断头。
- 固定小鼠身体，将手术剪插入新生鼠颈部，进行一次干净利落的剪切。
- 用 PFA 固定样本。
- 在 50 mL 锥形管中加....
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结果
本文介绍了一种获取新生小鼠脑部高分辨率图像的基本实验方案。将头部浸入卢戈氏液后进行扫描。尽管样本体积较小，但主要的脑部解剖结构，如嗅球、大脑皮层、中脑、小脑和后脑，均可清晰分辨（图1）。
可以利用这些图像作为输入进行多种分析。在两个不同的解剖平面上对一组标志点和半标志点进行了数字化。如图2所示，这些点被放置在选定平面上脑组织边界的各个位置。完成数字化后，可从一个.txt文件中读取这些点的坐标（图3）。点的数字化目的在于获取可用于几何形态测量分析的原始坐标数据。本方案以单个样本为例进行说明，而形态测量分析适用于更大的样本量，但使用相同点集所得的结果已在其他文献中报道14。
最后，全脑手动分割的结果是一个脑部的三维模型（图4）。对于这些体积数据，可.......
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讨论
本研究介绍了一种使用微计算机断层扫描（micro-CT）结合对比剂扫描小鼠新生脑组织的简明实验方案。此外，还包括获取定性和定量结果的简单操作步骤。基于这些方法，可进一步开展其他替代性或互补性分析。
如实验方案所示，微计算机断层扫描（micro-CT）图像可通过多种方式进行分析。在之前的研究中，本课题组通过对点坐标进行数字化，并应用几何形态测量技术，估算了小鼠围产期大脑的大小和形状变异8,14。坐标的数字化还可用于通过简单的欧氏距离估算获取线性测量数据。这些数据结合来自脑组织和感兴趣区域（ROI）分割所得到的体积，可为传统形态学评估提供有价值的输入参数。
尽管本文所述方案易于应用于 离体 小样本（如我们所使用的样本）不适用 体内 研究，由于固定尤其是使用卢戈氏液作为对比剂并不可行，因此采用显微CT成像 体内，通常用于硬组织检查
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
感谢 Wei Liu 提供的技术支持。本工作由 ANPCyT PICT 2017-2497 和 PICT 2018-4113 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µCT 35 | Scanco Medical AG | 请注意，Scanco 不再提供 µCT 35。其目前最小的扫描仪为 µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 小鼠 | 拉普拉塔国立大学兽医学院动物饲养中心 | ||
| 锥形管 | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| 通风柜 | Esco | AC2-458 | |
| 玻璃烧杯 | Glassco | GL-229.202.10 | |
| 玻璃瓶 | Simax | CFB017 | |
| 玻璃漏斗 | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | 操作时应在通风柜内进行，并使用个人防护装备（口罩、护目镜和手套） |
| I2 | Cicarelli | 804211 | 配制 I2KI 时，应在通风柜内操作，并使用个人防护装备（口罩、护目镜和手套） |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | 配制 I2KI 时，应在通风柜内操作，并使用个人防护装备（口罩、护目镜和手套） |
| 磁力搅拌器 | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | 操作时应在通风柜内进行，并使用个人防护装备（口罩、护目镜和手套） |
| 旋转摇床 | Biomint | BM021 | |
| 多聚甲醛 | Biopack | 2000959400 | 操作时应在通风柜内进行，并使用个人防护装备（口罩、护目镜和手套） |
| 帕顿刮勺 | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| 塑料巴斯德吸管 | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | 本实验方案中使用了 R 的 geomorph 软件包（https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html） | |
| 剪刀 | Belmed | ||
| 叠氮化钠 | Biopack | 2000163500 | |
| 温度计 | Daigger | 7650 |
参考文献
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al.
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