本方案详细描述了在清醒小鼠上丘（SC）中成像钙反应的实验流程，包括在野生型小鼠中利用双光子显微镜对单个神经元活动进行成像，同时保持皮层完整；以及在部分皮层缺失的突变型小鼠中利用宽场显微镜对整个上丘进行成像。
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本文内容
摘要
摘要
上丘（SC）是所有脊椎动物中进化上保守的中脑结构，是在大脑皮层出现之前最复杂的视觉中枢。它直接接收来自约30种视网膜神经节细胞（RGCs）的输入，每种细胞编码特定的视觉特征。目前尚不清楚上丘仅仅是继承了视网膜的特征，还是在上丘中发生了额外的、甚至是从头开始的信息处理。为了揭示上丘中视觉信息的神经编码机制，本文提供了一种在清醒小鼠中使用两种互补方法进行光学记录视觉反应的详细方案。其中一种方法采用双光子显微镜，在不剥离覆盖皮层的情况下以单细胞分辨率成像钙活动；另一种方法则利用宽场显微镜对皮层大部分未发育的突变小鼠的整个上丘进行成像。本方案详细描述了这两种方法，包括动物准备、病毒注射、头固定板植入、插件植入、数据采集和数据分析。代表性结果表明，双光子钙成像可在单细胞分辨率下揭示视觉诱发的神经元反应，而宽场钙成像则可揭示 整个上丘范围内的神经活动。通过结合这两种方法，可以在不同空间尺度上揭示上丘中的神经编码，这种联合策略也可应用于其他脑区的研究。
引言
上丘（SC）是所有脊椎动物中一个重要的视觉中枢。在哺乳动物中，它直接接收来自视网膜和视觉皮层的输入1。尽管光学记录技术已广泛应用于大脑皮层2,3,4,5，但由于光学通路受限，该技术在上丘中的应用受到阻碍6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,
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方案
所有实验操作均遵循动物福利指南，并经北京中国脑科学研究院动物实验伦理委员会批准。
注意：本方案的时间安排如下：1）制备吸盘；2）注射病毒；3）植入头板；4）3周后，植入塞子；5）在跑步机上经过约3天的恢复和适应后，进行双光子/宽场成像。
1. 吸盘的制备（图1A）
- 在丙烯酸培养皿中滴加一滴磷酸盐缓冲液（PBS, 1x），用21 G平头针头接触液滴，通过毛细作用使针头尖端充满液体。
- 用半透明硅胶粘合剂覆盖针头尖端，并静置约10分钟使其固化。
- 用剪刀将硅胶粘合剂裁剪成直径约2 mm的圆片。
2. 制备胶块（图1B）
- 准备厚度为 0.75 mm 的塑料垫片材料，并在其中心切割出一个 1 cm × 1 cm 的正方形孔。准备两块丙烯酸树脂块。用酒精清洁垫片材料和丙烯酸树脂块，并用镜头纸擦拭干净。
- 将垫片材料置于一块丙烯酸树脂块上，在中心处滴加硅胶粘合剂，填充约 90% 的开口（避免产生气泡），然后盖上另....
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结果
图1A、B 分别展示了如何制作吸盘和插头。图2 展示了成功植入插头的方法。植入插头后，后内侧上丘（SC）被暴露，如图2D所示。图3 展示了使用双光子显微镜成像的一个野生型小鼠上丘神经元的钙反应。三角棱镜在显微镜下易于识别，可用于定位成像位置（图3B）。视觉反应以单细胞分辨率显示（图3C、D 及 视频1）。图4 展示了使用宽场显微镜成像的一个部分皮层突变型小鼠上丘神经元的钙反应。所获取的图像首先被下采样至原始尺寸的四分之一（图4B）。视觉诱发的钙反应显示于上丘两侧（<.......
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讨论
实验方案中的关键步骤
最关键的步骤是第5.2和5.3步中的开颅操作。首先，位于人字缝后方0.5 mm处的颅骨较厚，且内部含有血管，在钻孔过程中容易引起出血，因此应充分准备明胶海绵以止血。其次，在横窦上方去除骨片时，极易发生血管破裂。针对该问题，一种替代方法是先将椭圆形区域内的骨质磨薄，再分片移除；另一种技巧是在抬起骨片前用液体浸润骨质，以更轻松地使硬脑膜与颅骨分离，从而避免出血。
另一个关键步骤是第5.4步中的插头植入，整个过程应持续1-2分钟。若出现问题，可首先使用显微操作器将插头移动至ACSF中的合适位置，并确定插头的最终位置。然后，加入硅胶粘合剂，并以适当速度将插头移至最终位置。
意义
本方案具有两个优点。首先，它提供了在皮层完整的野生型小鼠中以单细胞分辨率成像后内侧上丘（SC）的详细步骤，而以往的报道中需吸除覆盖的皮层以暴露前外侧上丘。其次，该方案详细描述了如何利用宽场钙成像技术对部分皮层缺失突变小鼠的整个上丘进行成像。这两种方.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究受到国家自然科学基金（32271060）的支持。Y.-t.L. 设计了研究方案，进行了实验，分析了数据，并撰写了稿件。Z.L. 和 R.W. 参与了实验工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16倍物镜 | 尼康 | ||
| 50 mm镜头 | Computar | M5018-MP2 | |
| 5 mm 盖玻片 | 沃纳仪器 | CS-5R | |
| 带通滤光片 | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| 氰基丙烯酸丁酯 | Vetbond，世界精密仪器公司 | ||
| 用于监测瞳孔的相机 | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| 用于宽场成像的相机 | 巴斯勒 | acA2000-165µm | |
| 电晕处理机 | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| 二向色镜 | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| 检流计 | 剑桥科技 | ||
| 玻璃珠灭菌器 | 真实世界数据 | RS1502 | |
| 微型钻孔器 | 真实世界数据 | 78001 | |
| 显微操作仪 | Sutter Instruments | 四极杆 | |
| 光电倍增管 | 滨松 | R3896 | |
| 旋转编码器 | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| 自固化牙科粘接树脂水门汀 | SuperBond C&B，Sun Medical Co, Ltd.，日本守山 | ||
| 恒温加热垫 | RWD | 69020 | |
| 钛宝石激光器 | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| 半透明硅酮粘合剂 | Kwik-Sil，World Precision Instruments | ||
| 跑步机 | Xinglin Biology | ||
| <强>病毒株 | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | 中国北京脑科学研究院病毒载体中心 | ||
| <强>动物 | |||
| C57BL/6J野生型 | 北京脑科学研究院中国实验室动物资源中心 | ||
| Emx1-Cre | 杰克逊实验室 | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh 实验室 | ||
| <强>软件 | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | 国家仪器公司 | ||
| MATLAB | Mathworks |
参考文献
- May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
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重印与许可
