方法文章

小鼠上丘的钙成像

DOI：

10.3791/65181

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2023年4月21日

 ,  , 
1Chinese Institute for Brain Research

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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该方案详细介绍了在清醒小鼠的上丘（SC）中对钙反应进行成像的过程，包括用双光子显微镜成像单神经元活动，同时在野生型小鼠中保持皮层完整，以及在部分皮层突变小鼠中用宽场显微镜对整个SC进行成像。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上丘（SC）是所有脊椎动物进化上保守的中脑结构，是大脑皮层出现之前最复杂的视觉中心。它接收来自 ~30 种视网膜神经节细胞 （RGC） 的直接输入，每种细胞编码特定的视觉特征。SC 是否只是继承视网膜特征，或者 SC 中是否发生了额外的和潜在的 从头 处理，仍然难以捉摸。为了揭示SC中视觉信息的神经编码，我们在这里提供了一个详细的协议，以在清醒小鼠中使用两种互补方法光学记录视觉反应。一种方法使用双光子显微镜以单细胞分辨率对钙活性进行成像，而不消融覆盖的皮层，而另一种方法使用宽视场显微镜对皮层基本未发育的突变小鼠的整个SC进行成像。该协议详细介绍了这两种方法，包括动物制备、病毒注射、头板植入、栓子植入、数据采集和数据分析。代表性结果表明，双光子钙成像揭示了单细胞分辨率下的视觉诱发神经元反应，而宽视野钙成像揭示了整个SC的神经活动。通过结合这两种方法，人们可以揭示SC中不同尺度的神经编码，并且这种组合也可以应用于其他大脑区域。

引言

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上丘（SC）是所有脊椎动物的重要视觉中枢。在哺乳动物中，它接收来自视网膜和视觉皮层的直接输入1。虽然光学记录已广泛应用于皮层 2,3,4,5，但其在 SC 中的应用受到不良光学访问的阻碍 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17

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方案

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所有实验程序均按照动物福利指南进行，并得到北京中国脑科学研究院IACUC的批准。

注意:该协议的时间表如下:1）制作吸盘;2）注射病毒;3）植入头板;4）3周后，植入塞子;5） 在跑步机上恢复和适应 ~3 天后，进行双光子/宽视场成像。

1.吸盘的准备（图1A）

  1. 将一滴磷酸盐缓冲盐水（PBS，1x）放入丙烯酸培养皿中，并用21G扁平针触摸它，以通过毛细管填充尖端。
  2. 用半透明的硅胶粘合剂覆盖针尖，并放置约~10分钟。
  3. 用剪刀将硅胶粘合剂剪成直径为 ~2 毫米的圆盘。

2.插头的准备（图1B）

  1. 准备一个 0.75 毫米厚的塑料垫片，并在中心切出一个 1 厘米 x 1 厘米的正方形。准备两个亚克力块。用酒精清洁垫片和亚克力块，然后用镜头纸擦拭。
  2. 将垫片放在一个亚克力块上，将硅胶粘合剂沉积到中心以填充~90%的开口（避免气泡），添加另一个亚克力块和~1 kg力，然后等待20分钟。
  3. 在手术显微镜....

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结果

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图 1A、B 分别显示了如何制作吸盘和塞子。图 2 显示了如何成功植入插头。植入塞子后，后内侧SC暴露在外，如图2D所示。图 3 显示了使用双光子显微镜成像的野生型小鼠示例的 SC 神经元的钙反应。在显微镜下很容易捕捉到的三棱柱可用于定位成像部位（图3B）。视觉反应以单细胞分辨率显示（图3C，D和视频1）。图 4 显示了使用宽视野显微镜成像的部分皮层突变小鼠示例的 SC 神经元的钙反应。首先将采集的图像下采样到原始尺寸的四分之一（图4B）。视觉诱发的钙反应显示在SC.......

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讨论

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协议中的关键步骤
最关键的一步是步骤 5.2 和 5.3 中的开颅手术。首先，λ后方 0.5 毫米处的骨头很厚，里面有血管，在钻孔过程中会导致出血。应准备足够的凝胶泡沫来止血。其次，切除横窦上方的骨头时，很有可能发生血管出血。对于故障排除，另一种方法是将椭圆形内的骨头变薄并一块一块地移除。另一个技巧是在提升前浸泡骨头，使硬脑膜更容易从骨头上分离并防止出血。

另一个关键步骤是步骤 5.4 中的栓子植入，整个过程应持续 1-2 分钟。对于故障排除，可以先将带有显微操纵器的插头移动到 ACSF 中的适当位置，然后设置插头的最终位置。然后，加入硅胶并以适当的速度将插头移动到最终位置。

意义
该协议有两个优点。首先，它提供了在野生型小鼠中以单细胞分辨率对后内侧皮质进行成像的细节，而在以前的报告中，覆盖皮层被吸出以暴露前外侧皮质。其次，它详细介绍了如何使用宽视野钙成像技术对部分皮层突变小鼠的整个SC进行成像。这两种方法可以应用于在不同尺度上对动物的其他大脑区域.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作得到了中国国家自然科学基金（32271060）的支持。Y.-t.L.设计了研究，进行了实验，分析了数据，并撰写了手稿。Z.L.和R.W.进行了实验。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16 倍物镜尼康
50 毫米镜头ComputarM5018-MP2
5 毫米盖玻片华纳仪器CS-5R
带通滤光片Chroma TechnologyHQ575/250 m-2p
氰基丙烯酸丁酯Vetbond，世界精密仪器
用于监测瞳孔的相机FLIRBFS-U3-04S2M-CS
相机BasleracA2000-165µ电
晕处理机Electro-Technic ProductsBD-20AC
二向色色度技术T600/200dcrb 
检流计剑桥科技
玻璃珠消毒器RWDRS1502
微钻RWD78001
微作器萨特仪器QUAD
光电倍增管滨松R3896
转子编码器USdigitalMA3-A10-125-N
自固化牙科胶粘剂树脂粘接剂超级邦德 C&B， Sun Medical Co.， Ltd. 日本
恒温加热垫 RWD69020
Ti：Sapphire 激光器Spectra-PhysicsMai Tai HP DeepSee
半透明硅胶胶粘剂 Kwik-Sil，世界精密仪器
机杏林生物
病毒株
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m载体核心，北京
Animals
C57BL/6J 野生型中国脑科学研究所实验动物资源中心， 北京
Emx1-Cre杰克逊实验室 5628
Pals1flox/wtChristopher A. Walsh 实验室
Software
ImageJNIH Image
LabviewNational Instruments
MATLABMathworks
用于宽场成像的 森山跑步脑研究所

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).

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