一种利用精油纳米草本封装技术的抗菌织物

摘要

抗菌实验服可防止病原体积聚造成的交叉污染和意外生物溢出。本文介绍了利用纳米草本封装技术开发对皮肤友好的抗菌织物的实验方案，以及改进的标准测试方法，以精确评估该实验服在常规使用条件下的有效性和适用性。

摘要

在生物危害实验室和医疗机构中，实验服被广泛用作防护服装，以防止直接接触病原体、液体溅洒和烧伤。这些以棉为基础的防护服由于其多孔性、持水能力以及保留使用者体温的特性，为微生物的生长和附着提供了理想的条件。多项研究已证实，致病细菌可在医院工作服和实验服上存活，并成为微生物传播的媒介。

解决这些问题的常用方法是在纺织品整理过程中应用抗菌剂，但由于许多合成化学品具有毒性和环境影响，已引发担忧。持续的疫情也为研究高效、环保且无毒的抗菌制剂提供了契机。本研究采用两种天然生物活性化合物——香芹酚和百里酚，将其包封于壳聚糖纳米颗粒中，可对四种常见于生物危害实验室所用实验服上的人类病原体提供有效防护，抑菌率高达4个对数级（99.99%）。

经处理的织物在经历多达10次洗涤循环后仍可实现90%的微生物减少，足以满足预期用途。我们对现有的标准织物测试方法进行了改进，以更真实地反映实验服使用中的典型场景。这些优化有助于更准确地评估抗菌实验服的有效性，并模拟任何意外微生物泄漏后需在短时间内被灭活的情况。建议进一步开展研究，以比较抗菌实验服与普通防护服在长期使用过程中病原体的累积情况。

引言

在微生物学实验室和医疗机构中，防护白大褂是必须佩戴的个人防护装备（PPE），可防止直接接触病原体、液体溅洒和烧伤。由于多种因素，这种棉质大褂容易促进微生物生长：织物结构提供了附着位点和通气环境，制造过程中使用的棉纤维和淀粉，以及使用者脱落的上皮细胞为其提供了营养，而贴近人体则提供了温暖和湿气。纺织品上微生物的积聚还可能引发过敏和医院感染等健康问题，产生难闻气味，并导致织物劣化¹。

与普通衣物不同，防护服很少被清洗或消毒，这一点在许多调查中均有发现^2,3。大量研究表明，实验服可能成为微生物传播的媒介，并在医疗环境中引发医院感染的风险^2,4，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等耐药菌株³；因此，这些本应防止微生物污染的个人防护装备（PPE）反而引发了健康隐患。目前在生物安全二级（BSL-2）设施或微生物学教学实验室背景下，关于实验服相关感染的横断面研究仍不充分，但许多监管机构已限制在密闭等级内使用实验服。然而，由于实际操作中的限制，如在设施内部清洗衣物和储存的问题，北美许多学术机构难以完全满足这些要求，实验服在食堂、图书馆等公共....

方案

1. 纳米颗粒的制备

1. 纳米草本封装
   1. 配制50 mL的1%（v/v）乙酸溶液。
      警告：冰乙酸具有刺激性，可导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。操作时应穿戴全长实验服、丁腈手套和护目镜，并在通风橱内进行。
   2. 将0.6 g壳聚糖碎片（中等分子量）溶于50 mL上述配制的1%乙酸溶液中，制备1.2%（w/v）壳聚糖溶液。在室温（R/T）下搅拌过夜（O/N），以获得均匀乳液。
   3. 加入0.5 g Tween 80，在60 °C下以1,000 rpm搅拌2小时，得到均匀溶液。在加入活性化合物（香芹酚或百里酚）前，将溶液冷却至室温（R/T）。
   4. 在室温（R/T）下以1,000 rpm搅拌的同时，逐滴或逐步加入0.75 g香芹酚（或百里酚），持续搅拌20分钟。壳聚糖与活性化合物的质量比为1:1.25。
   5. 在持续室温（R/T）搅拌下，逐滴加入50 mL的0.5%（w/v）TPP溶液。继续搅拌30分钟，以获得均匀乳液。
   6. 按照相同步骤制备阴性对照组，但不添加活性化合物。
2. 纯化
   1. 在4 °C条件下以10,000 × g离心乳液30分钟，弃去上清液后收集形成的纳米颗粒（沉淀）。保留上清液用于测定包封效率。
   2. 使用体积为沉淀两倍的1%（v/v）水相Tween 80溶液....

结果

合成纳米颗粒的初步筛选
采用两步乳化-溶剂挥发法（油包水乳液法）¹⁶，成功将生物活性化合物（香芹酚和百里酚）包封于壳聚糖中。通过紫外-可见分光光度法检测，与对照组（即不含任何生物活性成分的壳聚糖纳米颗粒）相比，相应生物活性成分在特征吸收峰处的吸光度证实了包封的成功。所制备的纳米颗粒在4 °C下保存12个月仍保持均匀且稳定。抗菌效果的初步筛选通过管碟法进行验证（图1）。该方法为定性检测，因为抑菌圈的大小受多种因素影响，如琼脂厚度、接种菌液浓度以及待测样品的浓度。尽管也可采用其他较简单的方法（如Kirk-Bauer纸片扩散法或打孔扩散法）进行类似检测，但管碟法具有可调节浓度的优势（图1A），通过稀释纳米颗粒溶液实现不同浓度梯度，且每个管孔最多可容纳200 µL的待测样品。此外，覆层琼脂与菌液混合后形成均匀的接种层，有助于更精确地测定抑菌圈大小¹⁷。实验结果表明，抑菌圈直径随浓度递增而增大.......

讨论

杀菌剂的抗菌效果通常通过定量实验进行检测，例如最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），在这些实验中，细菌被浸没于抗菌液体中培养24小时。然而，这些方法不适用于涂层织物，因为涂层织物缺乏液体界面，且杀菌剂在织物纤维中扩散缓慢。因此，已建立多种标准织物测试方法，例如AATCC 147、ISO 20645、AATCC 100和JIS L 1902。Pinho等人²³对这些标准进行的比较研究指出，目前尚无关于最合适测试方法的共识。本研究对实验方案进行了轻微修改，以更真实地模拟生物安全实验室中抗菌实验服的使用情况。所用测试微生物是基于先前一项研究（未发表）中在BSL-2实验室实验服上频繁检出的物种。这些微生物也代表了制药测试中常用的多种病原微生物，例如一种革兰氏阳性人类病原菌（S. aureus）、一种革兰氏阴性指示菌（E. coli）、一种高度耐药菌（P. aeruginosa）以及一种皮肤致病真菌（C. albicans）。

本研究中观察到的总体抗菌效果（99........

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Millipore Sigma	64-19-7
抗生素基础琼脂	BD Difco	DF0270-17-4	又称抗生素培养基2
抗生素种子琼脂	BD Difco	DF0263-17-3	又称抗生素培养基1
血琼脂（含5%绵羊血的营养琼脂）	由CFIA捐赠
溴甲酚紫乳糖琼脂	由CFIA捐赠
Candida albicans	ATCC 全球生物资源中心	ATTC 10231
香芹酚	Millipore Sigma	282197 (CAS# 499-75-2)
离心机  Allergra X-22R 离心机	Beckman Coulter	型号 # X-22R	带制冷功能。启动后需等待至少20分钟，或直至温度降至设定的低温值（例如4 °C），因制冷需要时间。
中等分子量壳聚糖（CS）	Millipore Sigma	448877 (CAS # 9012-76-4)
对开式热压机	Intiva	IM1200
Escherichia coli (E. coli)	ATCC 全球生物资源中心	ATTC 23725
培养箱	Thermo Scientific	1205M34
Letheen 肉汤	BD Difco	DF0681-17-7	用于中和抗菌作用。不同厂家的产品可能需要添加吐温80，而Difco产品中已预先添加。
Milli Q 水	Millipore Sigma	ZR0Q16WW	去离子水
穆勒-欣顿琼脂	BD Difco	DF0252-17-6
五钠三聚磷酸盐（TPP）	Millipore Sigma	238503 (CAS# 7758-29-4)
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Scientific	AM9624
Pseudomonas aeruginosa	ATCC 全球生物资源中心	ATTC 9027
沙氏葡萄糖琼脂	BD Difco	DF0109-17-1
摇床培养箱/恒温振荡器	VWR	型号# SHKA2000
Staphylococcus aureus	ATCC 全球生物资源中心	ATTC 6538
百里酚	Millipore Sigma	T0501 (CAS# 89-83-8)
胰蛋白胨大豆琼脂	BD Difco	236950
胰蛋白胨大豆肉汤	BD Difco	215235
吐温80	Millipore Sigma	STS0204 (CAS # 9005-65-6)
紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific	GENESYS 30 (840-277000)