一种利用精油纳米草本封装技术的抗菌织物

摘要

抗菌实验服可防止病原体积聚造成的交叉污染和意外生物溢出。本文介绍了利用纳米草本封装技术开发对皮肤友好的抗菌织物的实验方案，以及改进的标准测试方法，以精确评估该实验服在常规使用条件下的有效性和适用性。

摘要

在生物危害实验室和医疗机构中，实验服被广泛用作防护服装，以防止直接接触病原体、液体溅洒和烧伤。这些以棉为基础的防护服由于其多孔性、持水能力以及保留使用者体温的特性，为微生物的生长和附着提供了理想的条件。多项研究已证实，致病细菌可在医院工作服和实验服上存活，并成为微生物传播的媒介。

解决这些问题的常用方法是在纺织品整理过程中应用抗菌剂，但由于许多合成化学品具有毒性和环境影响，已引发担忧。持续的疫情也为研究高效、环保且无毒的抗菌制剂提供了契机。本研究采用两种天然生物活性化合物——香芹酚和百里酚，将其包封于壳聚糖纳米颗粒中，可对四种常见于生物危害实验室所用实验服上的人类病原体提供有效防护，抑菌率高达4个对数级（99.99%）。

经处理的织物在经历多达10次洗涤循环后仍可实现90%的微生物减少，足以满足预期用途。我们对现有的标准织物测试方法进行了改进，以更真实地反映实验服使用中的典型场景。这些优化有助于更准确地评估抗菌实验服的有效性，并模拟任何意外微生物泄漏后需在短时间内被灭活的情况。建议进一步开展研究，以比较抗菌实验服与普通防护服在长期使用过程中病原体的累积情况。

引言

在微生物学实验室和医疗机构中，防护白大褂是必须佩戴的个人防护装备（PPE），可防止直接接触病原体、液体溅洒和烧伤。由于多种因素，这种棉质大褂容易促进微生物生长：织物结构提供了附着位点和通气环境，制造过程中使用的棉纤维和淀粉，以及使用者脱落的上皮细胞为其提供了营养，而贴近人体则提供了温暖和湿气。纺织品上微生物的积聚还可能引发过敏和医院感染等健康问题，产生难闻气味，并导致织物劣化¹。

与普通衣物不同，防护服很少被清洗或消毒，这一点在许多调查中均有发现^2,3。大量研究表明，实验服可能成为微生物传播的媒介，并在医疗环境中引发医院感染的风险^2,4，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等耐药菌株³；因此，这些本应防止微生物污染的个人防护装备（PPE）反而引发了健康隐患。目前在生物安全二级（BSL-2）设施或微生物学教学实验室背景下，关于实验服相关感染的横断面研究仍不充分，但许多监管机构已限制在密闭等级内使用实验服。然而，由于实际操作中的限制，如在设施内部清洗衣物和储存的问题，北美许多学术机构难以完全满足这些要求，实验服在食堂、图书馆等公共区域穿着的情况十分普遍。解决这些问题的一个实用方案是在纺织品后整理过程中应用抗菌剂。

抗菌织物在运动服、健身服和袜子中的应用日益广泛，主要用于减少体味。然而，除了一些银涂层棉质口罩和医疗保健服装外，这类织物在个人防护装备（PPE）开发中的应用尚不普遍⁵。我们报道了一种用于实验服的抗菌织物的开发，该织物可抑制生物安全二级（BSL-2）实验室中常见的病原体，并有效防止常见病原体的交叉污染。

目前，市场上已有多种抗菌织物和整理剂，但大多数产品使用重金属胶体颗粒（如银、铜、锌）、有机金属化合物或三氯生、季铵盐类等合成化学品，这些成分对环境不友好¹，并可能引发皮肤刺激和过敏等健康问题⁶。某些合成制剂因可能影响非靶向微生物（如正常菌群）或诱导微生物产生抗菌耐药性（AMR），而引发担忧。美国食品药品监督管理局（FDA）对商用抗菌织物进行监管，要求其对使用者无毒且不具有生态毒性。因此，基于天然生物杀菌剂、可抑制广泛微生物的抗菌织物更具优势。精油（EOs）被广泛用作抗菌和治疗性物质，但由于其耐久性不足，限制了其在抗菌整理中的应用^6,7,8。根据我们对纳米草本整理技术的了解及市场调研⁸，目前尚无商业化上市的草本类抗菌织物。这主要是因为合成涂层易于制造且耐久性长。少数仅用于研究目的的纳米草本涂层纺织品包括印度苦楝⁷、辣木⁹和咖喱叶⁹。

本研究采用两种从牛至精油中提取的生物活性成分——香芹酚和百里酚，这两种成分对多种细菌病原体和病毒均有效，且通常被认为对人体安全¹⁰。然而，这些生物活性成分具有挥发性，若直接应用于织物上，其抗菌效果持续时间较短。纳米草本封装技术是一种将生物活性成分或药物包载于聚合物外壳内的过程，该外壳可保护核心成分免受环境降解，从而延长其保质期。此外，这些聚合物颗粒尺寸较小，通常在10 nm至100 nm之间，可提高应用效率，并延缓生物活性化合物在织物上的释放。这些生物活性化合物已被用于多种用途，例如食品保鲜¹⁰，但尚未用于纺织品涂层。

在众多聚合物封装材料中，壳聚糖因其多种特性而成为一种极具吸引力的候选材料，例如无毒、可生物降解、黏膜黏附性和生物相容性¹¹。壳聚糖是一种天然多糖，通过甲壳素脱乙酰化过程获得，而甲壳素广泛存在于贝壳和真菌细胞壁中。它被应用于生化和食品保鲜领域，如药物或蛋白质递送^11,12,13、可控释放¹⁴以及抗菌薄膜¹⁰。壳聚糖在水中不易溶解，但在酸性介质中可形成胶体悬浮液。生物活性分子可通过一种简单的两步离子凝胶法加载到壳聚糖纳米颗粒（NPs）中^14,15,16。在此过程中，百里香酚和香芹酚等疏水性生物活性化合物在表面活性剂吐温80的辅助下形成水包油乳液。随后，使用多阴离子化合物五钠三聚磷酸盐（TPP）在多阳离子聚合物分子上的氨基与TPP分子的磷酸基团之间形成交联，从而稳定该复合物。该复合过程使生物活性化合物在壳聚糖基质内固化，随后经纯化并涂覆于棉布片上，制得抗菌织物。

在将纳米制剂应用于织物之前，必须首先测试其乳液状态下的抗菌效果。这可以通过定性方法方便地进行评估，例如 Kirby-Bauer 纸片扩散法、孔扩散法和圆柱扩散平板法。然而，圆柱扩散平板法¹⁷具有可加载不同体积制剂并比较抑菌圈范围的灵活性。该方法中，将抗菌制剂加入不锈钢圆柱中，然后放置于已接种测试微生物或病原体的软琼脂层上。所产生的抑菌圈直径与抗菌制剂的抑制能力成正比，因此可作为肉汤稀释法的替代方法。然而，除非维持特定标准，否则清晰区大小仅能在同一平板内作为比较性或定性指标。抗菌剂通过抑制病原体生长（抑菌）或杀死细胞（杀菌）发挥作用，其效果可分别通过最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）进行量化。然而，生物活性化学物质在其制剂形式（液态）中与涂覆于织物等基材上时，其效能和行为存在差异¹⁸。这是因为多种因素会影响其效果，例如抗菌剂在织物上的附着稳定性、水分含量、基材类型以及微生物的附着能力。如果目标仅为评估抑菌活性，可采用如"平行划线法"¹⁹等定性检测方法，以相对快速简便地评估可扩散性抗菌制剂。但如果需要测定杀菌效果，则可采用"纺织材料上抗菌整理剂的评估"²⁰方法，该方法可提供接种病原体的对数减少值。

方案

1. 纳米颗粒的制备

1. 纳米草本封装
   1. 配制50 mL的1%（v/v）乙酸溶液。
      警告：冰乙酸具有刺激性，可导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。操作时应穿戴全长实验服、丁腈手套和护目镜，并在通风橱内进行。
   2. 将0.6 g壳聚糖碎片（中等分子量）溶于50 mL上述配制的1%乙酸溶液中，制备1.2%（w/v）壳聚糖溶液。在室温（R/T）下搅拌过夜（O/N），以获得均匀乳液。
   3. 加入0.5 g Tween 80，在60 °C下以1,000 rpm搅拌2小时，得到均匀溶液。在加入活性化合物（香芹酚或百里酚）前，将溶液冷却至室温（R/T）。
   4. 在室温（R/T）下以1,000 rpm搅拌的同时，逐滴或逐步加入0.75 g香芹酚（或百里酚），持续搅拌20分钟。壳聚糖与活性化合物的质量比为1:1.25。
   5. 在持续室温（R/T）搅拌下，逐滴加入50 mL的0.5%（w/v）TPP溶液。继续搅拌30分钟，以获得均匀乳液。
   6. 按照相同步骤制备阴性对照组，但不添加活性化合物。
2. 纯化
   1. 在4 °C条件下以10,000 × g离心乳液30分钟，弃去上清液后收集形成的纳米颗粒（沉淀）。保留上清液用于测定包封效率。
   2. 使用体积为沉淀两倍的1%（v/v）水相Tween 80溶液洗涤颗粒（来自步骤1.2.1），以去除未结合或游离的活性化合物。每次洗涤时需通过涡旋充分扰动沉淀，直至形成均匀溶液。
   3. 用去离子水洗涤颗粒（来自步骤1.2.2）两次，以去除杂质。
   4. 将沉淀（来自步骤1.2.3）重新悬浮于30 mL去离子水中，复溶纳米颗粒。将纳米颗粒溶液在4 °C下保存，最长可达6个月。
      ​注意：实验可在此阶段暂停。
3. 表征
   1. 用去离子水稀释纳米颗粒，使紫外-可见（UV-Vis）光谱在250至400 nm范围内的读数处于合适范围（吸光度>1）。
   2. 使用紫外-可见分光光度计记录纳米颗粒在250至400 nm波长范围内的UV-Vis吸收光谱。
   3. 取一份纳米颗粒样品（1 mL）在室温（R/T）下保存不同时间（例如1至6个月），并与新鲜样品一起通过管碟法检测其抗菌效果。
4. 织物涂层
   1. 采用浸轧-烘干-固化法将纳米颗粒涂覆于机织棉布上^7,21。
      1. 将布样浸入含有纳米颗粒和织物粘合剂的溶液中3分钟，确保充分浸透。随后通过双辊实验室轧车去除多余液体。
      2. 在100 °C下烘箱干燥30分钟，并在130 °C下固化10分钟。
      3. 最后，在超声波浴中清洗布样15分钟，以去除未结合的纳米颗粒。
         注意：也可采用下述简化方法。
   2. 将棉布（或实验服布样）裁剪成10 cm × 10 cm的正方形。
   3. 在室温（R/T）下，将裁剪好的布片浸入装有2 mL合成纳米颗粒（10%）的塑料容器（12 cm × 12 cm）中，持续2分钟。通过风干去除多余液体。
   4. 在100 °C下热压3分钟，使纳米颗粒固定于织物上。
   5. 用2%（w/v）水相Tween 80溶液冲洗以去除未结合的纳米颗粒，随后在100 °C烘箱中干燥30分钟。
      注意：该抗菌织物可在室温（R/T）下保存2年。
5. 洗涤耐久性
   1. 将织物裁剪成50 mm × 50 mm的正方形布样。
   2. 将布样放入玻璃或塑料容器中的50 mL温自来水（40 °C）中，并加入两滴普通洗涤剂（非抗菌型）。
   3. 在摇床或磁力搅拌器上振荡清洗30分钟。
   4. 风干或在60 °C下孵育2小时，随后检测其抗菌效能。

2. 用于纳米颗粒筛选的圆柱形平板实验

1. 根据制造商说明配制胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、抗生素基础琼脂（ABA）和抗生素种子琼脂（ASA），并通过高压灭菌器在 121 °C、15 psi 条件下灭菌 15 分钟。
2. 采用三区划线法将待测微生物（来自菌种库）接种至新配制的 TSA 平板（或其他适宜培养基）上，进行转接培养，以获得纯培养平板，并进行培养。（推荐菌种：S. aureus、E. coli、P. aeruginosa 和 C. albicans。）
3. 从新鲜纯培养平板中挑取菌落接种于 TSB（10 mL 试管）中，在 35 °C 条件下振荡培养过夜（O/N），振荡速度为中等（100–200 rpm）。
4. 将熔融状态的 ASA 培养基每管分装 5.0 mL 至各测试试管中。试管数量应与待测微生物种类数相对应。
5. 无菌操作将 20 mL 预先灭菌的熔融 ABA 倾注至每个培养皿（100 mm × 20 mm）中，形成底层。培养皿数量应与待测微生物种类数一致。待培养基完全凝固后备用。
6. 底层凝固后，向每管熔融 ASA 中加入步骤 2.3 中的过夜培养物（1.0 mL，预热至 35 °C），立即混匀并将混合液转移至 ABA 平板表面。轻轻旋转平板，使熔融琼脂层均匀分布。确保种子层表面光滑，无凸起或气泡。
7. 使用无菌镊子在每块琼脂平板上均匀放置最多六个不锈钢圆筒（6 mm × 6 mm × 10 mm；预先高压灭菌），呈六边形排列（图 1）。
8. 向各圆筒中加入不同体积（30 µL、50 µL、75 µL 和 100 µL）的合成纳米颗粒（NPs），用于筛选其抗菌效果。阴性对照组不添加任何生物活性物质。
9. 将常见细菌病原体（如 E. coli、S. aureus、P. aeruginosa）在 35 °C 培养 24 小时，真菌（如 C. albicans）则在室温（R/T）下培养 3 天。
10. 测量透明抑菌圈的直径，并比较所合成纳米颗粒的抑菌效果。
    ​注：该试验可用于初步筛选适合涂覆于织物上的最佳纳米颗粒。

3. 平行划线法（改良自 AATCC 147）

1. 材料准备
   1. 将经过纳米颗粒处理的织物裁剪成 50 mm × 25 mm 的样品片。
   2. 根据制造商说明配制 Mueller-Hinton 琼脂（MHA）、TSA 和 TSB 培养基，并在 121 °C、15 psi 条件下高压灭菌 15 分钟。
   3. 采用三区划线法将待测试功效的目标微生物（来自保存菌种）接种至新制备的 TSA 平板（或其他适宜培养基）上，于 35 °C 培养 2 天（细菌）或室温培养 5 天（真菌），以获得纯培养物。（推荐菌种：S. aureus、E. coli、P. aeruginosa 和 C. albicans。）
2. 微生物接种
   1. 从新鲜纯培养平板中挑取菌落接种于 TSB 液体培养基（10 mL 试管）中，在 35 °C 条件下振荡过夜培养（转速 100–200 rpm）。
   2. 将过夜培养物稀释至 1.5 × 10⁸ 菌落形成单位（CFU）/mL，或调整至相当于 0.5 麦氏浊度标准（通常为 1/10 至 1/20 稀释，适用于大多数健康菌体）。
   3. 使用 4 mm 无菌接种环取上述稀释菌液进行接种：蘸取一环液体培养物，在 MHA 琼脂平板表面划五条平行线，每条长 6 cm，间距 1 cm，具体操作参见 图 2。接种过程中不得重复蘸取菌液。
   4. 用无菌刮刀轻轻将织物样品压在五条划线上，确保织物位于划线中央并接触所有五条线。于 35 °C 培养 24 小时。
3. 抗菌效果的定性评估
   1. 观察培养后的平板，检查沿划线方向在织物边缘以外是否出现生长中断现象（透明区域表示生长被抑制）。
   2. 使用公式（1）计算织物样品两侧沿划线方向的抑菌圈平均宽度（W）：
      W = (T - D)/2    （1）
      W = 透明区宽度；T = 包括样品宽度在内的透明区总长度；D = 织物样品宽度（25 mm）。

4. 定量对数减少法（改良自 AATCC 100）

1. 实验准备
   1. 将织物裁剪成 50 mm × 50 mm 的正方形样品。
   2. 根据制造商说明书配制 TSA、TSB、Letheen 肉汤和磷酸盐缓冲液（PBS），并通过高压灭菌对培养基进行灭菌。
   3. 通过将纯化平板上的单菌落接种至无菌 TSB 中，于 35 °C 培养 18–24 小时，制备待测微生物的过夜（O/N）培养物。（推荐菌种：S. aureus、E. coli、P. aeruginosa 和 C. albicans。）
2. 微生物培养物的接种
   1. 将过夜培养物稀释至 1.5 × 10⁸ CFU/mL，或相当于 0.5 麦克法登标准浊度（通常为大多数健康培养物的 1/10 至 1/20 稀释度）。
   2. 通过以下方法测定织物的液体持留能力，以确定接种所需的适当培养物体积。
      1. 将一系列体积的稀释肉汤培养物（例如 100–500 µL）分别加至置于不同培养皿中的织物样品上，选择能使织物完全吸收液体且无残留游离液体的体积。液体持留能力因织物类型和厚度而异。对于普通棉质实验服，约为 200 µL。
      2. 将上述确定的持液量（例如 200 µL）的每种培养物接种到置于无菌培养皿中的织物样品上。样品数量应与测试项目数量相对应（例如立即测试和洗涤后测试[以及所测试的洗涤循环次数]），并在不同接触时间（设定时间/天，例如 30 分钟、2 小时、第 1–3 天）下检测抗菌效果。
         ​注意：使用带气溶胶滤芯吸头的微量移液器（以防止后续使用时移液器污染），将培养物均匀接种于织物样品上。
      3. 阴性对照使用相同类型的未经处理的织物样品。针对每种相应的测试微生物种类、接触时间、不同织物类型及洗涤循环次数均需设置阴性对照。
3. 通过活菌平板计数法回收微生物
   1. 将接种后的织物样品（包括处理组和未处理组）置于培养皿中（皿盖微开），在室温（R/T）下晾干至所需测试的接触时间（例如 0 分钟、30 分钟、60 分钟等，或长期效应可延长至数天）。务必包含“0 分钟”时间点，以表示即时效果及中和效果。
   2. 将织物样品无菌转移至独立的无菌离心管（50 mL）中，并拧紧管盖。
   3. 加入 Letheen 肉汤（或其他合适的中和缓冲液），制成 1/100 稀释液（例如，对于 200 µL 接种量，加入 19.8 mL）。
   4. 拧紧离心管盖，涡旋振荡 1 分钟（中等速度）。
   5. 用无菌 PBS 对悬液进行连续 1/10 系列稀释，使“未处理”组的菌落数降至无法计数（TLTC）。
   6. 取稀释液 0.1 mL 接种于适宜的培养基平板上，所选培养基应支持目标微生物生长（例如细菌使用 TSA，真菌使用沙氏葡萄糖琼脂 [SDA]），或选择能优化生长并提供良好对比度以确保菌落计数准确的培养基。
   7. 细菌平板于 35 °C 培养 2 天，真菌平板于室温（R/T）培养 5 天。
   8. 使用菌落计数器或图像分析软件（例如 CFU AI）直接计数可存活的 CFU 数量。
   9. 使用公式（2）计算抗菌织物引起的微生物对数减少值（R）：
      R = × 100     （2）
      A = 从未处理织物回收的 CFU 数量的对数值；B = 从处理织物回收的 CFU 数量的对数值。

结果

合成纳米颗粒的初步筛选
采用两步乳化-溶剂挥发法（油包水乳液法）¹⁶，成功将生物活性化合物（香芹酚和百里酚）包封于壳聚糖中。通过紫外-可见分光光度法检测，与对照组（即不含任何生物活性成分的壳聚糖纳米颗粒）相比，相应生物活性成分在特征吸收峰处的吸光度证实了包封的成功。所制备的纳米颗粒在4 °C下保存12个月仍保持均匀且稳定。抗菌效果的初步筛选通过管碟法进行验证（图1）。该方法为定性检测，因为抑菌圈的大小受多种因素影响，如琼脂厚度、接种菌液浓度以及待测样品的浓度。尽管也可采用其他较简单的方法（如Kirk-Bauer纸片扩散法或打孔扩散法）进行类似检测，但管碟法具有可调节浓度的优势（图1A），通过稀释纳米颗粒溶液实现不同浓度梯度，且每个管孔最多可容纳200 µL的待测样品。此外，覆层琼脂与菌液混合后形成均匀的接种层，有助于更精确地测定抑菌圈大小¹⁷。实验结果表明，抑菌圈直径随浓度递增而增大...

讨论

杀菌剂的抗菌效果通常通过定量实验进行检测，例如最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），在这些实验中，细菌被浸没于抗菌液体中培养24小时。然而，这些方法不适用于涂层织物，因为涂层织物缺乏液体界面，且杀菌剂在织物纤维中扩散缓慢。因此，已建立多种标准织物测试方法，例如AATCC 147、ISO 20645、AATCC 100和JIS L 1902。Pinho等人²³对这些标准进行的比较研究指出，目前尚无关于最合适测试方法的共识。本研究对实验方案进行了轻微修改，以更真实地模拟生物安全实验室中抗菌实验服的使用情况。所用测试微生物是基于先前一项研究（未发表）中在BSL-2实验室实验服上频繁检出的物种。这些微生物也代表了制药测试中常用的多种病原微生物，例如一种革兰氏阳性人类病原菌（S. aureus）、一种革兰氏阴性指示菌（E. coli）、一种高度耐药菌（P. aeruginosa）以及一种皮肤致病真菌（C. albicans）。

本研究中观察到的总体抗菌效果（99....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Millipore Sigma	64-19-7
抗生素基础琼脂	BD Difco	DF0270-17-4	又称抗生素培养基2
抗生素种子琼脂	BD Difco	DF0263-17-3	又称抗生素培养基1
血琼脂（含5%绵羊血的营养琼脂）	由CFIA捐赠
溴甲酚紫乳糖琼脂	由CFIA捐赠
Candida albicans	ATCC 全球生物资源中心	ATTC 10231
香芹酚	Millipore Sigma	282197 (CAS# 499-75-2)
离心机  Allergra X-22R 离心机	Beckman Coulter	型号 # X-22R	带制冷功能。启动后需等待至少20分钟，或直至温度降至设定的低温值（例如4 °C），因制冷需要时间。
中等分子量壳聚糖（CS）	Millipore Sigma	448877 (CAS # 9012-76-4)
对开式热压机	Intiva	IM1200
Escherichia coli (E. coli)	ATCC 全球生物资源中心	ATTC 23725
培养箱	Thermo Scientific	1205M34
Letheen 肉汤	BD Difco	DF0681-17-7	用于中和抗菌作用。不同厂家的产品可能需要添加吐温80，而Difco产品中已预先添加。
Milli Q 水	Millipore Sigma	ZR0Q16WW	去离子水
穆勒-欣顿琼脂	BD Difco	DF0252-17-6
五钠三聚磷酸盐（TPP）	Millipore Sigma	238503 (CAS# 7758-29-4)
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Scientific	AM9624
Pseudomonas aeruginosa	ATCC 全球生物资源中心	ATTC 9027
沙氏葡萄糖琼脂	BD Difco	DF0109-17-1
摇床培养箱/恒温振荡器	VWR	型号# SHKA2000
Staphylococcus aureus	ATCC 全球生物资源中心	ATTC 6538
百里酚	Millipore Sigma	T0501 (CAS# 89-83-8)
胰蛋白胨大豆琼脂	BD Difco	236950
胰蛋白胨大豆肉汤	BD Difco	215235
吐温80	Millipore Sigma	STS0204 (CAS # 9005-65-6)
紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific	GENESYS 30 (840-277000)