益生菌喷雾干燥的工艺开发和产品质量评估

Summary

该协议详细介绍了喷雾干燥益生菌产品的生产和物理化学表征所涉及的步骤。

Abstract

益生菌和益生元因其健康益处而受到食品和制药行业的极大兴趣。益生菌是活细菌，可以对人类和动物的健康产生有益的影响，而益生元是喂养有益肠道细菌的营养素。粉末益生菌因其摄入和作为食品补充剂纳入饮食的简便性和实用性而广受欢迎。然而，干燥过程会干扰细胞活力，因为高温会使益生菌失活。在此背景下，本研究旨在介绍喷雾干燥益生菌的生产和物理化学表征所涉及的所有步骤，并评估保护剂（模拟脱脂牛奶和菊粉:麦芽糊精缔合）和干燥温度对提高粉末产量和细胞活力的影响。结果表明，模拟脱脂牛奶在80 °C时提高了益生菌活力。 使用这种保护剂，只要入口温度升高，益生菌活力、水分含量和水分活度 （Aw） 就会降低。益生菌的活力随着干燥温度的升高而降低。在接近120°C的温度下，干燥的益生菌显示出约90%的活力，水分含量为4.6% w/w，Aw为0.26;足以保证产品稳定性的值。在这种情况下，需要高于120°C的喷雾干燥温度，以确保微生物细胞在粉末制剂中的活力和保质期以及食品加工和储存过程中的存活率。

Introduction

要定义为益生菌，添加到食物（或补充剂）中的微生物必须被活活消耗，能够在宿主胃肠道中通过期间存活，并以足够的量到达作用部位以发挥^{有益作用1}，^2，7。

对益生菌的兴趣日益浓厚，是因为它们对人类健康具有多种益处，例如刺激免疫系统、降低血清胆固醇水平、通过作用于有害微生物来增强肠道屏障功能，以及它们在治疗肠易激综合征方面的有益作用， 其中^2，3。此外，多项研究表明，益生菌可以对人体其他部位产生积极影响，其中不平衡的微生物群落可引起传染病³，^4，5。

为了使益生菌具有治疗效果，产品在食用时应含有 10 6-10 ⁷ CFU/g 的细菌⁶。另一方面，意大利卫生部和加拿大卫生部已确定，食品中益生菌的最低水平应为每天或每份10⁹ CFU / g活细胞，分别为⁷。考虑到需要大量益生菌来保证它们会产生有益的效果，因此必须保证它们在加工、货架储存和通过胃肠道 （GI） 过程中的存活。多项研究表明，微胶囊化是提高益生菌整体活力的有效方法8，⁹，^10，11。

在这种情况下，已经开发了几种用于益生菌微胶囊化的方法，例如喷雾干燥，冷冻干燥，喷雾冷却，乳液，挤出，凝聚，以及最近的流化床¹¹，^12，13，14。喷雾干燥（SD）微胶囊化广泛用于食品工业，因为它是一种简单，快速且可重复的过程。它易于放大，并且在低能量需求下具有高产量¹¹，¹²，^13，14。尽管如此，暴露在高温和低水分含量下会影响益生菌细胞的存活和活力¹⁵。对于给定菌株，可以通过确定培养年龄和条件的影响来改善这两个参数，以预先适应培养并优化喷雾干燥条件（入口和出口温度，雾化过程）和封装组合物⁸，^14，16，^17，18。

封装溶液的成分也是SD过程中的一个重要因素，因为它可以定义对不利环境条件的保护水平。菊粉、阿拉伯胶、麦芽糊精和脱脂牛奶被广泛用作益生菌干燥的封装剂⁵，¹⁷，^18，19。菊粉是一种低聚果糖，具有很强的益生元活性并促进肠道健康¹⁹。脱脂牛奶在维持干燥细菌细胞的活力方面非常有效，并产生具有良好复溶性能的粉末¹⁷。

植物寄乳杆菌FT-259 是一种乳酸菌，除了益生菌性状²⁰，²¹ 外^，还产生细菌素并具有抗李斯特活性。它是一种兼性杂发酵棒状革兰氏阳性细菌，从15°C生长到37°C²⁰，与稳态体温相容。本研究旨在介绍喷雾干燥益生菌（植物乳杆菌FT-259）的生产和物理化学表征所涉及的所有步骤，并评估保护剂和干燥温度的影响。

Protocol

1. 益生菌细胞的生产

1. 准备德曼罗戈萨和夏普（MRS）肉汤。
2. 重新激活MRS肉汤中目标培养物的1%（v / v）（此处使用植物 副植物乳杆菌 FT-259）。
3. 在足够的温度下孵育24小时（我们使用37°C）。

2. 将细菌与培养物分离

1. 使用50mL锥形管在4°C下以7，197× g 离心细菌培养物5分钟。重要的是在手术前平衡管子的重量。
2. 使用移液器除去上清液，并将其丢弃在合适的容器中。用磷酸盐缓冲液（pH 7）洗涤沉淀，并使溶液均质化。
3. 重复前面提到的离心过程。
4. 为了获得沉淀，使用移液管将上清液取出并丢弃在适当的容器中。

3. 添加干燥助剂

1. 选择两种干燥助剂组合物（保护剂）的组合:菊粉:麦芽糊精混合物和模拟脱脂牛奶（表1）^22，23。
2. 称取5克菊粉和5克麦芽糊精以获得保护剂的第一次组合。
3. 称取菊粉3克、乳糖3克、胶体SiO 20.4克、乳清蛋白3.6克，得到第二种保护剂组合。
4. 将每种干燥助剂加入超纯水（1:10）中，并接受磁力搅拌直至溶解。
5. 确保保护剂和水均匀，然后将益生菌颗粒加入混合物中，适度搅拌20分钟。

干燥助剂	菊粉和麦芽糊精	模拟脱脂牛奶
麦芽糊精	5%	-
乳清蛋白	-	3.60%
乳糖	-	3%
菊粉	5%	3%
胶体SiO2	-	0.40%

表1:干燥助剂的组成。

4. 喷雾干燥

1. 打开喷雾干燥机（SD），设置干燥气体流量，入口干燥温度以及雾化器气体流量和压力如下:
   入口温度:80 °C
   风量: 60 立方米/小时
   进给速度:4克/分钟
   雾化流量:17升/分钟
   雾化压力:1.5千克力/平方厘米²
   雾化器喷嘴直径: 1 mm
2. 制备保护剂组合物并加入浓缩益生菌颗粒。
3. 通过蠕动泵开始益生菌组合物（细胞加保护剂）的饲料。
4. 启动计时器，并在溶液进入雾化器时放置产品收集容器。
5. 每5分钟记录一次出口温度，以跟踪可能的温度不稳定性。
6. 当所有益生菌成分都喂入SD时，停止计时器。
7. 称量产品收集容器以确定送入系统的组分量和收集的干燥产物的量，以计算通过干燥器中的质量平衡的干燥产量（产品回收）。
8. 使用模拟脱脂牛奶来评估温度对益生菌细胞活力的影响，方法是设置五种不同的喷雾干燥温度（80 °C、100 °C、120 °C、140 °C 和 160 °C 与 59 °C、70 °C、83 °C、96 °C 和 108 °C）的出口温度。

5. 粉末表征

1. 产品含水率
   1. 精确称取100 mg干燥产品，并将其放入卡尔费休设备的滴定容器中。
   2. 按下起始按钮可启动样品中存在的水的双安培滴定。
2. 水活度
   1. 在25°C下称取湿度计样品室中的0.6g干燥产品。
   2. 合上设备盖。
      注意:测试将自动开始，并在样品达到样品室内的平衡蒸气压时停止。

6. 益生菌活力

1. 将先前制备的细菌悬浮液稀释在 9 mL 蛋白胨水 （0.1%， v/v） 中。
2. 涡旋直至完全分散。
3. 在 9 mL 盐水溶液 （0.9% NaCl） 中进行连续十进制稀释 （1:10）。
4. 将稀释液播种到MRS琼脂平板上，并在37°C下孵育24-48小时。
5. 使用带放大镜的菌落计数器计数菌落形成单位（CFU / g）。
6. 根据以下公式计算干燥产品中的益生菌活力:
   EE （%） = （N∕N_o） × 100
   其中，N是喷雾干燥后的活细胞数，_No是喷雾干燥前的细菌细胞数。
7. 表示产品分散体CFU/g中活细胞的数量。

7. 数据分析

1. 在统计软件中将获得的数据制成表格，并使用多重比较测试（ANOVA）进行分析。

Results

本研究采用食品级包封剂（菊粉:麦芽糊精和模拟奶粉）对 植物乳杆菌 进行包封，在保持细菌细胞活力方面表现出较高的产品质量和功效^17，19。

80 °C下益生菌SD结果显示，不同的保护剂体系（菊粉:麦芽糊精和模拟脱脂乳）促进了益生菌细胞的有效保护，活力分别为95.1%和97.0%。两种保护剂系统的产品收率接近 50% w/w，模拟脱脂牛奶的产量略高，从而产生了具有更好外观和流动性的产品。然后，将益生菌组合物与模拟脱脂牛奶相结合，在80°C至160°C的较高温度下进行喷雾干燥（图1）。

正如预期的那样，SD温度的升高倾向于降低益生菌的活力，在160 °C时达到近80%。 从图1 中也可以看出，干燥温度对产品收率的影响可以忽略不计，平均值为50.7%±2.4%w/w;这些值通常在实验...

Discussion

植物拉松 FT-259是一种革兰氏阳性杆状细菌，是具有抗李斯特活性的细菌素的生产者，具有很高的益生菌潜力²⁰。Son等人²⁴ 先前证明了 副植物乳杆菌 菌株的免疫刺激剂和抗氧化能力。此外，它们具有巨大的益生菌潜力，具有在人工胃和胆汁条件下的稳定性、对抗生素的敏感性以及与肠道细胞结合等特性。此外，它们不会产生可能对胃肠道产生负面影响的代谢物。此外，Choi和Chang²⁵研究了 植物乳杆菌 EM，并报告了其基于胆盐水解酶活性和细胞表面结合能力的胆固醇降低潜力。除了表现出对酸和胆汁胁迫的耐受性外， 植物乳杆菌 EM还显示出对病原体和抗生素耐药性的抗菌活性，验证了其作为益生菌的潜力。

然而，生产用于商业化的干燥益生菌具有挑战性，因为微生物暴露于各种应激因素，如热、机械、渗透和氧化应激。该过程所涉及的高温会促进参与细胞代谢的酶和蛋白质的变性，从而导致微生物活力损失。干燥过程中的...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqua Lab 4TEV	十边形装置	-	水分活度计
离心机（型号 5430 R）	Eppendorf	-	离心机
体 SiO2 （Aerosil 200）	Evokik	7631-86-9	干燥助剂
苣中的低聚果糖	Sigma-Aldrich	9005-80-5	干燥助剂
GraphPad Prism（版本 8.0）软件	GraphPad 软件	-	美国加利福尼亚州
卡尔费休 870 Titrino Plus	瑞士万通	-	水分含量
糖	Milkaut	63-42-3	干燥助剂
麦芽糊精	Ingredion	9050-36-6	干燥助剂
Milli-Q	Merk	-	超纯水系统
MRS 琼脂	Oxoid	-	培养基
MRS 肉汤	Oxoid	-	培养基
OriginPro（9.0 版）软件	OriginLab	-	美国马萨诸塞州北安普顿
喷雾干燥机 SD-05	Lab-Plant Ltd	-	喷雾干燥机
乳清蛋白	Arla Foods Ingredients S.A.	91082-88-1	助干剂