本文描述了一种新型的直接植物输注装置，用于筛选分子对细菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）或其昆虫媒介（Diaphorina citri, Kuwayama）的有效性，这两种生物共同导致柑橘黄龙病。
本文内容
摘要
摘要
在植物中测试治疗性化合物的功能是农业研究的重要组成部分。叶片喷施和土壤浇灌是常规方法，但存在吸收量不稳定以及被测试分子在环境中降解等缺点。树干注射法在树木上已有成熟应用，但大多数现有方法需要昂贵的专有设备。为了筛选黄龙病的多种治疗方法，亟需一种简单且低成本的方法，将这些化合物递送至感染韧皮部限制性细菌Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）或携带取食韧皮部的CLas昆虫媒介Diaphorina citri Kuwayama（D. citri）的小型温室栽培柑橘树的维管组织中。
为满足这些筛选需求，设计了一种可连接至植物主干的直接植物输注（DPI）装置。该装置采用基于尼龙的3D打印系统制造，并使用易于获取的辅助组件。通过在柑橘植株中使用荧光标记物5,6-羧基荧光素二乙酸酯，对该装置的化合物吸收效率进行了测试。实验中常规观察到标记物在整株植物体内均匀分布。
此外，该装置被用于递送抗菌和杀虫分子，以分别评估其对CLas和D. citri的影响。利用该装置将氨基糖苷类抗生素链霉素递送至感染CLas的柑橘植株中，结果显示，处理后2至4周内CLas的滴度有所降低。将新烟碱类杀虫剂吡虫啉递送至受D. citri侵害的柑橘植株后，第7天时显著增加了木虱的死亡率。这些结果表明，该DPI装置是一种有效的植物分子递送系统，可用于 测试，并有助于相关研究与筛选工作。
引言
在商业和景观环境中，植物的管理通常需要使用化学物质来优化植物的生长和健康状况。这些分子的递送方式取决于分子的类型、功能、植物种类以及现有的管理体系。叶片和土壤施用是最简单的递送策略，但某些分子在吸收上的局限性使得直接递送成为必要。其中一类典型分子是治疗性分子，它们在植物体内系统性移动时效果最佳，但无法通过简单的表面施用有效递送1。黄龙病（HLB），也称为柑橘黄化病，就是这种情况。HLB 是一种与韧皮部受限的细菌相关的病害，该细菌为Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas），无法在植物体外或其昆虫媒介Diaphorina citri Kuwayama（D. citri）之外进行培养2。
如果假定的治疗性分子是基因产物，则可以通过创建表达这些化合物的转基因植物来对其进行测试。然而，转基因植物的制备耗时较长且资源消耗大，高度依赖基因型，并可能受到基因沉默的抑制3。此外，即使这些转基因植物表现出有希望的结果，监管限制和公众认知问题也会降低其获得商业认可的可能性4,5。相比之下，外源施加化合物的方法简化了生物分子和合成分子的测试，因为它无需构建稳定或瞬时表达的转基因植物，从而减少了测试分子效应所需的时间和资源。一种高效且有效的外源化合物系统性递送至植物的方法，可用于多种研究和筛选目的。
其中一种应用是分析分子在植物维管系统中的系统性运动，可通过可追踪的标记物实现，这些标记物可以是荧光的、可见的，或是独特的化学同位素6,7,8,9。一种常用的荧光标记物是5,6-羧基荧光素二乙酸酯（CFDA），它是一种可穿透细胞膜的染料，进入细胞后被胞内酯酶降解为5,6-羧基荧光素（CF），从而转变为荧光且无法穿透膜的形式10。CFDA已被广泛用于监测植物组织中韧皮部的物质运输、源库关系以及维管系统的模式形成11,12。
除了这些标记物外，某些化合物可能直接改变植物的生理状态，以提高作物产量，或在除草剂的情况下杀死植物。杀虫剂和抗菌化合物均可用于提高植物生产力，尤其是在柑橘黄龙病（HLB）存在的条件下。一种用于控制CLas的抗菌分子实例是链霉素。链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，最初从灰色链霉菌（Streptomyces griseus）中分离获得，已被证实可通过抑制蛋白质生物合成来抑制细菌生长13。在杀虫剂方面，HLB研究的主要靶标是柑橘木虱（D. citri），该昆虫可将CLas在植株间传播14。为此，通常使用新烟碱类杀虫剂（如吡虫啉），因其是控制害虫的金标准15。上述各类应用均为当前植物管理策略的重要组成部分，而新型产品的开发则依赖于高效的筛选检测方法。
将化合物导入木本植物的一种方法是直接注入树干。已有多种系统被设计出来，这些系统在是否需要预先钻孔的注射位点方面各不相同，且利用基于压力的注射或被动流动方式16。尽管基于压力的系统能够快速引入特定化合物，但需考虑液体强行通过堵塞或栓塞的维管组织时可能造成的物理损伤17。虽然叶面喷施或浇灌施用化合物的操作耗时较少，但直接植物注射可减少化合物因向空气或土壤流失而造成的浪费，并通过降低与外界环境的接触，延长化合物处于活性状态的时间18。在科研环境中，这两个方面对于保护昂贵的试剂以及确保重复实验之间的一致性至关重要。
本研究介绍了创新的直接植物输注（DPI）装置的设计、构建与应用，该装置可用于评估目标化合物对寄主植物的影响。装置本体及其多个构建组件均使用标准3D打印机制造。这种自主构建方法使研究人员可根据特定实验需求对装置及其组件进行修改，减少对 commercially available 植物注射装置的依赖。该装置设置简便高效，所有辅助组件均易于获取且成本低廉。尽管该系统设计适用于多种植物物种，但本文所展示的示例均针对盆栽柑橘植株。此外，本研究证实，该装置能够高效地将多种类型的化合物系统性地输送至幼年柑橘植株，且不导致植株死亡。所测试的化合物包括用于评估化合物在植株内分布情况的CFDA，以及用于验证其抗菌和杀虫效果在输送后可被观察到的链霉素（streptomycin）和吡虫啉（imidacloprid） 通过 DPI
方案
1. 实验性化合物注射用柑橘植株的制备
- 通过生根的营养枝条扦插或种子繁殖小型盆栽柑橘树。将盆栽柑橘品系置于16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下，于28 °C环境中培养。
- 选择适合实验所需大小的柑橘植株。所述应用要求植株高度在12 cm至100 cm之间，主茎直径为4–14 mm。若实验需要新抽嫩梢，应在实验前对植株进行修剪。
2. DPI 装置及模具组件的三维打印
- 在打印平台上涂抹一层薄薄的聚醋酸乙烯酯基胶水。
- 将尼龙丝材装入3D打印机，并按照制造商的说明准备打印机。导入所需的.STL文件（补充文件1、补充文件2、补充文件3、补充文件4、补充文件5、补充文件6、补充文件7、补充文件8、补充文件9、补充文件10、补充文件11、补充文件12、补充文件13和补充文件14），设置并开始打印。
- 从打印平台上取下打印件。用水冲洗打印部件底部的聚醋酸乙烯酯基胶水，并移除所有支撑结构。
- 对DPI组件喷涂两层透明亮光喷漆。
3. 塑溶胶环形模具的制备
- 使用可拼接的塑料块在基座上构建一个矩形围挡，组装成足够大的模具成型框以容纳图案部件（补充图 S1A）。
- 按10:1的比例混合RTV硅胶单体与催化剂，搅拌1分钟，避免引入气泡。加入食用色素（每25 mL硅胶混合物加3滴）和洗手液（每25 mL硅胶混合物加1 mL）进行着色（补充图 S1B）。
- 将一层薄硅胶倒入模具成型框中，厚度足以完全覆盖底部。轻压以平整表面，并静置24小时使硅胶固化（补充图 S1C）。
- 如上所述，倒入第二层硅胶，深度需足以覆盖图案上的中心孔芯模部分（在补充图 S1D中可见图案顶部的结构）。将图案插入液态硅胶中，确保中心孔芯模部分朝下。注意避免困住气泡，并确保各图案之间充分分离且互不接触（补充图 S1E）。
- 使用重物和/或胶带固定图案，防止其在硅胶固化过程中浮起。静置24小时，使新倒入的硅胶层完全固化（补充图 S1F）。
- 继续倒入额外的硅胶层，直至液面与图案顶部齐平。静置24小时使其完全固化（补充图 S1G）。
- 拆卸可拼接的塑料块以释放模具，取出图案（补充图 S1H）。检查模具是否存在撕裂或变形情况（补充图 S1I）。
4. 塑溶胶环的浇铸
- 用食用油涂抹模具内壁、所有型芯部件以及O形圈（补充图S2A、B）。将一个O形圈套在中心柱型芯中部的凹槽上，并将该型芯放入塑溶胶环模具的中心孔中（补充图S2C）。
- 将给药通道型芯插入塑溶胶环模具侧面的孔中。调整给药通道型芯末端的V形尖端，使其与中心柱型芯上的O形圈对齐（补充图S2D、E）。
- 将塑溶胶放入微波炉中，以每次10秒的短时间加热（补充图S2F、G）。轻轻搅拌塑溶胶以避免产生气泡（补充图S2H）。重复加热和搅拌，直至溶液温度达到160 °C至170 °C之间（补充图S2I）。
警告：过度加热塑溶胶可能释放有毒烟雾。操作应在通风良好的区域或通风橱中进行。切勿将塑溶胶加热至170 °C以上。 - 将熔融的塑溶胶沿模具外边缘倒入塑溶胶环模具中，避免引入气泡（补充图S2J）。静置1小时，使塑溶胶环冷却（补充图S2K）。将环从模具中取出。在用于实验测定前，确保其与DPI装置适配良好（补充图S2L）。
5. 将 DPI 装置连接到植物
- 在树干上选择一个光滑、健康的部位用于安装设备。避免选择有凸起或节瘤的区域，因为这些部位可能导致设备泄漏。
- 使用直径为 2 mm 的钻头，在茎的中心水平钻孔，钻孔方向与树干表面呈 90° 角（补充图 S3A）。将钻头多次穿过孔道，以清理并打磨孔壁，形成通畅无阻的孔洞（补充图 S3B）。
- 在塑溶胶环上，位于化合物输送通道对侧的位置，制作一个垂直切口（补充图 S3C）。将该环套在植株上，并使输送通道与先前钻好的孔对齐（补充图 S3D）。
注意：塑溶胶环必须紧密贴合树干，以防泄漏；可根据不同直径的植株茎秆，使用不同尺寸的核心组件制作相应大小的塑溶胶环。 - 将 DPI 装置安装到塑溶胶环上，确保两者紧密贴合。使 DPI 装置的出口与塑溶胶环的输送通道及已钻好的孔对齐（补充图 S3E）。
注意：使用钻头辅助对齐孔洞与 DPI 装置出口可能有助于操作。 - 用硅胶带紧密缠绕，以固定装置位置（补充图 S3F）。检查已完全组装并安装好的设备，确保其在植株上的对齐状态和方向正确。
6. 使用DPI装置施加目标化合物
- 使用注射器或移液器将感兴趣的溶液注入DPI装置中（补充图S3G）。用注射器刺穿DPI装置另一侧的硅胶带和塑料溶胶环，抽出内部通道中的空气，以避免将气泡引入植物维管系统（补充图S3H）。将抽出的溶液重新注入DPI装置中。
- 在注射器穿刺形成的孔洞上再贴一小块硅胶带，以加固该区域并防止撕裂。检查装置连接处是否有可见泄漏，并检查装置储液区的液面是否稳定。
注意：初始阶段可使用水测试是否存在泄漏，以避免浪费实验溶液。 - 用石蜡封口膜覆盖DPI装置的开口端，向下拉紧以形成密封，减少实验化合物的蒸发。用注射器针头在石蜡膜上刺一个小孔，防止真空形成，随后重新补充装置内的液体（补充图S3I）。
- 每天检查装置，确保各组件正确对齐（补充图S3J），并使用注射器补充液体，防止储液区干涸。重复此操作，直至注入所需量的实验溶液。
注意：通过同一装置可成功递送化合物长达1个月。若需更长时间的溶液吸收，应在实验前通过实证测试验证可行性。
7. 使用CFDA观察柑橘类植物的维管束运动
- 将DPI装置连接到高25 cm的香橼（Citrus medica L.）植株上，向DPI装置施加2.0 mL的处理液，处理液为20% DMSO的H2O对照溶液或CFDA溶液，使其吸收24 h。为执行本方案，配制工作浓度的CFDA溶液：将1.6 mL H2O加入400 µL CFDA储备液中（储备液含10 mM CFDA溶于100%二甲基亚砜[DMSO]），得到终浓度为2 mM CFDA和20% DMSO的溶液。
- 制备植物不同组织的横切面，使用配备包含498 nm波长的荧光滤光片的体视显微镜或复合显微镜观察植物组织中的CFDA。将图像与20% DMSO的H2O对照组进行比较，以校正组织自身的自发荧光。
8. 链霉素处理后测定叶片样品中CLas菌滴度的变化
- 使用0.75 m高的温室种植的感染CLas的 Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia") 植株，采集每株植物上两片表现出HLB症状的叶片的叶柄和中脉，将其切成小段，分别汇集每种组织类型，并单独储存在含有直径为6.35 mm钢珠的2 mL耐冲击样品管中。
- 使用设定为以3.4 m/s进行两次15秒循环的均质器研磨样品。按照先前所述方法提取总核酸19。
- 使用 表1 中定义的qPCR混合液和 表2 中定义的反应条件，对感染CLas的叶片样品进行qPCR检测。选择表现出强CLas感染的植株（通常以CLas 16S LasLong (LL) 引物组的qPCR Ct值 < 30为标准）用于进一步分析。
注意：细菌滴度通过CLas 16S Las Long (LL) 和柑橘脱水素DNA引物进行估算，以获得相对基因组当量，方法如前所述20。 - 对符合上述最低感染滴度标准的柑橘植株安装DPI装置，并一次性施用2.0 mL的H2O溶液或所需浓度的链霉素溶液。为遵循本研究方案，使用单次2.0 mL、浓度为9.5 mg/mL（共19 mg）的链霉素溶于H2O中的处理方式。
- 在处理后第7天、第14天和第28天采集叶片样品。使用上述相同方案检测采样叶片中的CLas滴度。
- 在处理后第60天，拍摄经H2O或链霉素处理的植株照片。通过肉眼观察CLas感染情况评估感染严重程度。若少于 <50% 的叶片表现出脉间黄化和叶脉木栓化，并伴有新梢生长，则视为轻度感染；若超过50%的叶片出现脉间黄化和叶脉木栓化，并伴有叶片脱落和植株生长受阻，则视为更严重的感染。
9. 噻虫嗪处理后测定 D. citri的死亡率
- 将高约0.5米的香橼（Citrus medica L.）植株修剪至12厘米高，以促进新梢的生长。
注意：新梢生长速度可能受植株健康状况和季节的影响；因此，在实验设计时应考虑这些因素。 - 当植株上出现>6个长度为1-2厘米的新梢后，将植株放入含有成虫D. citri的笼中。让植株在笼中停留24小时，以允许成虫产卵。
- 在产卵后1-2天内，对三个新梢进行代表性卵量计数，随后安装DPI装置。向装置中加入2.0 mL的清水对照或所需浓度的吡虫啉溶液（有效成分为21.8%）。按照本方案，使用528 µL/L、52.8 µL/L和5.28 µL/L的吡虫啉浓度。
注意：卵量计数为破坏性测量，因此此阶段的计数用于估算同一植株其他未计数新梢上的卵数，并为实验结束时进行的若虫孵化数量统计提供基线数据。 - 收集至少三个剩余新梢上的D. citri羽化率。在施加化合物7天后，拍摄具有代表性的植株照片。
结果
直接输注装置组件
直接输注装置的基础版本高 8 cm，正面和侧面宽 3.3 cm（图 1A）。该装置包含一个与出液口相连的中央储液腔，这些部件可容纳的总体积为 2.0 mL（图 1D）。塑溶胶环高 1.8 cm，直径为 2.7 cm（图 1C）。该环上还设有两个通道：一个用于容纳 DPI 装置的出液口，另一个直径可变的通道则环绕待处理树木的树干。此外，在垂直通道周围设有一条凹槽，用于引导多余的处理液流环绕树干，从而促进化合物通过树皮进一步吸收（图 1F）。正确组装后，塑溶胶环应紧贴 DPI 装置，且出液口应对准在树干上钻出的孔洞（图 1B 和 图 1E）。
CFDA
为研究干粉吸入器（DPI）装置将外源化学物质导入柑橘植株的有效性，使用该装置渗透了2.0 mL的2 mM CFDA溶液。在处理过的植株维管组织中检测到荧光信号（图2A），而在用含20% DMSO的H2O处理的对照植株中则未检测到该信号（图2B）。该荧光信号在所有解剖的植物组织类型中均被观察到，包括叶片叶肉、叶柄维管组织、茎部维管组织和根部维管组织（图2C）。该信号在处理后24小时内即可在植株中观察到，并相对均匀地分布于各组织中。
链霉素
为了检测所引入的化合物是否对HLB病具有治疗效果，将2.0 mL杀菌化合物链霉素以9.5 mg/mL的浓度（总量为19 mg）注入CLas阳性的 Valencia（Citrus sinensis）甜橙植株中。这些植株在温室盆栽中培养，并通过qPCR随时间监测CLas滴度（以每柑橘基因组当量中的CLas基因组当量数表示）（图3A）。经链霉素处理和H2O处理的植株初始平均DNA CLas滴度分别为0.562 CLas基因组/柑橘基因组和0.49 CLas基因组/柑橘基因组。与同时期H2O对照组相比，在链霉素处理后的7至28天内，qPCR检测到平均细菌滴度有所降低。此外，链霉素处理植株和H2O处理植株在时间0与第28天之间的平均细菌滴度差值分别为0.314和0.117。
本实验旨在测量植物在不同时间段内对不同处理的响应。采用双因素二次响应面设计，其中时间作为具有四个水平（0天、7天、14天和28天）的定量离散因子，处理方式作为具有两个水平（H2O和链霉素）的分类因子。每种八种处理组合均设置五个重复，以CLas滴度作为响应变量进行测量。根据Box-Cox图分析，数据经log10转换后进行分析。采用赤池信息准则（AICc）21通过向前选择法进行模型简化，结果剔除了时间和交互作用效应。剩余因子“处理”具有显著性（p = 0.0252），在所有时间点合并分析中，经链霉素处理的植株其平均CLas滴度（0.349）低于经H2O处理的植株（0.496）（图3B）。CLas滴度的降低对应于链霉素处理植株在60天后偶尔出现新的健康梢生长，这一点由经H2O处理的代表性植株照片（图3C）与经19 mg链霉素处理的植株照片（图3D）对比得以证实。
吡虫啉
使用 DPI 装置将吡虫啉引入受幼年亚洲柑橘木虱（ACP）侵染的香橼植株，以测试其作为D. citri杀虫筛选实验的潜力。采用一种市售吡虫啉杀虫剂溶液，以三种不同浓度（5.28 µL/L、52.8 µL/L 和 528 µL/L）进行单次 2.0 mL 处理，并设置清水对照组。处理前每三根嫩梢上的平均总卵数在 280.5 至 321 之间，各处理组所用植株间无显著差异（图 4A）。处理后 7 天，三根嫩梢上的平均存活若虫数分别为：清水对照组 293.75，5.28 µL/L、52.8 µL/L 和 528 µL/L 吡虫啉溶液处理组分别为 268、97.5 和 2（图 4B）。根据单因素方差分析（one-way ANOVA）及 Tukey 事后检验，与清水对照组相比，52.8 µL/L（p = 0.029）和 528 µL/L（p = 0.002）吡虫啉溶液处理显著降低了木虱若虫的出现数量。此外，在最高浓度的吡虫啉溶液处理下，木虱若虫死亡率的升高在视觉上也表现为吡虫啉处理组嫩梢上若虫蜜露分泌量明显减少（图 4D），而清水对照组蜜露分泌仍较多（图 4C）。
图1：直接植物输注装置与塑溶胶环。（A）完整的直接植物输注装置及其尺寸，（C）塑溶胶环及其尺寸。（B）连接并固定在柑橘树上的直接植物输注装置与塑溶胶环。垂直截面图分别为（D）直接植物输注装置，（F）塑溶胶环，以及（E）这两个组件连接后固定在柑橘树上的状态。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：25 cm柑橘植株叶片中脉的横切面。 使用直接植物输注装置处理24小时后的图像，分别显示了使用（A）2 mM CFDA 或（B）H2O 中 20% DMSO 处理的结果。（C）2 mM CFDA 处理24小时后不同植物组织的横切面，包括直接植物输注装置上方5 cm处的茎干（左上）、直接植物输注装置下方5 cm处的茎干（中左）、根部（左下）、叶片中脉（右上）、叶柄（中右）以及叶肉组织（右下）。比例尺 = 1 mm。缩写：CFDA = 5,6-羧基荧光素二乙酸酯；DMSO = 二甲基亚砜。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：利用qPCR随时间监测CLas滴度（以每柑橘基因组当量中的CLas基因组当量数表示）。（A）时间进程显示了接受19 mg链霉素处理的五株植株与接受H2O对照处理的五株植株之间CLas DNA滴度的变化。各数据点表示特定时间点下特定处理的平均值，误差条表示平均值的标准误。（B）柱状图显示了在所有时间点下H2O处理组与链霉素处理组植株的平均CLas滴度。误差条表示95%置信区间，星号表示经单因素方差分析（one-way ANOVA）检验，链霉素处理组与H2O处理组之间平均CLas滴度存在显著差异（* = p < 0.05）。（C）直接对植株进行灌注处理后0个月和2个月时的代表性柑橘植株图像，分别为（C）H2O处理组和（D）链霉素处理组。经链霉素处理的植株在2个月后表现出新的浅绿色嫩叶生长，提示CLas滴度可能降低。缩写：CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus。请点击此处查看该图的高清版本。
图 4：监测幼年柑橘木虱侵染的香橼植株中木虱若虫的死亡率。 柱状图显示了在使用清水对照和不同浓度吡虫啉处理7天后，（A）初始卵数量的估计值和（B）三种柑橘嫩梢上存活的D. citri若虫数量。误差线表示平均值的标准误，星号表示经单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey事后检验后，各处理组与清水对照组之间的显著差异（* = p < 0.05，** = p < 0.01）。使用直接植株灌注装置处理7天后，柑橘嫩梢上D. citri若虫侵染情况的照片：（C）清水对照组或（D）528 µL/L 吡虫啉处理组。缩写：ACP = 亚洲柑橘木虱；D. citri = Diaphorina citri Kuwayama。请点击此处查看此图的放大版本。
| 每样本体积（µL） | 组分 | |||||
| 12.5 | 2x GoTaq qPCR 预混液（含 BRYT Green 染料） | |||||
| 5 | DNA 模板（20 ng/µL） | |||||
| 0.5 | CLas 基因的 10 µM 正向与反向引物 | CLas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG（正向）； TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA（反向） | ||||
| 0.5 | 柑橘看家基因的 10 µM 正向与反向引物 | 柑橘脱水素基因（Citrus dehydrin）：TGAGTACGAGCCGAGTGTTG（正向）； AAAACTTCACCGATCCACCAG（反向） | ||||
| 6.5 | H2O | |||||
表1：用于定量链霉素处理的柑橘系中CLas菌滴度的qPCR反应体系。 显示了用于CLas DNA定量和柑橘DNA定量的16S Las Long引物及柑橘脱水素引物的序列。
| 步骤 | 温度 (°C) | 时间 | |
| 1 | 初始变性 | 95 | 2 min |
| 2 | 变性 | 95 | 15 s |
| 3 | 退火 | 60 | 20 s |
| 4 | 延伸 | 72 | 20 s |
| 5 | 返回步骤 2，重复 39 次 | ||
| 6 | 熔解曲线 | 60 升至 95，升温速率 0.2 °C/s | 3 min |
表2：用于定量链霉素处理的柑橘系中亚洲韧皮杆菌（CLas）滴度的qPCR反应条件。
补充图 S1：展示用于制备塑溶胶环模具的组装过程的图像。（A）使用可卡扣连接的塑料块构建塑溶胶环模具的第一层。（B）均匀混合的溶液，包含室温硫化（RTV）硅橡胶、催化剂、食用色素和肥皂。（C）将第一层均匀倒入塑溶胶环模具中。（D）带有中心定位芯模（位于顶部）的塑溶胶环图案图示。（E）将塑溶胶环图案插入未固化的模具第二层中。（F）使用美纹纸胶带和橡胶锤固定图案，使第二层固化。（G）添加模具的第三层，直至其表面与图案顶部齐平。（H）从模具中取出图案。（I）完全组装好的塑溶胶环模具。请点击此处下载该文件。
补充图 S2：显示与直接植物输注装置相关的塑溶胶环组装过程的图像。 （A）塑溶胶环的组装部件，包括模具、带O形圈的中心芯以及输送通道芯。（B）在芯部喷涂不粘烹饪油，以利于塑溶胶环硬化后脱模。（C）将中心芯和O形圈插入模具中。（D）将输送通道芯垂直插入中心芯。（E）塑溶胶环芯部组件在模具型腔内的正确组装状态。（F）用于制备塑溶胶环的塑溶胶材料。（G）在微波炉中加热塑溶胶。（H）加热后搅拌塑溶胶。（I）检测塑溶胶的温度。（J）将加热后的塑溶胶倒入已组装好的芯部结构中。（K）使塑溶胶在组装芯周围冷却固化。（L）已完全组装并连接至直接植物输注装置的塑溶胶环。请点击此处下载该文件。
补充图 S3：直接植物输注装置组装过程的示意图。（A）在柑橘植株中心钻孔，以形成化合物输送通道。（B）钻孔的正面视图。（C）用剃刀片在塑溶胶环上沿与化合物输送通道相对的一侧进行切开。（D）将塑溶胶环紧密地套在茎部已钻孔的位置。（E）将直接植物输注装置安装到塑溶胶环上，使装置上的化合物输送出口插入塑溶胶环的通道中。（F）使用硅胶带将直接植物输注装置固定在塑溶胶环上，并确保整个装置稳固。（G）向直接植物输注装置的腔室中加入目标化合物。（H）使用注射器从植物钻孔中抽出空气，以启动化合物的流动。（I）在直接植物输注装置腔室的开口处覆盖封蜡膜，并刺一个小孔以防止形成真空。（J）已完全组装好的直接植物输注装置安装在柑橘植株上的最终状态。请点击此处下载该文件。
补充文件 1：适用于 4 mm 树的塑料溶胶环中心柱芯 .STL 文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 2：适用于 6 mm 树的 plastisol 环中心柱芯 .STL 文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 3：适用于 8 mm 树的塑料溶胶环中心柱芯 .STL 文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 4：适用于 10 mm 树的塑料溶胶环中心柱芯 .STL 文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 5：适用于 12 mm 树的塑料溶胶环中心柱芯 .STL 文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件6：适用于14 mm树形结构的塑料溶胶环中心柱芯.STL文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 7：适用于 4 mm 树形结构的 plastisol 环输送通道核心 .STL 文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 8：适用于 6 mm 树形结构的 plastisol 环输送通道核心 .STL 文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 9：适用于 8 mm 树形结构的 plastisol 环输送通道核心 .STL 文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 10：适用于 10 mm 树的 plastisol 环输送通道核心 .STL 文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 11：适用于 12 mm 树形结构的 plastisol 环递送通道核心 .STL 文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 12：适用于 14 mm 树形结构的 plastisol 环输送通道核心 .STL 文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件13：直接植物灌注装置的.STL文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件14：用于制作塑溶胶环模具的.STL文件图案。 请点击此处下载该文件。
讨论
为了使DPI装置被视为一种向植物体内递送外源化合物的可行方法，该装置必须能够促进化合物在多种组织类型中实现高效且稳定的吸收。利用CFDA进行的实验明确显示了化合物既存在向顶运输，也存在向基运输，并且在叶片的维管系统和叶肉细胞中均有分布。此外，可能由于本DPI装置所钻孔洞为化合物吸收提供了较大的表面积，CFDA在茎部各节段中的分布相对均匀，而不仅局限于紧邻装置的少数维管组织区域——这与以往通过树干注射进行染料吸收研究中观察到的结果不同6。此外，还利用DPI装置测试了绿色荧光蛋白和花青染料的递送效果，观察到这些化合物的分布模式与CFDA相似（数据未显示）。这些结果表明，该装置可用于系统性递送多种在分子大小和结构上各不相同的化合物。然而值得注意的是，化合物的吸收量会因叶片发育阶段的不同而存在差异，幼嫩生长期的叶片吸收的化合物多于成熟的老叶。这可能是由于“库”组织与“源”组织中维管系统特性的差异所致，针对具体实验应对此参数进行优化。
DPI装置显示出足够的化合物吸收量，足以实现CFDA、GFP和花青染料的可视化，并且吸收量也足以分别表现出链霉素和吡虫啉的抗菌和杀虫效果。这两种化合物在单次2.0 mL处理后1周内均导致靶标生物存活率发生变化。这些数据表明，DPI装置可用于全株植物实验，以评估多种化合物在控制微生物和昆虫害虫方面的可行性。此外，由于该装置直接接触植物维管系统，可能为测试那些不能被根部或表皮细胞有效吸收的化合物提供了机会。其中特别值得关注的是RNA干扰（RNAi），该技术可用于调控寄主植物、病原体或病原体媒介体内的基因表达。先前研究通过在苹果和葡萄植株茎干上钻孔导入发夹RNA，结果显示RNA分子局限于木质部组织，提示这些分子可能仅对咀嚼式口器及取食木质部汁液的生物有效22。鉴于DPI装置采用类似的钻孔递送系统，可以合理推测，使用该装置递送的发夹RNA也可能局限于木质部组织。然而，DPI装置施用链霉素后，观察到韧皮部限制性病原体CLas的滴度显著下降，强烈表明该抗生素已进入韧皮部。因此，通过DPI装置递送的化合物在维管系统中的分布可能取决于其分子大小和化学性质，每种分子均应单独评估。
尽管市面上已有多种商用干粉吸入器（DPI）设备，但本文所述装置可由实验室自行制备且具备可修改性。因此，可根据所用植物种类和实验设计对装置进行改进或调整尺寸，而不依赖于商业产品。此外，该装置可半永久性地固定在植物上，使得对同一植株可连续施加多种处理或重复施加同一化合物，而无需通过多次注射造成反复损伤。需注意的是，若安装不当，该装置可能发生泄漏，导致化合物逸散至环境中而无法有效递送至植物体内。因此，在装置安装时及安装后最初几天内，应仔细检查是否存在泄漏迹象。虽然在树木上钻孔可能对植物具有潜在伤害性，但本方法旨在确保化合物稳定且一致地被吸收。此外，在本实验中，未观察到DPI装置的安装对植物健康产生任何不良影响。然而，实验设计中仍应额外准备若干植株，以替换在实验过程中可能出现生长衰退的个体。最后，由于该装置依赖被动流动来递送化合物，因此在不同植物物种之间或同一物种的不同发育阶段中，化合物吸收速率可能难以预测。若化合物吸收速度是实验中的限制因素，则可能增加实验复杂性。为获得最佳结果，实验应预留充足时间，确保植物完全吸收2.5 mL的化合物溶液，该过程可能需要长达1周时间。综上所述，该DPI装置是一种用于快速评估 在植株中 抗微生物或杀虫化合物对CLas及其传播媒介的活性 D. citri从而比之前所述的离体叶片检测方法提供更多关于系统性效果及其对植物生长表现影响的信息23毫无疑问，该系统的应用范围远超本研究中描述的具体用途。
披露
作者无利益冲突。本出版物中使用商号、公司或企业名称仅为方便读者获取信息。此类使用并不构成美国农业部或农业研究局对任何产品或服务的官方认可或批准，也不排除其他可能适用的产品或服务。美国农业部（USDA）在其所有计划和活动中禁止基于种族、肤色、民族起源、年龄、残疾，以及在适用情况下基于性别、婚姻状况、家庭状况、父母身份、宗教、性取向、遗传信息、政治信仰、报复行为，或个人全部或部分收入来源于公共援助计划而产生的歧视。并非所有禁止的歧视依据均适用于所有项目。残疾人士如需以替代方式获取项目信息（盲文、大字印刷、录音带等），应联系美国农业部TARGET中心，电话：(202) 720-2600（语音和TDD）。如需投诉歧视行为，请致信美国农业部民权办公室主任，地址：华盛顿特区西南独立大道1400号，邮编20250-9410，或拨打(800) 795-3272（语音）或(202) 720-6382（TDD）。美国农业部为平等机会提供者和雇主。
致谢
作者感谢 Mant Acon 提供本研究中使用的植物。本研究由美国农业部（USDA）CRIS 项目 8062-22410-007-000-D 和美国农业部 NIFA 资助项目 2020-70029-33176 提供资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 cm 直径钢球 | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
| 10 mL 鲁尔锁注射器 | Becton Dickinson | 382903029952 | |
| 20 G 1 注射器针头 | Becton Dickinson | 305175 | |
| 2 mL 螺旋盖管 | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 3/32 英寸黑色氧化钻头 | Sears | 964077 | |
| 3D 打印机 | Markforged | F-PR-2027 | |
| 3D 打印软件 | Markforged | F-SW-FDVX | |
| 3D 打印软件 | Markforged | S-FW-OEVX | |
| 5(6)-CFDA（5-(和-6)-羧基荧光素二乙酸酯） | Invitrogen | C195 | |
| 5/64 英寸黑色氧化钻头 | Sears | 964502 | |
| 96 孔 qPCR 仪 | Roche | 5815916001 | |
| 离心机 | Eppendorf | 22621408 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | SP-BX43-BI | |
| 荧光显微镜滤光片 | Chroma | 69401-ET | |
| 亮光清漆喷雾 | Rustoleum | 249117 | |
| 灰色乐高底板 | Lego | 11024 | |
| 手持无线电钻 | Makita | 6349D | |
| 匀浆器 | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
| 吡虫啉 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
| 中等硬度液体塑溶胶 | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
| 红色硅胶 70 Shore A 型 O 形圈 | Grainger | Varies by Size | |
| 不粘烹饪喷雾 | PAM | 64144030217 | |
| NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
| Parafilm 封口膜 | Bemis | HS234526A | |
| 聚醋酸乙烯基胶水 | Elmers | E301 | |
| qPCR 预混液 | Promega | A6001 | |
| qPCR 引物 | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
| 逆转录酶 | Promega | A5003 | |
| 单刃剃须刀片 | Garvey | 40475 | |
| 半透明硅酮 RTV 橡胶 | Aero Marine Products | AM 115T | |
| 透明硅胶带 | Maxwell | KE30S | |
| 截短型 Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
| 白色 1 x 6 乐高积木 | Lego | 300901 | |
| 白色尼龙 | Markforged | F-MF-0003 |
参考文献
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