本研究提供了一种改良方案，用于从鼠类炎症性关节炎组织中分离滑膜巨噬细胞和成纤维细胞。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
类风湿关节炎是一种导致关节慢性炎症的自身免疫性疾病。滑膜巨噬细胞和滑膜成纤维细胞在类风湿关节炎的发病机制中起核心作用。了解这两类细胞群体的功能，对于揭示炎症性关节炎病理进展与缓解的机制至关重要。通常情况下， 体外 实验条件应模拟 体内 尽可能接近体内环境。在表征关节炎中滑膜成纤维细胞的实验中，已使用来源于原代组织的细胞。相比之下，在研究炎症性关节炎中巨噬细胞生物学功能的实验中，则常使用细胞系、骨髓来源巨噬细胞以及外周血单核细胞来源巨噬细胞。然而，目前尚不清楚这些巨噬细胞是否能够真实反映组织驻留型巨噬细胞的功能。为了获取驻留型巨噬细胞，本研究对既往实验方案进行了改进，以从炎症性关节炎小鼠模型的滑膜组织中分离并扩增原代巨噬细胞和成纤维细胞。这些原代滑膜细胞可能对 体外 炎症性关节炎分析
引言
类风湿关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，其特征是滑膜增生，导致关节破坏1,2。在健康的滑膜中，存在组织驻留的巨噬细胞和成纤维细胞，以维持关节的稳态。在RA患者中，滑膜成纤维细胞（SFs）发生增殖，且包括单核细胞在内的免疫细胞浸润至滑膜和关节液中，这些过程与炎症相关1,3,4。滑膜巨噬细胞（SMs），包括驻留巨噬细胞和外周血单核细胞来源的巨噬细胞，以及SFs均出现异常活化，并在RA的发病机制中发挥重要作用。近期研究表明，SMs与SFs之间的细胞间相互作用参与了RA的加重与缓解过程5,6。
为了理解类风湿关节炎（RA）的发病机制，已采用多种啮齿类动物炎症性关节炎模型，包括K/BxN血清转移性关节炎、胶原诱导性关节炎和胶原抗体诱导性关节炎。通常需要基于细胞的实验来阐明关节炎中的分子功能。因此，研究人员已从关节炎动物模型中分离出原代细胞。从小鼠关节炎组织中分离滑膜成纤维细胞（SFs）的方法已较为成熟，这些细胞有助于揭示关节炎发病过程中的分子机制7,8另一方面，骨髓来源的巨噬细胞、外周血单核细胞来源的巨噬细胞以及巨噬细胞系常被用作关节炎研究中的巨噬细胞来源9,10由于巨噬细胞可获得与其微环境相关的功能，因此通常来源的巨噬细胞可能缺乏针对关节炎组织的特异性反应。此外，由于小鼠滑膜即使在关节炎模型中也仅为极小的组织，通过分选获取足够数量的滑膜细胞十分困难。滑膜巨噬细胞应用受限的问题在于 体外 在关节炎研究中，相关研究一直存在局限性。建立一种用于分离和扩增滑膜巨噬细胞的实验方案，将有助于阐明类风湿关节炎（RA）的病理机制。
在先前分离滑膜成纤维细胞（SFs）的方法中，滑膜巨噬细胞（SMs）被弃去7。此外，已有报道提出一种从某些器官中分离并扩增组织驻留巨噬细胞的方法11。因此，本研究结合并改进了现有方案。该改进旨在实现高纯度的SMs和SFs原代培养。本方法的总体目标是从小鼠关节炎组织中分离并扩增SMs和SFs。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
涉及动物的实验已获得爱媛大学动物实验委员会的批准，并严格按照爱媛大学动物实验指南（37A1-1*16）进行。
1. 仪器、试剂与培养基的准备
- 按如下方法准备培养基：在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素-抗真菌溶液（anti-anti）。
- 按如下方法准备消化液：在培养基中添加 1 mg/mL IV 型胶原酶。使用前调整胶原酶浓度。
- 用 1 mM 盐酸溶液将 I-C 型胶原稀释至 0.15 mg/mL 的浓度。将稀释后的胶原溶液加入培养皿（直径为 40 或 60 mm）中，使其完全覆盖皿底。室温孵育 6–12 小时后，吸出胶原溶液，并在室温下干燥。胶原包被的培养皿可在室温下保存至少 1 周。使用前用磷酸盐缓冲液（PBS）或培养基洗涤预包被的培养皿。
- 准备无菌手术器械，如剪刀、带锯齿尖端的镊子和尖头镊子。使用前用 70% 乙醇浸泡。
2. 小鼠滑膜炎组织的制备（图1A）
- 准备一只后肢足爪患有炎症性关节炎的小鼠。
注意：本实验方案使用7-8周龄、体重18-20 g的雌性C57BL/6小鼠，诱导胶原抗体诱导性关节炎（CAIA）或K/BxN血清转移性关节炎（STA）。8从非肿胀组织（即健康组织）中分离肥大细胞可能较为困难，因为细胞数量不足。 - 通过腹腔注射 80 mg/kg 氯胺酮和 16 mg/kg 赛拉嗪对小鼠进行麻醉。使用 70% 乙醇清洁小鼠。
- 用剪刀剪开胸部区域以暴露心脏。用剪刀剪开心脏的右心耳，然后将一根23 G蝶形针插入左心室。 通过 心脏心尖部，随后使用注射器回注15–20 mL无菌PBS，以手动方式清除外周血（约1 mL/2秒）。
- 使用剪刀剪开后肢足部的皮肤，并用带锯齿尖端的镊子撕除皮肤。
注意：此步骤之后，建议使用镊子操作样品。切勿用手接触去壳组织，以避免小鼠毛发附着。 - 通过牵拉使跖趾关节脱位，随后用剪刀剪断关节韧带以去除脚趾。
- 用剪刀在踝关节附近切断小腿肌肉的肌腱。用镊子夹住肌腱，从远端向近端剥离小腿肌肉，暴露胫骨。去除腓骨。
- 通过牵拉使膝关节脱位，随后用剪刀切断关节韧带，分离带有肿胀后足的胫骨。将样本置于冰浴的培养基中（0.3 mL/cm）2) 直至进行步骤 3.1 前处理。
3. 滑膜炎组织的消化（图 1B）
- 吸弃培养基，注意避免触碰样本，然后加入新鲜的培养基（0.3 mL/cm2）。重复洗涤过程三至四次。
注意：从本步骤开始，样本操作应在超净台或安全柜中无菌进行。 - 在体视显微镜（10x–20x 放大倍数）下，使用尖头镊子在培养基中轻轻牵拉，使样本的所有关节脱位。此步骤中使用尖头镊子较为方便。去除胫骨以及尽可能多的血管、肌腱和韧带。脱位时注意不要折断骨骼。
- 为每个样本准备两个 15 mL 离心管。用镊子将脱位后的带软组织骨骼转移至第一个 15 mL 管中。向管中加入 4 mL 消化液（来自双侧后足的样本）。
- 为收集残留细胞和组织碎片，将样本所处的培养基转移至第二个 15 mL 管中。在室温下以 500 x g 离心 5 分钟。弃去上清液后，用 1 mL 消化液重悬沉淀，并将细胞与组织碎片悬液转移至第一个含有大部分组织的 15 mL 管中（双侧后足共 5 mL 消化液）。
- 在 37 °C 条件下，将样本置于杂交炉中振荡消化 60–120 分钟。
注意：应根据实际情况确定最佳消化时间。消化时间取决于踝关节肿胀程度和所用胶原酶的活性。大多数情况下，60–120 分钟已足够。孵育 60 分钟后，用移液器吸取部分消化液，显微镜下观察。若消化不充分，应继续孵育，并每 30 分钟检查一次消化情况。 - 充分吹打混匀溶液。将细胞悬液经细胞滤器（孔径 40 µm）过滤至 50 mL 管中。
- 通过细胞滤器向 50 mL 管中加入 10 mL 培养基。在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液后，用 10 mL 培养基重悬沉淀，重复离心操作。再次弃去上清液后，用 2 mL 培养基重悬沉淀。
图 1：小鼠关节炎组织取样及胶原酶消化流程。（A）(i) 患有炎症性关节炎的小鼠后足。 (ii) 去除后足皮肤。 (iii) 跖趾关节脱位并切除脚趾。 (iv) 切断踝部肌腱。 (v) 去除小腿肌肉组织。 (vi) 膝关节脱位。（B）左侧：置于培养基中的离体腿部组织；右侧：置于培养基中的脱位跗骨和跖骨。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 滑膜成纤维细胞的分离（图2A）
- 将从双侧踝关节获得的所有细胞悬液接种于胶原包被的培养皿中。
注意：若使用轻度或中度肿胀的踝关节获取细胞，可采用直径为40 mm的培养皿。若双侧踝关节均出现重度肿胀，则可将胶原包被培养皿的尺寸调整为直径60 mm。 - 加入培养基（约222 µL/cm2），在37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育1小时。
- 用移液器收集未贴壁的细胞（用于步骤5.1）。用培养基洗涤胶原包被的培养皿，并收集洗涤液。将贴壁细胞在新鲜培养基中继续培养（图2B，i）。大多数快速贴附于胶原包被培养皿的细胞呈现成纤维细胞样（纺锤形）形态。
- 使用含0.05%胰蛋白酶的Hanks平衡盐溶液（HBSS）对未完全融合的细胞进行传代。该方法即使在初始扩增阶段也能有效限制其他类型细胞的污染。若需要更高纯度的成纤维细胞样细胞，可通过重复传代以提高纯度；但在此过程中也可观察到细胞在贴附时胞质伸展的现象（图2B，ii）。由于过多的传代次数会影响细胞原始特性的保持，建议使用传代次数少于5次的细胞。
5. 滑膜巨噬细胞的分离（图2A）
- 将步骤4.4中获得的全部非贴壁细胞接种至未包被胶原蛋白的培养皿（直径40或60 mm）中。
注：非贴壁细胞包括巨噬细胞、其他淋巴细胞以及滑膜炎组织中残留的成纤维细胞。 - 在37 °C、含5% CO2的湿润环境中，将混合细胞培养1天。
- 为去除非贴壁淋巴细胞，吸除培养液后加入新鲜培养基。重复此操作两到三次（图2B，iii）。
- 将贴壁的混合细胞在培养基中继续培养1-2周，每2天更换一次培养液，并维持细胞融合度（图2B，iv）。
注：在与滑膜成纤维细胞共培养的条件下，滑膜巨噬细胞（SMs）的数量缓慢增加。因此，共培养时间应根据需要进行调整。 - 用PBS或HBSS洗涤两次。加入含0.05%胰蛋白酶的HBSS溶液（约55 µL/cm2），在37 °C、含5% CO2的湿润环境中处理3分钟。成纤维细胞经胰蛋白酶处理后易于从培养皿脱落，而巨噬细胞对胰蛋白酶处理具有抗性。利用这一特性进行滑膜巨噬细胞的筛选。
- 向含0.05%胰蛋白酶的HBSS中轻柔加入培养基（约222 µL/cm2）。此步骤后，切勿将培养基直接倾倒于细胞表面。
- 为去除已脱落的细胞，吸除培养液后轻柔加入新鲜培养基。重复此过程两到三次。将残留的细胞保留在培养皿中，置于新鲜培养基中备用（图2B，v）。
注：经胰蛋白酶处理后，贴壁细胞呈现巨噬细胞样形态学特征。
图 2：从炎症性关节炎组织中分离富含巨噬细胞和富含成纤维细胞的组分。（A）从关节炎组织中分离富含巨噬细胞和富含成纤维细胞的步骤示意图。（B）分离步骤各阶段的代表性相差显微图像，对应于图 2A中的（i）至（v）。比例尺为 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
7至8周龄的雌性C57BL/6小鼠接受胶原抗体诱导的关节炎处理。根据上述方法（图2A、B），分别从炎症性关节炎组织中独立分离出巨噬细胞样细胞和成纤维细胞样细胞。巨噬细胞样细胞在完成步骤5.7后立即使用。成纤维细胞样细胞在步骤4.4后首先培养至亚汇合状态，然后传代至新的培养皿中再进行使用。为评估SMs和SFs是否成功分离，进行了以下实验。
为评估分离细胞的纯度，通过RT-qPCR分析了多种细胞标志物的mRNA表达水平。Cd68、Emr1、Itgam和Csf1r用作泛巨噬细胞标志物，Cdh11、Col6a1、Csf1和Vcam1用作滑膜成纤维细胞（SF）标志物。Rplp0作为参考基因6,8。所有标志物基因的表达均以
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方法改进了以往从鼠类关节炎组织中分离滑膜成纤维细胞以及从多种器官中分离常驻巨噬细胞的技术7,11该改良方法能够从炎性滑膜组织中分离出高纯度的巨噬细胞和成纤维细胞，操作简便且可重复。由于该方法无需流式细胞分选仪等复杂设备，任何研究人员均可实施。此外，本技术避免了其他分选方法（如荧光激活细胞分选FACS和磁激活细胞分选MACS）可能带来的问题，例如抗体处理以及分选过程中的物理作用可能导致细胞损伤和应激反应12,13所得细胞可用于研究，所受不必要的外界刺激相对较少。此前， 体外 滑膜组织驻留巨噬细胞的分析一直较为困难，因为即使在小鼠关节炎条件下，分离获得的细胞数量也较少。本方法通过将滑膜巨噬细胞（SMs）与滑膜成纤维细胞（SFs）共培养实现其扩增，类似于此前用于肝脏、脾脏、肺和脑来源巨噬细胞的培养方法。11此外，qPCR结果表明，仅需一次SF传...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
作者感谢爱媛大学医学研究支援部、先进研究支援中心（ADRES）以及蛋白质科学中心（PROS）整合生理病理学部的工作人员提供的技术支持和帮助。本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）科研费资助项目JP17K17929、JP19K16015、JP21K05974（授予NS）以及JP23689066、JP15H04961、JP15K15552、JP17K19728、JP19H03786（授予YI）的资助；还获得了难治性疾病大阪医学研究基金会、中富基金会、日本骨与矿物研究学会（JSBMR）新星奖、住友财团、先导医学研究基金会、持田纪念药学基金会（授予NS）的资助；以及武田科学基金会医学研究资助、UCB日本公司（UCBJ）项目资助和日本骨与矿物研究学会 2019年度前沿科学家奖（授予YI）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5.0 g/L 胰蛋白酶/5.3 mmol/L EDTA 溶液 | nacalai tesque | 35556-44 | 用 HBSS 稀释 |
| 抗生素–抗真菌剂（anti/anti） | Gibco | 15240-062 | |
| 蝶形针 | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| 细胞筛 | Falcon | 352340 | 40 µm 孔径，尼龙材质 |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | I 型胶原蛋白 C 型 |
| 离心管 15 | TPP | 91014 | 15 mL 管 |
| 离心管 50 | TPP | 91050 | 50 mL 管 |
| 来自 C. histolyticum 的胶原酶 | Sigma | C5138 | IV 型胶原酶 |
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基 GlutaMax（DMEM） | Gibco | 10569-010 | |
| 胎牛血清（FBS） | SIGAM | 173012 | 已进行热灭活处理 |
| Hanks' 平衡盐溶液（HBSS） | Wako | 085-09355 | |
| 剪刀 | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| 组织培养皿 40 | TPP | 93040 | 用于细胞培养 |
| 组织培养皿 60 | TPP | 92006 | 用于细胞培养 |
| 镊子 | KFI | 1-9749-31 | 尖头型 |
| 镊子 | Bio Research Center | PRI28-1522 | 锯齿尖端 |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | 体视显微镜 |
参考文献
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188(2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083(2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34(2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618(2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
