本研究提供了一种改良方案，用于从鼠类炎症性关节炎组织中分离滑膜巨噬细胞和成纤维细胞。
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摘要
摘要
类风湿关节炎是一种导致关节慢性炎症的自身免疫性疾病。滑膜巨噬细胞和滑膜成纤维细胞在类风湿关节炎的发病机制中起核心作用。了解这两类细胞群体的功能，对于揭示炎症性关节炎病理进展与缓解的机制至关重要。通常情况下， 体外 实验条件应模拟 体内 尽可能接近体内环境。在表征关节炎中滑膜成纤维细胞的实验中，已使用来源于原代组织的细胞。相比之下，在研究炎症性关节炎中巨噬细胞生物学功能的实验中，则常使用细胞系、骨髓来源巨噬细胞以及外周血单核细胞来源巨噬细胞。然而，目前尚不清楚这些巨噬细胞是否能够真实反映组织驻留型巨噬细胞的功能。为了获取驻留型巨噬细胞，本研究对既往实验方案进行了改进，以从炎症性关节炎小鼠模型的滑膜组织中分离并扩增原代巨噬细胞和成纤维细胞。这些原代滑膜细胞可能对 体外 炎症性关节炎分析
引言
类风湿关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，其特征是滑膜增生，导致关节破坏1,2。在健康的滑膜中，存在组织驻留的巨噬细胞和成纤维细胞，以维持关节的稳态。在RA患者中，滑膜成纤维细胞（SFs）发生增殖，且包括单核细胞在内的免疫细胞浸润至滑膜和关节液中，这些过程与炎症相关1,3,4。滑膜巨噬细胞（SMs），包括驻留巨噬细胞和外周血单核细胞来源的巨噬细胞，以及SFs均出现异常活化，并在RA的发病机制中发挥重要作用。近期研究表明，SMs与SFs之间的细胞间相互作用参与了RA的加重与缓解过程5,6。
为了理解类风湿关节炎（RA）的发病机制，已采用多种啮齿类动物炎症性关节炎模型，包括K/BxN血清转移性关节炎、胶原诱导性关节炎和胶原抗体诱导性关节炎。通常需要基于细胞的实验来阐明关节炎中的分子功能。因此，研究人员已从关节炎动物模型中分离出原代细胞。从小鼠关节炎组织中分离滑膜成纤维细胞（SFs）的方法已较为成熟，这些细胞有助于揭示关节炎发病过程中的分子机制
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方案
涉及动物的实验已获得爱媛大学动物实验委员会的批准，并严格按照爱媛大学动物实验指南（37A1-1*16）进行。
1. 仪器、试剂与培养基的准备
- 按如下方法准备培养基：在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素-抗真菌溶液（anti-anti）。
- 按如下方法准备消化液：在培养基中添加 1 mg/mL IV 型胶原酶。使用前调整胶原酶浓度。
- 用 1 mM 盐酸溶液将 I-C 型胶原稀释至 0.15 mg/mL 的浓度。将稀释后的胶原溶液加入培养皿（直径为 40 或 60 mm）中，使其完全覆盖皿底。室温孵育 6–12 小时后，吸出胶原溶液，并在室温下干燥。胶原包被的培养皿可在室温下保存至少 1 周。使用前用磷酸盐缓冲液（PBS）或培养基洗涤预包被的培养皿。
- 准备无菌手术器械，如剪刀、带锯齿尖端的镊子和尖头镊子。使用前用 70% 乙醇浸泡。
2. 小鼠滑膜炎组织的制备（图1A）
- 准备一只后肢足爪患有炎症性关节炎的小鼠。
注意：本实验方案使用7-8周龄、体重18-20 g的雌性C57BL/6小鼠，诱导....
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结果
7至8周龄的雌性C57BL/6小鼠接受胶原抗体诱导的关节炎处理。根据上述方法（图2A、B），分别从炎症性关节炎组织中独立分离出巨噬细胞样细胞和成纤维细胞样细胞。巨噬细胞样细胞在完成步骤5.7后立即使用。成纤维细胞样细胞在步骤4.4后首先培养至亚汇合状态，然后传代至新的培养皿中再进行使用。为评估SMs和SFs是否成功分离，进行了以下实验。
为评估分离细胞的纯度，通过RT-qPCR分析了多种细胞标志物的mRNA表达水平。Cd68、Emr1、Itgam和Csf1r用作泛巨噬细胞标志物，Cdh11、Col6a1、Csf1和Vcam1用作滑膜成纤维细胞（SF）标志物。Rplp0作为参考基因6,8。所有标志物基因的表达均以
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讨论
本方法改进了以往从鼠类关节炎组织中分离滑膜成纤维细胞以及从多种器官中分离常驻巨噬细胞的技术7,11该改良方法能够从炎性滑膜组织中分离出高纯度的巨噬细胞和成纤维细胞，操作简便且可重复。由于该方法无需流式细胞分选仪等复杂设备，任何研究人员均可实施。此外，本技术避免了其他分选方法（如荧光激活细胞分选FACS和磁激活细胞分选MACS）可能带来的问题，例如抗体处理以及分选过程中的物理作用可能导致细胞损伤和应激反应12,13所得细胞可用于研究，所受不必要的外界刺激相对较少。此前， 体外 滑膜组织驻留巨噬细胞的分析一直较为困难，因为即使在小鼠关节炎条件下，分离获得的细胞数量也较少。本方法通过将滑膜巨噬细胞（SMs）与滑膜成纤维细胞（SFs）共培养实现其扩增，类似于此前用于肝脏、脾脏、肺和脑来源巨噬细胞的培养方法。11此外，qPCR结果表明，仅需一次SF传.......
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
作者感谢爱媛大学医学研究支援部、先进研究支援中心（ADRES）以及蛋白质科学中心（PROS）整合生理病理学部的工作人员提供的技术支持和帮助。本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）科研费资助项目JP17K17929、JP19K16015、JP21K05974（授予NS）以及JP23689066、JP15H04961、JP15K15552、JP17K19728、JP19H03786（授予YI）的资助；还获得了难治性疾病大阪医学研究基金会、中富基金会、日本骨与矿物研究学会（JSBMR）新星奖、住友财团、先导医学研究基金会、持田纪念药学基金会（授予NS）的资助；以及武田科学基金会医学研究资助、UCB日本公司（UCBJ）项目资助和日本骨与矿物研究学会 2019年度前沿科学家奖（授予YI）的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5.0 g/L 胰蛋白酶/5.3 mmol/L EDTA 溶液 | nacalai tesque | 35556-44 | 用 HBSS 稀释 |
| 抗生素–抗真菌剂（anti/anti） | Gibco | 15240-062 | |
| 蝶形针 | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| 细胞筛 | Falcon | 352340 | 40 µm 孔径，尼龙材质 |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | I 型胶原蛋白 C 型 |
| 离心管 15 | TPP | 91014 | 15 mL 管 |
| 离心管 50 | TPP | 91050 | 50 mL 管 |
| 来自 C. histolyticum 的胶原酶 | Sigma | C5138 | IV 型胶原酶 |
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基 GlutaMax（DMEM） | Gibco | 10569-010 | |
| 胎牛血清（FBS） | SIGAM | 173012 | 已进行热灭活处理 |
| Hanks' 平衡盐溶液（HBSS） | Wako | 085-09355 | |
| 剪刀 | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| 组织培养皿 40 | TPP | 93040 | 用于细胞培养 |
| 组织培养皿 60 | TPP | 92006 | 用于细胞培养 |
| 镊子 | KFI | 1-9749-31 | 尖头型 |
| 镊子 | Bio Research Center | PRI28-1522 | 锯齿尖端 |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | 体视显微镜 |
参考文献
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S.
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重印与许可
