Method Article

一种基于智能手机的秀 丽隐杆线虫 草坪回避测定成像方法

DOI:

10.3791/65197

⸱

February 24th, 2023

 ,  , 
1Department of Physiology, Mitohormesis Research Center, Yonsei University Wonju College of Medicine, 2Division of Biological Science and Technology, College of Science and Technology, Yonsei University, Mirae Campus

In This Article

Summary

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本文介绍了一种简单、低成本的方法来记录 秀丽隐杆线虫的草坪回避行为，使用智能手机和发光二极管 （LED） 灯箱等现成的物品。我们还提供了一个 Python 脚本，将视频文件处理成更适合计数的格式。

Abstract

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当暴露于有毒或致病细菌时，线虫秀 丽隐杆线 虫表现出习得的草坪回避行为，其中蠕虫逐渐离开其食物来源并宁愿留在细菌草坪之外。该测定是测试蠕虫感知外部或内部线索以正确应对有害条件的能力的简单方法。虽然检测方法简单，但计数非常耗时，尤其是对于多个样品，并且跨夜的检测持续时间对研究人员来说很不方便。可以长时间对许多板进行成像的成像系统很有用，但成本很高。在这里，我们描述了一种基于智能手机的成像方法来记录 秀丽隐杆线虫的草坪回避。该方法只需要一部智能手机和一个发光二极管（LED）灯箱作为透射光源。使用免费的延时相机应用程序，每部手机最多可以成像六个板，具有足够的清晰度和对比度来手动计数草坪外的蠕虫。生成的电影在每个小时时间点被处理成 10 秒的音频视频交错 （AVI） 文件，然后裁剪以显示每个单板，使其更适合计数。对于那些希望检查回避缺陷的人来说，这种方法是一种具有成本效益的方法，并且有可能扩展到其他 秀丽隐杆线虫 测定。

Introduction

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在研究秀丽隐杆线虫的众多优点中，其简单的神经系统为研究遗传和细胞水平的变化如何影响网络功能和行为输出提供了机会。尽管神经元数量有限，秀丽隐杆线虫表现出广泛的复杂行为。其中之一是避免草坪，其中细菌线虫通过离开细菌草坪来响应有害食物来源。秀丽隐杆线虫避开致病细菌1，2，3 的草坪、产生毒素或掺有毒素的细菌草坪1，4，甚至是表达 RNAi 的细菌，其靶基因敲低对蠕虫的健康有害4，5。研究表明，蠕虫对外部线索做出反应，例如致病菌产生的代谢物1，6，或表明食物使它们生病的内部线索4，7。这些线索通过保守的信号通路处理，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和转化生长因子β（TGFβ）通路，并且需要肠道和神经系统之间的通信

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Protocol

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1. 设置成像设备（图 1A-E）

  1. 确保具有以下最低要求的智能手机摄像头可用:
    12 百万像素 （MP） 摄像头
    1080p 分辨率视频
    5 GB 存储空间（20 分钟视频为 3-4 GB）
    来自应用商店的延时视频应用程序（提供免费应用程序）
  2. 将LED灯箱放在将进行测定的25°C培养箱的底部架上。
  3. 要隐藏 LED 灯表面上的虚线图案，请铺两张纸巾以覆盖 LED 盒子的整个表面。
  4. 为标本制作一个升高的载物台（图1A，D）。高架舞台是由空心矩形隧道支撑的透明塑料板。隧道的功能类似于聚光镜来聚焦光线，为标本提供更好的对比度（图 1C）。确保隧道的墙壁有些暗，以尽量减少光散射。这项研究使用了牛皮纸盒。隧道的尺寸为5.5厘米x 17厘米x 4.5厘米（宽x长x高）。LED灯箱最多可容纳五个隧道。
  5. 在载物台上方放置另一个机架以放置电话进行录制（图1B，E）。每部手机将记录三到六个板（一到两排三个板），因此请相应地调整机架高度。这将在标本上方约15厘米处....

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Results

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脚本产生的第一个视频是从测定开始1小时。0小时的视频不会被保存，因为蠕虫在草坪内开始测定，因此占用率始终为100%。

将野生型N2蠕虫与npr-1突变体进行比较，其草坪回避缺陷在文献中已得到充分证实6，10（图3A-E）。在野生类型中可以看出，蠕虫逐渐离开细菌草坪并留在室外（图3A，B）。结果绘制在图表中，以显示入住率随时间的变化（图3B）。视频中可以清楚地看到外面的蠕虫，但厚厚的细菌草坪内的蠕虫更难区分（图3D，E）。但是，由于每个盘子中正好有 30 条蠕虫，因此可以通过从总数.......

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Discussion

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成像动物行为，而不是依靠直接观察，不仅方便，而且具有留下视觉文档的优点。这允许客观的第三人进行盲分析，甚至可以使用图像识别技术进行自动分析。尽管有这些优点，但通常提供的标准设备成本很高，因此一旦购买，就会致力于设置。

使用智能手机收集简单 秀丽隐杆线虫 行为的视频记录有几个优点。它需要对技术知识的最小熟悉程度，并且非常容易设置，使用可以轻松且廉价采购的物品。另一个优点是智能手机的便携性——它可以安装在狭小的空间里，而且由于它有自己的存储空间，所以不需要连接回计算机。这允许将设置放置在任何地方，即使空间极其有限。将录制的视频文件移动到计算机很方便 - 文件不是那么大，因为它们以压缩的 MPEG-4 格式编码。当文件传输的无线选项可用时，移动文件特别方便。

由于蠕虫是在没有任何放大倍率的情况下成像的，因此视频中捕获的蠕虫仅包含几个像素。L4蠕虫足够大，无需放大即可捕获，但小像素尺寸限制了其用于高质量图像识别和运动跟踪。使用较新型号提供的变焦镜头或安装变焦镜头适配器可能有助于获得更详细的图像，尽管我们自己还没有尝试.......

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢Deok Joong Lee对手稿的批判性阅读和测试Python代码。本研究由韩国国家研究基金会2017R1A5A2015369（K.-h.Y.）和2019R1C1C1008708（K.-h.Y.）赞助。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm 培养皿SPL#10035
Bacto 琼脂BD#214010
Bacto 蛋白胨BD#211677
CaCl2DAEJUNG2507-1400
胆固醇BioBasicCD0122
磷酸氢二钾 （K2HPO4）JUNSEI84120-0350
甘油BioBasicGB0232
King B 肉汤MB 细胞MB-K0827
LED 灯箱多垫ArtmateN/A这是一个 USB 供电的 LED 灯垫，用于描摹和绘图。Artmate 是一个韩国品牌，但在任何搜索引擎中搜索"用于追踪的 LED 灯箱"都应该会产生许多其他品牌的大量选择。整体尺寸约为 9 英寸 x 12 英寸（A4 尺寸）。例如，从亚马逊美国：https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords=
LED%2枯萎%2Bbox&qid=1674183224&sprefix
=led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1
MgSO4DAEJUNG5514-4400
塑料纸套（透明）Smead#85753任何有一点刚度的透明塑料板都可以用作舞台。例如，从 Amazon US 发货： https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ
8
磷酸二氢钾 （KH2PO4）JUNSEI84185-0350
电源板 要容纳 3 部电话和一个 LED 盒，您至少需要 4 个插座。
智能手机N/AN/A最低要求：12MP 广角摄像头，1080fps 的 30p 高清视频录制
钠 （NaCl）DAEJUNG#7548-4100
磷酸氢二钠无水 （Na2HPO4）YAKURI#31727
氯化

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
  2. Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H.

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