鸡胚被用于研究人类胶质母细胞瘤（GBM）脑肿瘤 在卵内 以及在 离体 脑片共培养。通过延时显微成像可记录胶质母细胞瘤细胞的行为， 离体 共培养，且两种制备物均可在实验终点通过详细的三维共聚焦分析进行检测。
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摘要
摘要
鸡胚一直是研究脊椎动物发育的理想模型系统，尤其适用于实验操作。鸡胚模型的应用已拓展至人类胶质母细胞瘤（GBM）脑肿瘤形成机制的研究。 体内 以及肿瘤细胞向周围脑组织的侵袭性。可通过将荧光标记细胞的悬液注射到E5期中脑（视顶盖）脑室来形成胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤 在卵内.
根据胶质母细胞瘤（GBM）细胞的不同，致密的肿瘤会随机形成于脑室及脑壁内，且细胞群体会侵入脑壁组织。通过对固定后的E15期中脑组织切片（厚度为350 µm）进行免疫染色，并结合共聚焦显微镜z轴层扫图像的三维重建分析，可发现侵袭性细胞常沿血管迁移。E15期的中脑和前脑活体切片（厚度250–350 µm）可在膜插件上进行培养，并将荧光标记的GBM细胞引入特定非随机位置，从而建立ex vivo共培养体系，用于分析细胞侵袭行为——该过程同样可沿血管发生，持续时间约为1周。此类ex vivo共培养体系可通过宽场或共聚焦荧光延时显微镜进行实时监测，以观察活细胞的行为动态。
随后可对共培养的脑片进行固定、免疫染色，并通过共聚焦显微镜分析，以确定肿瘤细胞的侵袭是否沿血管或轴突发生。此外，可通过将不同细胞类型和颜色的细胞团块精确放置在不同位置并观察细胞运动，利用该共培养系统研究潜在的细胞间相互作用。ex vivo 培养可进行药物处理，而此类处理与 in ovo 系统不兼容。这两种互补的方法可在高度可调控的脊椎动物脑环境中，对人胶质母细胞瘤（GBM）细胞的行为及肿瘤形成进行详细而精确的分析。
引言
体外研究常用于解析在更复杂的肿瘤形成和细胞侵袭行为中可能发挥作用的潜在机制，这些行为可在体内异种移植模型中观察到。例如，在胶质母细胞瘤（GBM）研究中，体外实验已揭示了L1CAM在新型鸡胚异种移植脑肿瘤模型中参与肿瘤形成和脑组织侵袭的潜在作用机制1,2,3,4,5。尽管体外与体内实验在研究中可相互补充，但两者之间仍存在显著的关联空白。例如，对培养皿中GBM细胞运动性的机制分析是一种高度人工化的环境，而体内异种移植模型仅能提供肿瘤形成及细胞行为的静态时间点或终点分析结果。体内研究无论是使用啮齿类动物还是鸡胚，均难以在细胞侵入脑组织的过程中实时监测其行为。然而，鸡胚异种移植模型已证实，黏附蛋白L1CAM在人源T98G GBM细胞的侵袭能力中发挥促进作用2,5。
通过使用一种称为ex vivo模型的脑组织切片培养系统，将in vivo和in vitro方法结合起来，是解决这一问题的合适方案。在这种ex vivo模型中，活体脑组织可维持数百微米的厚度，持续数周时间，从而可以植入癌细胞，观察其在真实组织中的行为变化，并在实验终点进行更详细的标志物分析。
一种常用的器官型脑片培养方法是将数百微米厚的脑片置于半透明或透明的多孔膜上，使组织暴露于空气中，同时允许培养基从膜下方为组织提供营养（参见 Stoppini 等人6）。该方法已发展出多种变体，用于不同的研究，包括使用不同的培养基或不同类型的膜插件。不同的膜插件包括直径为 30 mm、孔径为 0.4 µm 的多孔膜插件置于 35 mm 培养皿中6，以及用于 6 孔板的细胞培养插件（孔径 0.4 µm）7。不同的培养基包括 50% MEM/HEPES + 25% 热灭活马血清 + 25% Hank's 平衡盐溶液（HBSS）8、50% 低血清培养基 + 25% 马血清 + 25% HBSS9，以及其他配方。若使用半透明或透明膜，并结合荧光标记的 GBM 细胞，则可通过倒置的宽场或共聚焦荧光显微镜从下方对这类培养物进行成像10,11,12,13,14,15。
尽管如上文所述，已有多种利用啮齿类动物建立的体内原位脑肿瘤异种移植模型以及离体脑组织切片培养模型，鸡胚（Gallus gallus）在这些研究中的应用却相对不足。然而，已有研究表明，鸡胚可作为研究人源和大鼠胶质瘤侵袭的体内原位异种移植模型1,2,5。移植至鸡胚脑内的细胞表现出与啮齿类模型中相似的侵袭模式，进一步支持将鸡胚用作体内胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤细胞分析的模型。此外，鸡胚成本低廉，比啮齿类动物更易于维持（例如，在实验室培养箱中的蛋壳内即可孵化），且操作更为简便，因此成为短期体内GBM研究的理想选择。最近一项研究报道了利用鸡胚脑切片培养系统研究正常脑发育过程中轴突形成与生长的情况，其中脑切片在体外至少可维持7天的活性16。然而，目前尚缺乏将此类鸡胚脑切片培养系统用于离体环境下GBM细胞行为分析的研究。本文描述了将人源GBM细胞及GBM干细胞（GSCs）移植至早期鸡胚脑内进行体内研究，以及将GBM细胞接种于活体鸡胚脑切片培养系统中进行离体研究的方法，并提供了这些实验体系所获得的代表性肿瘤形态和细胞侵袭模式的示例。
方案
在特拉华大学开展此项工作无需获得许可或批准。
1. 胶质母细胞瘤细胞注射至鸡视顶盖
- GSCs 和 GBM 细胞的注射前制备
- 在GSC培养基中培养GSCs（表1). 在GBM培养基中培养已建立的GBM细胞系（表1).
- 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养板上的细胞，向10 cm培养皿中加入1 mL胰蛋白酶溶液，置于细胞培养箱中孵育2–3分钟，直至细胞开始脱落。
- 通过加入10 mL含适当血清的培养基至10 cm培养皿中以灭活胰蛋白酶，并通过反复吹打使细胞脱落。将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。
- 通过离心（800 × g）沉淀细胞 g 4 °C下离心5分钟。
- 用一次性细口玻璃移液管连接侧臂烧瓶和真空泵，吸除细胞沉淀中的培养基。将细胞重悬于适量生长培养基中，调整浓度至每微升10,000个细胞，并置于冰上的微量离心管或小型螺旋盖管中。
- 将细胞与少量无菌的1%亮蓝FCF染料混合（使用5 µL染料/100 µL细胞悬液的比例）。
- 将GBM细胞注射至E5视顶盖 在卵内。参见 补充图1.
- 将受精的鸡卵置于加湿型卵孵化器中，尖端朝下，于37.5 °C培养（该 孵育第1天 是胚胎第0天 [E0]). 在孵育的第6天（E5），用70%乙醇喷洒卵壳进行消毒。
- 使用检蛋灯，用铅笔沿胚胎上方气室的边缘描记轮廓，并用透明胶带覆盖所标记的区域。
- 使用弯头剪刀沿标记区域小心地剪开，注意不要剪到胚胎膜或血管，然后弃去蛋壳上部。
- 在气室膜上滴加少量生理盐水或细胞培养基以润湿，使其易于剥离。用精细镊子小心刺破覆盖在胚胎上方的气室膜，将其移除，并定位鸡胚头部。
- 使用精细镊子夹住紧贴胚胎的透明羊膜，以固定头部位置，便于向视顶盖注射细胞。一手持精细镊子夹住羊膜，保持头部在注射过程中的稳定。注意避免损伤卵黄上绒毛尿囊膜中的胚外血管。
注意：上述操作需要一定练习才能高效地夹取紧密包裹胚胎的透明羊膜，因为羊膜在未被夹取并拉出之前是不可见的。请练习使用精细镊子夹取紧贴胚胎周围的透明羊膜。 - 用精细镊子夹住羊膜以固定头部。使用玻璃微量移液管和气动皮升泵，将约50,000个细胞悬浮于5 µL适宜的细胞培养基中，注射至视顶盖（5 µL约等于移液管容量的一半）。
注：参见 Cretu 等人。1 用于显示已注射了与染料混合的GBM细胞的E5胚胎的图像。 - 在胚胎上方滴加几滴 50 mg/mL 氨苄青霉素。
- 用透明胶带封住卵顶部的孔洞，并将卵置于加湿器中直至E15期进行解剖。
2. 从E15胚胎中分离脑区
注意：此处用于固定的 E15 脑组织解剖步骤与第 8.2 步中所述活体脑切片的解剖方法类似，但此处的解剖操作无需在无菌条件下进行。
- 剪去蛋壳顶部周围的胶带，以暴露胚胎。
- 在颈部处切断胚胎头部，并将其放入盛有无钙无镁的无菌台氏液（CMF Tyrode's）的10 cm培养皿中。参见补充图2。
- 使用精细镊子剥离覆盖在脑表面的皮肤，暴露出下方的硬脑膜。去除脑左右两侧正在形成的颅骨骨板。此时颅骨骨板尚未覆盖大脑的大部分区域。
- 用精细尖头镊子轻轻撕开覆盖在脑中央的脑膜，并向两侧剥离，以完全暴露脑组织。
- 使用弯头镊子从下方轻轻托起脑组织，并缓慢将其从颅腔中取出。
- 将脑组织解剖为不同部分：前脑、视顶盖（tecta）、小脑。
- 用精细镊子去除视顶盖表面的软脑膜（pia mater）。注意软脑膜易于与视顶盖分离，但不易从前脑或小脑上剥离。可通过接触或在小片滤纸上滚动的方式去除前脑的软脑膜。
- 将分离出的脑区置于小培养皿中。
- 将用于固定的脑组织放入24孔板的孔中，加入含2%多聚甲醛（PFA）的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液进行固定，4 °C条件下至少固定24小时。
- 固定完成后，用PBS缓冲液冲洗组织至少3次，总冲洗时间不少于1小时，随后进行琼脂包埋。
3. 收集脑区的包埋与切片
- 将 PBS 中含 3.5% 琼脂和 8% 蔗糖的溶液预热至完全融化，并保持在熔点温度。
- 使用弯头镊子作为铲子，轻轻取出鸡胚脑的视顶盖或前脑区域，并在滤纸上轻轻蘸拭以去除多余液体，确保琼脂能够黏附于脑组织外表面。
- 使用无菌移液管将琼脂溶液注入模具中。
注意：可通过将铝箔包裹在适当大小的物体（如小型矩形金属振动切片机刀块）周围来制作简易模具。 - 将脑组织放入琼脂中，并让琼脂完全凝固。
- 移除包埋脑组织周围的铝箔，并使用剃刀刀片或解剖刀修剪周围多余的琼脂。
- 在切片托盘的不锈钢方块上滴加一滴氰基丙烯酸盐胶水，将含脑组织的琼脂块放置于胶水上，静置 1 分钟使胶水充分黏合。将托盘装入振动切片机的卡盘中并拧紧，然后向托盘中加入足量 PBS，使液面覆盖琼脂块顶部。
- 使用钢制剃刀刀片在振动切片机上以 350 µm 厚度切割脑片。
- 当脑片被切下并自由漂浮于切片托盘中时，使用刮铲将其捞起并移出托盘。轻轻将切片从刮铲上滑入盛有 PBS 的已标记 10 cm 培养皿中，使其自由漂浮。
注意：若在包埋前未用滤纸充分吸除多余液体，包埋脑片周围的琼脂可能脱落。若发生此情况，可将脑组织从已凝固的琼脂中轻柔取出，在妥善吸除多余液体后重新包埋。
4. 对含有肿瘤细胞的脑组织切片进行免疫染色
- 使用配备落射荧光装置的体视显微镜，逐一检查10 cm培养皿中的各个切片，判断肿瘤细胞的存在与否。
- 配制足量含0.1% Triton X-100和5%正常山羊血清的磷酸盐缓冲液（PBSTG）（见表1），用于免疫染色，并将待染色切片用该缓冲液漂洗。
- 用PBS填充将用于脑切片染色的24孔板中各孔的一半体积。
- 用刮勺边缘或解剖刀修剪脑切片周围琼脂的角落，然后轻柔地将切片转移至含有PBS的孔中。
- 吸除PBS，每孔加入350 µL溶于PBSTG中的初级抗体染色液（例如，PBSTG中含2 µg/mL UJ127）。
- 在4°C冷藏环境中轻轻振荡孵育24小时，确保切片在孔内可自由移动。
- 孵育24小时后，移除初级抗体溶液，在4°C冷藏环境中用PBSTG振荡漂洗3次，每次1小时。
- 漂洗结束后，每孔加入350 µL溶于PBSTG中的二抗染色液（例如，生物素化羊抗小鼠IgG在PBSTG中1:200稀释）。在4°C冷藏环境中振荡孵育20小时。
注意：若省略三抗步骤，而在此步直接使用含荧光染料的二抗，则孵育过程中需避光，并随后跳至步骤4.11。 - 移除二抗溶液，在4°C冷藏环境中用PBSTG振荡漂洗3次，每次1小时。
- 吸除PBSTG，加入三抗溶液（例如，PBSTG中Alexa Fluor 647标记的链霉亲和素1:250稀释液）。如需在此步对细胞核进行染色，可在混合液中加入0.1 µg/mL双苯并咪唑（bisbenzimide）。在4°C冷藏环境中振荡孵育20小时。
- 移除三抗溶液，在4°C冷藏环境中用PBSTG振荡漂洗3次，每次1小时。
- 最后将切片保留在PBS中，待后续封片使用。
5. 在显微镜载玻片上固定切片
- 根据待贴附的切片数量，准备相应数量的显微镜载玻片。
- 对于每张载玻片，将一条长50 mm、厚10 mil（254 µm）的乙烯基电工胶带贴在一块石蜡膜上。
- 使用1 cm × 1 cm的方形打孔器，穿过电工胶带和石蜡膜的中心打孔。
- 将胶带从石蜡膜上取下，并将其贴在显微镜载玻片表面，注意在载玻片上预留出用于标记标签的空间。
- 使用微量移液器，在电工胶带中央的方孔中加入一至两滴抗荧光淬灭封片剂。
- 用弯头刮铲从PBSTG溶液中挑起所需振动切片机切片，并用干净的实验室擦拭纸或滤纸彻底吸除多余水分。
- 将切片边缘轻触封片剂液滴，并用另一把刮铲轻轻将切片滑入封片剂中。
- 在切片上再加几滴封片剂，然后小心地将一块24 mm × 30 mm（#1.5厚度）的盖玻片覆盖在切片和封片剂上。
- 用指甲油密封盖玻片边缘，以固定其位置。
6. 固定脑切片的共聚焦显微镜观察
- 使用合适的物镜和滤光片组，通过宽场荧光显微镜在固定的脑切片中寻找荧光标记的肿瘤。
注意：某些肿瘤体积较大，使用 4x 物镜即可清晰观察；而单个细胞可能需要使用 10x 物镜。 - 切换至共聚焦显微镜，选择合适的物镜、激光器、针孔大小和探测器设置。为遵循本方案，常规成像使用 20x 物镜（数值孔径 [N.A.] = 0.75），高分辨率成像使用 60x 油镜（N.A. = 1.40）。
- 根据共聚焦显微镜制造商的说明，设置 z 轴的上下限及步进大小，以获取光学切片。采集一组 z 轴堆栈的光学切片。
- 根据制造商的说明，使用共聚焦显微镜软件生成肿瘤的三维体积重建图像。
7. 类球体的制备
- 制备聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（poly-HEMA）培养板
- 配制含10 µg/mL poly-HEMA的95%乙醇溶液，并向35 mm培养皿（或细胞培养皿）中加入1 mL该溶液进行包被。
- 将培养皿在室温下敞口置于摇床上过夜，以使培养皿表面形成包被。
注意：溶剂将挥发，留下半透明的包被层，表面可能不均匀，但这不会影响细胞球体的形成。 - 干燥后，在生物安全柜中用紫外光对敞口的培养皿灭菌1小时。灭菌后盖上皿盖。包被后的培养皿即可使用。
- 用于延时显微成像的DiD荧光染色
注意：本步骤用于以DiD荧光染料对单细胞进行染色，以便后续形成球体，从而优化活细胞延时成像中细胞运动的可视化效果。- 将细胞悬浮于无血清培养基中。
- 每毫升细胞悬液中加入5 µL DiD储存液，用移液器轻轻混匀。在37 °C下孵育20分钟。
- 将标记后的细胞悬液在5 °C下以800 × g离心5分钟。
- 吸除上清液，并将细胞重悬于预温的培养基中进行洗涤。
- 重复上述离心和洗涤步骤两次。
注意：如需要，可在完成此步骤后直接跳至7.3.6步骤，立即进行球体的制备。
- 制备细胞球体
- 将0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液预热至37 °C。
- 在GSC培养基17（表1）中培养GSCs，在U-118培养基中培养U-118恶性胶质瘤（MG）细胞（见表1）。每制备一块35 mm培养板的球体，需使用一个10 cm培养皿的融合细胞。初始时向GSCs中加入bFGF（终浓度10 ng/mL）和TGF-α（终浓度20 ng/mL）生长因子，之后每3天添加一次。
注意：本研究中使用的细胞为绿色GSC15-2/K72、绿色GSC16-4/K72、红色U-118/L1LE/mCherry2x和红色U-118/1879/mCherry2x。一块球体培养板的细胞量足以用于两块6孔板的膜插件脑片实验。 - 用无菌PBS冲洗培养皿中的细胞，并向10 cm培养皿中加入1 mL胰蛋白酶溶液。放入细胞培养箱中孵育2–3分钟，直至细胞开始脱落。
- 向10 cm培养皿中加入10 mL含适当血清的培养基以终止胰蛋白酶反应，并通过上下吹打使细胞完全脱落。将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。
- 在4 °C下以800 × g离心5分钟，使细胞沉淀。
- 吸除细胞沉淀中的上清液，并将细胞重悬于10 mL培养基中。
- 向每个35 mm poly-HEMA包被的培养皿中加入2 mL细胞悬液，并再加入2 mL适当的培养基，使每皿总培养基体积达到4 mL。若使用GSCs，需添加生长因子。
- 将细胞置于细胞培养箱中孵育，直至细胞聚集体达到100–200 µm的大小，所需时间可能为1–2天，具体取决于接种细胞的密度。
8. 活体鸡胚脑解剖与振动组织切片机 切片
- 解剖前准备
- 在6孔聚酯膜插板中，于膜插下方加入1 mL脑片培养基（见表1）。
- 使用70%乙醇对操作区域和工具进行消毒。
- 在解剖过程中，将6孔插板置于冰上。
- 准备100 mL振动组织切片机切割液（表1），并置于冰上。
- 将一管含4%低熔点琼脂糖的PBS置于水浴中，加热至完全融化成液体状态（约50 °C）。
- 用冰填满振动组织切片机的水槽。
- E14/15期鸡胚脑组织的无菌解剖
- 使用照蛋灯，在E14或E15期鸡胚上方气室边缘用铅笔描出轮廓，并用透明胶带覆盖所标记区域。
- 使用弯头剪刀或精细剪刀，沿已标记区域轻轻剪开，注意避免剪破胚胎膜或血管，随后移除顶部蛋壳。
- 使用弯头镊子，移除覆盖在胚胎上方的气室膜，定位鸡胚头部。
- 将胚胎头部剪下，并放入盛有冷的无菌CMF溶液的10 cm培养皿中。见补充图2。
- 使用无菌精细镊子，剥离覆盖在脑组织表面的皮肤，暴露下方的硬脑膜。去除脑组织左右两侧正在形成的颅骨骨片。此时颅骨尚未覆盖大脑的大部分区域。
- 使用精细尖头镊子（#5或#55），轻轻撕开覆盖在脑中央的脑膜，并向两侧剥离，以暴露脑组织。
- 使用精细弯头镊子，从脑组织底部前侧轻轻托起脑组织，并缓慢将其从颅腔中取出。
- 将脑组织解剖为三个主要部分：前脑、中脑（视顶盖）、小脑。如有需要，可参考鸡胚发育图谱。
- 使用精细镊子去除视顶盖表面的软脑膜。
注：软脑膜易于从视顶盖上分离，但难以从前脑或小脑上剥离。可通过接触或在无菌纱布上滚动的方式去除前脑的软脑膜。 - 将解剖好的脑区组织置于冰上的小型无菌培养皿中。
- 脑组织包埋与切片
- 使用弯头镊子作为铲具，轻轻夹取视顶盖或前脑区域，在无菌纱布上轻微吸干，去除多余液体，以确保琼脂糖能够牢固黏附于脑组织外表面。
- 使用无菌移液管，将低熔点琼脂糖注入模具中。可通过将铝箔包裹在适当大小的物体周围来制作简易模具，通常使用小型矩形金属振动切片机固定块作为模具。见补充图3。
- 迅速将脑组织放入琼脂糖中，并在冰上静置约4–5分钟，使其凝固。
注：在琼脂糖完全凝固前，脑组织可能沉至模具底部。若发生此情况，可先等待1分钟使琼脂糖开始凝固，再将脑组织置入琼脂糖中。尽量使脑组织悬浮于琼脂糖中央位置。 - 从已凝固的琼脂糖块中去除周围的铝箔，并使用无菌剃刀或手术刀修剪周围多余的琼脂糖。
- 在切片槽/托盘的不锈钢方块上滴加一滴氰基丙烯酸酯胶水，将含脑组织的琼脂糖块放置其上，静置1分钟使胶水充分黏合。将托盘装入振动切片机卡盘中并拧紧，随后加入切割液至液面覆盖琼脂糖块顶部。
- 使用蓝宝石刀片在振动切片机上以250–350 µm厚度进行切片，据报道，蓝宝石刀片相比钢制剃刀可减少对活组织的损伤。
- 当脑片被切下并自由漂浮于切片槽中时，使用无菌刮勺将其捞起并移出槽外。用另一把无菌刮勺轻轻将切片从刮勺上滑下，转移至膜插上。
注：通常可根据需要在每个膜插上放置两到三片脑切片。若脑组织未充分吸干多余液体，其周围的琼脂糖可能在操作过程中脱落。若在充分吸干后仍发生脱落，可小心地仅取脑切片而不带周围琼脂糖，直接滑入膜插上。 - 将含有脑切片的6孔板置于细胞培养孵箱中，条件为37 °C、5% CO2。
- 接种后次日，使用无菌巴斯德吸管从膜插下方吸取旧培养基（膜插侧壁有缝隙可供吸管进入下方空间）。在每个孔的膜插下方加入1 mL新鲜切片培养基。此后每隔一天更换一次培养基。
- 等待数 天，直至脑切片牢固附着于膜插表面，并略微展平。此现象表明切片具有活性，已准备好用于接种胶质母细胞瘤（GBM）细胞。
9. 将胶质母细胞瘤细胞接种至脑切片
- 类球体法
- 当细胞类球体生长至150–200 µm大小时，使用设定为5 µL的20 µL微量移液器从培养皿中取出一个或多个类球体。参见补充图3。
- 将含有类球体的培养基轻柔地排至目标脑切片上。
注意：类球体应在移液器吸头中可见。使用透明吸头可更便于观察。若液体释放时类球体从脑切片上脱落，应使用经乙醇灭菌并粘附于细木棒上的睫毛轻推类球体，使其重新回到脑切片上。 - 让类球体在脑切片上继续培养2–5天。
注意：此步骤的限制因素似乎是切片中血管和脑细胞最终会发生降解。当使用层粘连蛋白染色时，降解的血管在切片中表现为不连续的球状结构。
- 活检打孔法
- 让脑切片在膜插件上自然贴附并趋于展平（在培养中可能需要2–5天）。
- 将细胞基质置于冰上解冻。
- 在细胞培养生物安全柜内，将无菌的1 mm直径活检打孔器连接至真空吸引管。
- 用活检打孔器轻轻接触脑切片，在其中心打一个直径1 mm的孔。
注意：打孔所得组织将在负压作用下被吸入打孔器内。 - 通过胰酶消化一个60%–70%融合度的10 cm培养皿中的细胞，并将其重悬于10 mL培养基中制备细胞悬液；然后将1 mL该悬液与100 µL基质混合，制成细胞-基质混合物。
- 使用20 µL微量移液器，向每个脑切片的孔中加入1 µL细胞-基质混合物。
- 完成细胞混合物接种后，将含有嵌入细胞的脑切片培养皿放回培养箱，使基质凝固，并允许细胞可能向周围脑组织侵袭。
10. 宽场荧光延时显微镜
- 在6孔板边缘贴上可移除的胶带以防止培养基蒸发，但需在一侧留出小缝隙以利于气体交换。
- 将培养板置于倒置落射荧光显微镜的可调自动载物台上的定制培养室中。
注意：培养室通过气体注入控制器维持5% CO2 和95%空气的大气环境，并使用热空气温度控制器和温控载物台插入装置将温度保持在37 °C。有关本实验所用系统的详细信息，请参见Fotos等人的研究18。 - 使用合适的显微镜控制软件，设置一个延时成像程序，在20小时内每10分钟采集一次目标区域的荧光图像。
注意：若细胞中使用绿色荧光标记（例如绿色荧光蛋白[GFP]），应使用能够观察到细胞的最低强度蓝光激发光，以避免光毒性。由于红光（例如mCherry）和远红光（例如DiD）标记采用较长波长的激发光，似乎不存在此类潜在问题。
11. 活细胞成像后对脑切片进行免疫染色
注意：该免疫染色方案已优化用于层粘连蛋白标记血管，以及双苯并咪唑标记细胞核。请根据目标分子选择合适的抗体。
- 使用巴斯德吸管从膜插件下方吸出培养基，并在插件下方加入 1 mL 含 2% 多聚甲醛（PFA）的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液，同时在插件上方加入 1 mL 固定液以完全覆盖脑切片。将切片置于 4 °C 过夜固定。
- 移除膜插件下方的固定液以及脑切片表面残留的固定液（固定液容易通过膜插件渗漏至下方孔中）。
- 将带有切片的插件从 35 mm 孔板中取出，转移至较大的塑料培养皿中。
- 准备一个 24 孔板，在与脑切片数量相同的孔中各加入 350 µL PBS（免疫染色时每孔放置一个切片）。
- 使用薄型刮铲轻轻去除脑切片周围的琼脂糖，注意不要使脑切片从膜插件上脱落。确保琼脂糖能够从脑切片外缘顺利分离；若难以分离，则保留琼脂糖附着于切片上。
- 使用锋利的手术刀沿脑切片周围的膜进行切割，直至带有底层膜的切片与插件其余部分分离。用精细镊子夹住膜并取出附着有脑切片的膜片，将其放入 24 孔板的 PBS 孔中。
- 在低温室中用 PBS 对切片进行 3 次洗涤，每次 20 分钟，持续轻柔振荡或摇动，使切片在孔内自由移动。
- 在洗涤过程中，配制一抗溶液。
- 将抗层粘连蛋白（anti-laminin）抗体用 PBSTG 稀释至 2 µg/mL（见表 1）。
- 吸除各孔中的 PBS，加入一抗溶液，在低温室中轻轻振荡孵育过夜。
- 至少孵育 20 小时后，吸除一抗溶液，并用 PBSTG 对切片进行 3 次洗涤，每次 20 分钟。
- 在洗涤过程中，配制二抗溶液。
- 将荧光标记的羊抗小鼠 IgG（fluorescent-GAM）按所需荧光染料以 1:200 比例稀释于 PBSTG 中，同时加入终浓度为 0.1 µg/mL 的双苯并咪唑（bisbenzimide）。
- 吸除 PBSTG，加入荧光二抗溶液，在低温室中振荡孵育过夜。
- 吸除二抗溶液，用 PBSTG 洗涤 2 次，每次 20 分钟，再用 PBS 洗涤 1 次，持续 20 分钟。
- 将切片保留在 PBS 中，待后续封片（第 5 节）和观察时使用。
结果
此处展示了多个图例，用以说明通过以下实验操作获得的一些代表性结果：对视顶盖进行体内注射（图1 和 图2）；培养活体脑切片并评估其存活能力（图3）；建立离体脑切片培养体系，并利用活检打孔法植入荧光标记的细胞（图4）；通过在聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）上培养细胞生成细胞球（图5）；构建脑切片与细胞球的离体共培养体系，并采用4D共聚焦延时显微技术记录侵袭性细胞行为（图6）；以及在固定的脑切片样本中分析细胞球来源的侵袭性细胞行为与血管之间的关系（图7 和 图8）。这些结果并非穷尽所有可能，而是充分展示了利用鸡胚脑作为人源胶质母细胞瘤（GBM）异种移植模型所能获得的典型实验成果。
图1展示了在视顶盖内注射表达绿色荧光蛋白（GFP）的胶质瘤干细胞（GSCs）后，体内形成的肿瘤的一些代表性结果。in vivo条件下，GSCs附着于脑室表面，并在脑壁内形成侵袭性肿瘤。GSCs明显位于血管附近，并表现出沿血管迁移的特征。固定并经免疫染色的in vivo GSC肿瘤切片的三维体积重建旋转视频见补充视频S1、补充视频S2、补充视频S3和补充视频S4。本实验中使用了四种颜色来标记五个特征（绿色标记GSCs，白色标记细胞核，白色标记血管，蓝色标记整合素α-6，红色标记Sox2或nestin）。
图2 显示在视顶盖中形成的肿瘤的一些代表性结果 体内 注射表达GFP的GSCs与U-118/L1LE细胞的混合物后2 由于逆转录病毒载体转导而表达 mCherry。这些实验表明，当肿瘤由混合细胞悬液形成时，会发生细胞分选现象，使得GSCs位于外围或中心区域，而U-118细胞则根据特定的GSC细胞系不同，构成内部核心或外层皮质。
图3 显示存活率结果 离体 脑片培养。培养1周后，固定并进行层粘连蛋白免疫染色，结果显示存在大量完整的血管以及Sox2的表达，二者在此均用于证明脑片的活性。结果表明，鸡胚脑片可在膜插入式培养装置中培养约2周，仍可保持活性，并维持形态正常的血管及转录因子的表达。
图4 显示将红色U-118/L1LE/mCherry细胞（与基质混合）制成的“栓塞”植入后结果 离体 使用活检打孔法在脑片上创建空腔后，U-118细胞明显侵入脑组织，有时侵袭范围较广，且常沿血管分布。然而，细胞侵袭在接种细胞周围的周长上并不均匀。某些脑片中的血管有时也出现损伤或缺失，可能归因于打孔方法带来的额外创伤或培养时间较长所致。这表明，活检打孔/细胞栓塞法可用于将胶质母细胞瘤（GBM）细胞引入培养脑片的特定位置 离体 脑切片，随后细胞侵入该脑切片。
图5 显示培养中的活体球状体，以及将活体胶质母细胞瘤（GBM）细胞球状体接种后获得的多个宽场荧光显微图像示例 离体 用于延时实验的脑切片。球状体细胞侵入脑切片的动态影像见于 补充视频 S5 和 补充视频 S6。这表明，细胞球体是将胶质母细胞瘤（GBM）细胞或胶质瘤干细胞（GSCs）接种至特定位置的另一种有效方法 离体 脑切片中细胞的侵袭性行为可通过宽场荧光显微镜进行监测，但单个细胞的分辨率可能较低。
图6展示了活体GSC16-4/GFP和U-118/L1LE/mCherry细胞侵袭脑切片的共聚焦延时实验的静态图像。在多点延时实验中，每隔10分钟采集一次共聚焦z轴层扫图像，持续20小时。随时间推移，从类球体侵袭入脑切片的细胞侵袭过程电影以共聚焦z轴层扫形式呈现于补充视频S7、补充视频S8、补充视频S9、补充视频S10和补充视频S11中。该实验表明，共聚焦延时成像在追踪单个细胞侵袭行为方面优于宽场荧光成像。在这些条件下，U-118/L1LE细胞的侵袭性明显强于GSC细胞。这一点即使在静态图像中也清晰可见：GSC细胞主要位于中心区域，而U-118细胞则更为分散。
图7 展示了多个示例 离体 脑切片/类球体培养实验中，将两种分别标记的类球体（U-118/L1LE/mCherry 类球体和 GSC16-4/GFP 类球体）置于脑切片上，培养数天后固定，经层粘连蛋白免疫染色，并使用共聚焦显微镜进行光学切片成像。结果显示，两类细胞均侵入脑切片并沿血管迁移。当不同类型的类球体相互靠近至接触时，一种细胞类型侵入另一类球体内部的现象极少发生（若有也极为有限），两类球体仍保持分离状态。
图8 展示了多个示例 离体 脑切片/类球体培养实验中，将体外培养生成的“混合细胞类型”类球体（由不同标记的两种细胞类型组成：U-118/L1LE/mCherry 与 GSC16-4/GFP）放置于脑切片上，培养数天后固定，经层粘连蛋白免疫染色，并在共聚焦显微镜下进行光学切片成像。结果显示，红色标记的 U-118/L1LE/mCherry 细胞从类球体中迁移而出，扩散程度明显强于绿色标记的 GSC16-4/GFP 细胞，后者倾向于聚集在类球体中心区域。此外，U-118/L1LE/mCherry 细胞还用 DiD 进行染色，以便在固定样本中直接比较两种独立标记（mCherry 与 DiD） 离体 制备样品。即使在已侵入脑切片的单个细胞中，仍可检测到DiD标记，但表现为细胞内的点状结构。
图1E5期视顶盖注射GSCs后在E15期形成的肿瘤 体内. 由于表达GFP，GSC呈绿色。GSC15-2细胞显示在各图中 A, C，和 E，GSC16-4细胞显示在各图中 B, D，和 F. (A低倍镜下视顶盖图像，显示靠近脑室（V）处有肿瘤。Sox2染色呈红色，可标记视顶盖细胞的大部分细胞核。B）与相似的图像 A 但使用了GSC16-4细胞，该细胞还用红色标记了巢蛋白（nestin），由于颜色叠加和图像曝光，巢蛋白在图像中可能呈现黄色或白色。OT细胞核因使用双苯并咪唑（bisbenzimide）复染而呈现白色。C-F) 使用60倍油镜物镜获取z轴层扫数据后生成的体积渲染图像的不同视角。细胞核因Hoechst染色呈白色，部分图中显示为红色 C 和 E 由于Sox2免疫染色所致。图中红色染色 D 和 F 来自巢蛋白（nestin）染色。需要注意的是，由于共聚焦显微镜软件中体积渲染使用了“Alpha混合”（Alpha Blending），颜色的混合方式不同于最大强度投影，颜色中占主导地位者会掩盖较弱的颜色。血管因层粘连蛋白（laminin）免疫染色呈白色。GSC标志物整合素α-6（integrin alpha-6）染色呈蓝色，在GSC表面表现为点状分布。体积渲染图边缘标有微米比例尺。各图面板中体积渲染的旋转视频 C-F 呈现在 补充视频 S1, 补充视频 S2, 补充视频 S3，以及 补充视频 S4比例尺 = 500 µm (A，B缩写：GSCs = 胶质母细胞瘤干细胞；OT = 视顶盖；GFP = 绿色荧光蛋白；BV = 血管 请点击此处以查看该图的放大版本。
图 2：在 E5 期视顶盖注射 GSCs 与 U-118 GBM 细胞混合物后，E15 期形成的肿瘤。 GSCs 因表达 GFP 呈绿色，U-118/L1LE 细胞因表达 mCherry 呈红色。GSC15-2 显示于图 A-D，GSC16-4 显示于图 E 和 F。A）靠近脑室的混合细胞肿瘤（箭头）的低倍共聚焦单 z 平面图像。细胞核用 bisbenzimide 染成白色。B）图 A 中肿瘤的高倍放大图像（10x 物镜），显示红色 U-118 细胞侵入靠近脑室表面的视顶盖（OT）。C）与图 A 不同光学切面的图像，显示肿瘤（箭头）更深地嵌入视顶盖壁内。D）图 C 中肿瘤多个 z 平面的最大投影图像（20x 物镜），展示肿瘤内细胞分选的细节。E）GSC16-4 细胞形成的混合肿瘤的单 z 平面图像（20x 物镜），显示肿瘤内细胞分选模式与 GSC15-2 细胞相反：绿色 GSCs 在红色 U-118 细胞周围形成一层薄而均匀的皮层。该 z 平面未显示肿瘤与视顶盖壁的附着区域。注意肿瘤中 GSC 皮层出现不连续、U-118/L1LE 细胞向外突出的区域（箭头）。L1CAM 免疫染色呈蓝色。F）与图 E 相同的图像，但仅显示绿色 GSCs 与蓝色 L1CAM 染色。比例尺 = 500 µm（A、C），100 µm（B、D、E、F）。缩写：GSCs = 胶质母细胞瘤干细胞；OT = 视顶盖；GFP = 绿色荧光蛋白；V = 脑室。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3活力 离体 培养1周后的视顶盖切片 E14 视顶盖切片在膜插件上培养 1 周后，进行固定和免疫染色。图中所示为 A 和 B 是用双苯并咪唑（bisbenzimide）染色细胞核后获得的脑切片共聚焦图像（10倍物镜）A）并用层粘连蛋白进行免疫染色（B），这清楚地显示了通过层粘连蛋白染色在光学切片中以不同构型呈现的正常、完整的血管结构。C) 一幅共聚焦图像，与图中各面板所示图像类似 A 和 B 其中细胞核和层粘连蛋白染色均可见。D) 高倍放大（60倍油镜）共聚焦图像，显示细胞核和层粘连蛋白染色的细节。E共聚焦z轴层扫图像的最大投影（20倍物镜），脑切片经Sox2转录因子红色染色，以及用bisbenzimide标记的总细胞核呈白色。请注意，大多数细胞核均显示Sox2染色阳性 体内 （参见 图1). 比例尺 = 100 µm（A,B,C,E），25 µm（D）。缩写：P = 软脑膜表面。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4U-118/mCherry 细胞置入一个 离体 通过活检穿孔法获取脑组织切片。 使用1 mm活检打孔器在脑切片中创建空腔，然后将混合基质的红色U-118/L1LE/mCherry细胞植入作为空腔“塞”。数天后，脑切片经固定、 laminin免疫染色，并封片用于共聚焦显微镜分析。图示 A 和 C 显示低倍共聚焦单z平面图像（4倍物镜），呈现所形成的“肿瘤”及侵入脑切片的周围细胞。B) 对图层面板中样品的z轴堆栈进行体积渲染 A 在更高倍数（20倍物镜）下观察，显示U-118细胞广泛侵袭（箭头）。D图像显示了图中所示广泛侵袭细胞下部区域的类似体积渲染 C层粘连蛋白染色呈绿色，但未见明显血管结构。E图像显示了细胞栓的一部分以及侵入脑切片的细胞群，蓝色为血管的层粘连蛋白染色。F) 图中所示侵袭细胞的更高倍数放大图像 E，细胞沿血管排列的情况清晰可见（箭头所示）。所有图像均以双苯并咪唑进行细胞核的白色复染。比例尺 = 500 µm（A,C），100 µm（E,F）。图版比例尺 B 和 D 沿体积渲染轴方向。缩写：OT = optic tectum。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5：培养中的活细胞球体以及活体胶质母细胞瘤细胞的宽场荧光图像 离体 脑切片 如图所示 A 和 B 为使用倒置显微镜配备10倍物镜拍摄的U-118/L1LE胶质母细胞瘤细胞的相差图像（A）和GSCs（B) 以球状体形式生长（箭头所示）。图中背景显示 A 是细胞培养皿上聚-HEMA 涂层可能出现的离焦不均匀现象。如图中各面板所示 C-F 为在延时实验中监测U-118/L1LE细胞球体及侵袭细胞（箭头所示）活体侵袭行为的宽场荧光成像 离体 切片（使用定制的延时显微镜系统配备20倍物镜）18）。在图中各面板 C 和 E，细胞用远红外荧光膜染料DiD染色，图中各图面板 D 和 F，对细胞进行成像 通过 其红色 mCherry 表达。比例尺 = 100 µm。各图中展示的宽场荧光延时实验视频 C 和 D 位于 补充视频 S5 和 补充视频 S6分别。缩写：GBM = 胶质母细胞瘤；GSCs = 胶质母细胞瘤干细胞；S = 球状体。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图6：活体GSCs与GBM细胞共聚焦4D延时成像的体积渲染图像。 所有图中展示的是在不同脑切片上移植的五种不同混合细胞球体共培养体系的终点图像。图A–E中，共聚焦z轴层扫图像在20小时时间内每隔10分钟以10 µm步长采集一次。实验样本包括植入了红色U-118/L1LE/mCherry细胞和绿色GSC16-4/GFP细胞混合球体的脑切片。共聚焦图像采集时，脑切片被培养在6孔塑料细胞培养板中的膜插件上，使用超长工作距离（ELWD）20倍物镜（0.45 NA），以提供所需的工作距离。体积渲染图像通过共聚焦显微镜软件“Alpha Blending”生成，呈现出明显的三维效果。这些共聚焦体积渲染图像随时间变化的延时视频见于补充视频S7、补充视频S8、补充视频S9、补充视频S10和补充视频S11。缩写：GBM = 胶质母细胞瘤；GSCs = GBM干细胞；GFP = 绿色荧光蛋白；NA = 数值孔径。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：来源于不同类型细胞球的侵袭性胶质母细胞瘤细胞在固定脑切片上的共聚焦图像。 绿色细胞球由GSC16-4/GFP细胞组成，红色细胞球由U-118/L1LE/mCherry细胞组成。图中A–F展示了在多个红色和绿色细胞球接种数天后，经固定并进行层粘连蛋白（蓝色）免疫染色的脑切片的不同视图。图A–C为同一视顶盖（OT）切片的不同图像，其中图A使用4倍物镜拍摄，图B和图C为图A中两个细胞球侵入脑切片的细胞区域的高倍体积重建图像（20倍物镜）。两种细胞类型均明显沿血管侵袭组织。图D显示另一脑切片的体积重建图像（20倍物镜），其中两个不同颜色的细胞球彼此靠近，来自两个细胞球的细胞均沿位于二者之间的同一血管迁移（箭头）。图E为高倍（60倍油镜）体积重建图像，显示绿色细胞沿血管外表面迁移，而红色细胞则在血管内部迁移（箭头）。插图为单个z平面光学切片，其中红色细胞被血管的蓝色染色完全包围（箭头），而绿色细胞明显位于血管外部。插图中的比例尺 = 50 µm。图F为前脑切片的体积重建图像（10倍物镜），其中两个不同颜色的细胞球紧密相邻。极少甚至没有细胞从一个细胞球侵入另一个细胞球，二者之间存在清晰的边界。图A、B、C和E还显示了使用bisbenzimide进行的白色细胞核复染。比例尺 = 500 µm（A）。图B–F的比例尺沿体积重建图像的坐标轴显示。缩写：GBM = 胶质母细胞瘤；GSCs = 胶质母细胞瘤干细胞；GFP = 绿色荧光蛋白；OT = 视顶盖。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8：来自混合细胞球体及经DiD标记的球体的侵袭性胶质母细胞瘤（GBM）细胞在固定脑切片中的共聚焦图像。 图A-D展示了含有混合细胞球体的脑切片的体积渲染图像，该球体由绿色标记的GSC16-4/GFP细胞和红色标记的U-118/L1LE/mCherry细胞组成。大量红色的U-118细胞从球体中分散并朝各个方向侵入脑切片，而绿色的胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）则未发生分散，仍停留在球体中心位置。图E和F展示了一个ex vivo脑切片样本，其中红色U-118/L1LE/mCherry细胞球体还被远红膜染料DiD标记（显示为蓝色）。固定后，切片经免疫染色以显示绿色的层粘连蛋白。DiD标记在红色细胞中表现为点状染色（箭头所示），即使是在沿血管从球体分散出去的细胞中仍可见。本图未显示Hoechst（bisbenzimide）核复染结果，以便更清晰地观察其他染色信号。比例尺 = 100 µm（E、F）。缩写：GBM = 胶质母细胞瘤；GSCs = 胶质母细胞瘤干细胞；GFP = 绿色荧光蛋白。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 培养基/溶液 | 成分 | ||
| GSC 培养基 | DMEM/F12（1:1 混合），1% 胎牛血清（FBS），15 mM HEPES 缓冲液，2 mM L-谷氨酰胺，100 µg/mL 青霉素-链霉素（pen/strep），2% 不含维生素 A 的 B27 添加剂，以及 2.5 µg/mL 肝素。 | ||
| GBM 培养基 | DMEM（高糖），10% FBS，青霉素-链霉素（pen/strep），以及 2 mM L-谷氨酰胺。 | ||
| 固定缓冲液 | 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中含 2% 多聚甲醛（PFA） | ||
| 包埋介质 | PBS 中含 3.5% 琼脂和 8% 蔗糖 | ||
| PBSTG | PBS 中含 0.1% Triton X-100 和 5% 正常山羊血清（NGS） | ||
| U-118 MG 细胞培养基 | DMEM + 10% FBS + 青霉素-链霉素（pen/strep）+ L-谷氨酰胺 | ||
| 脑切片培养基 | 50% MEM + 25% HBSS + 25% 马血清 + B27 + 青霉素-链霉素（pen/strep）+ L-谷氨 + 15 mM HEPES 缓冲液 | ||
| 振动切片机切片介质 | Medium 199 + 青霉素-链霉素（pen/strep）+ 15 mM HEPES 缓冲液 | ||
表1：本实验方案中所用培养基与缓冲液的组成。
补充图1：向E5视顶盖注射。 (A) 在气室上方的蛋壳上开一个小孔，并用生理盐水或培养基润湿气室膜后，用精细镊子去除该膜。 (B) 为将细胞注射至视顶盖，需用精细镊子夹住并固定羊膜，以调整胚胎头部位置，使视顶盖易于接近；随后将微移液管插入视顶盖，并通过压力将细胞注入其中。 (C) 细胞注射完成后，使用注射器和细针向胚胎表面滴加数滴氨苄青霉素溶液。 请点击此处下载该文件。
补充图2：E15脑区的解剖。（A）断头后，将E15胚胎头部置于含有无菌CMF溶液的培养皿中。（B）使用精细镊子去除覆盖在脑组织表面的皮肤。（C）随后去除覆盖在两个前脑（FB）半球上方的颅骨骨片。（D）再用精细镊子轻轻去除包裹前脑（FB）、视顶盖和小脑周围的结缔组织硬脑膜。（E）使用弯头镊子从脑腔底部轻柔地将整个脑组织挖出，从而将其从头部取出。（F）图中显示的是已取出的完整脑组织的背侧观，包含前脑（FB）、视顶盖（OT）和小脑（CB）。（G）随后使用精细剪刀将分离的脑组织解剖为前脑（FB）、视顶盖（OT）半球和小脑（CB）部分。（H）再用精细镊子轻松去除视顶盖（OT）半球表面脆弱的结缔组织软脑膜。请点击此处下载该文件。
补充图3：E15视顶盖的包埋与切片以及细胞球体的放置。（A） 使用弯头镊子将一侧视顶盖半球浸入低熔点琼脂糖中。（B） 琼脂糖在冰上凝固后，将包含视顶盖的琼脂糖块修整，并黏附于切片盘中的不锈钢基座上。（C） 待胶水干燥后，将切片盘放入振动式组织切片机的卡盘中，并加入冷的切片培养基。随后使用蓝宝石刀从浸没的组织块上切割切片。切下的切片将漂浮至切片盘中，可用刮铲取出。（D） 将切下的切片从切片盘中取出，直接放置于多孔板内含有底层切片培养基的膜插件上。（E） 在聚HEMA包被的培养皿中培养细胞球体后，使用20 µL微量移液器吸取极少量培养基将一个球体从培养皿中取出。（F） 随后将分离的球体直接放置于脑片表面的少量培养基中。（G） 若因培养基流动导致球体从脑片上脱落，可使用黏附在木制涂药棒上的睫毛轻推，将其重新移回脑片上。请点击此处下载该文件。
补充视频 S1：E15 期小体积 GSC15-2 肿瘤的高倍率三维重建视频。 由于表达 GFP，GSC 呈绿色。该视频对应于图 1C，展示了 GSC15-2 细胞。视频显示的是使用 60 倍油镜物镜通过 z 轴层扫数据生成的三维重建图像的旋转过程。细胞核因 bisbenzimide 染色呈白色，部分细胞核因 Sox2 免疫染色呈红色。需要注意的是，由于共聚焦显微镜软件中体积渲染采用“Alpha 混合”模式，颜色不会像最大强度投影那样混合，而是强度较高的颜色占主导并遮蔽较弱的颜色。血管因层粘连蛋白（laminin）免疫染色呈白色。GSC 标记物整合素 alpha-6 的染色呈蓝色，分布在绿色 GSC 表面，呈点状。微米标尺显示在体积重建图像的边缘。请点击此处下载该视频。
补充视频 S2：E15 期小体积 GSC16-4 肿瘤的高倍率三维重建视频。 由于表达 GFP，GSC 呈绿色。该视频对应于图 1D，展示了 GSC16-4 细胞。视频显示的是使用 60 倍油镜物镜通过 z 轴层扫数据生成的三维重建图像的旋转过程。细胞核因 bisbenzimide 染色而呈白色，部分 GSC 因 nestin 免疫染色而呈红色。需要注意的是，由于共聚焦显微镜软件中三维重建采用“Alpha Blending”模式，颜色不会像最大强度投影那样混合，而是强度较高的颜色占主导并遮蔽较弱的颜色。血管因 laminin 免疫染色而呈白色。GSC 标志物整合素 alpha-6 的染色呈蓝色，分布在绿色 GSC 表面，呈点状。微米标尺显示在三维重建图像的边缘。请点击此处下载该视频。
补充视频 S3：E15 时期小 GSC15-2 肿瘤的高倍体积渲染视频。 由于表达 GFP，GSC 呈绿色。该视频对应于 图 1E，展示了 GSC15-2 细胞。视频显示了使用 60 倍油镜物镜通过 z 轴层扫数据生成的体积渲染图像的旋转过程。细胞核因 bisbenzimide 染色呈白色，部分细胞核因 Sox2 免疫染色呈红色。需要注意的是，由于共聚焦显微镜软件中体积渲染采用“Alpha Blending”模式，颜色不会像最大强度投影那样混合，而是强度较高的颜色占主导并遮蔽较弱的颜色。血管因层粘连蛋白（laminin）免疫染色呈白色。GSC 标记物整合素 alpha-6 的染色呈蓝色，分布在绿色 GSC 表面，呈点状。体积渲染图像边缘标有微米刻度尺。请点击此处下载该视频。
补充视频 S4：E15 时期小体积 GSC16-4 肿瘤的高倍率三维重建视频。 由于表达 GFP，GSC 呈绿色。该视频对应于图 1F，展示了 GSC16-4 细胞。视频显示的是使用 60 倍油镜物镜通过 z 轴层扫数据生成的三维重建图像的旋转过程。细胞核因 bisbenzimide 染色呈白色，部分细胞核因 nestin 免疫染色呈红色。需要注意的是，由于共聚焦显微镜软件中体积渲染采用“Alpha 混合”模式，颜色不会像最大强度投影那样混合，而是强度更高的颜色占主导并遮蔽较弱的颜色。血管因 laminin 免疫染色呈白色。GSC 标记物整合素 alpha-6 的染色呈蓝色，分布在绿色 GSC 表面，呈点状。微米标尺显示在体积重建图像的边缘。请点击此处下载该视频。
补充视频 S5：活体GBM细胞的视频 离体 脑切片 视频对应于 图5C 并展示在延时实验过程中U-118/L1LE细胞球体及侵袭细胞的宽场荧光图像，用于监测细胞侵袭的活体行为 离体 使用定制的延时显微镜系统（20倍物镜）进行切片观察。U-118/L1LE细胞用远红荧光膜染料DiD进行染色。图像由单色相机采集。 请点击此处下载该视频。
补充视频 S6：活体GBM细胞的视频 离体 脑切片 视频对应于 图 5D 并展示在延时实验过程中U-118/L1LE细胞球体及侵袭细胞的宽场荧光图像，以监测其向周围侵袭的活细胞行为 离体 切片（使用定制的延时显微镜系统配备20倍物镜）。对细胞进行成像 通过 它们的红色mCherry表达。图像使用黑白相机采集。 请点击此处下载该视频。
补充视频 S7：活体 GSC 和 GBM 细胞共聚焦 4D 时间序列的体渲染图像视频。 该视频对应于图 6A。在 20 小时的时间内，每 10 分钟以 10 µm 的步长采集共聚焦 z 轴层扫图像。实验材料为脑切片，其中植入了由红色 U-118/L1LE/mCherry 细胞和绿色 GSC16-4/GFP 细胞组成的混合细胞球。共聚焦图像采集时，脑切片被培养在 6 孔塑料细胞培养板中的膜插件上，使用 ELWD 20× 物镜（0.45 NA），该物镜提供了所需的额外工作距离。体渲染图像通过共聚焦显微镜软件“Alpha Blending”生成，可呈现明显的 3D 效果。体渲染图像边缘标有微米刻度尺。建议通过手动前后拖动视频播放器中的进度条来观察细胞运动，而不是让视频以正常较慢速度自动播放，以获得最佳观察效果。请点击此处下载该视频。
补充视频 S8：活体 GSC 和 GBM 细胞共聚焦 4D 时间序列的体渲染图像视频。 该视频对应于图 6B。在 20 小时的时间内，每隔 10 分钟以 10 µm 的步长采集共聚焦 z 轴层扫图像。实验材料为脑切片，其中植入了由红色 U-118/L1LE/mCherry 细胞和绿色 GSC16-4/GFP 细胞组成的混合细胞球。共聚焦图像采集时，脑切片被培养在 6 孔塑料细胞培养板中的膜插件上，使用 ELWD 20× 物镜（0.45 NA），该物镜提供了所需的额外工作距离。体渲染图像通过共聚焦显微镜软件中的“Alpha Blending”模式生成，可呈现明显的 3D 效果。体渲染图像边缘标有微米刻度尺。建议通过手动前后拖动视频播放器中的进度条来观察细胞运动，而不是让视频以正常慢速自动播放，以便更清晰地观察动态过程。请点击此处下载该视频。
补充视频 S9：活体 GSC 和 GBM 细胞共聚焦 4D 延时成像的体渲染视频。该视频对应于图 6C。在 20 小时的时间内，每隔 10 分钟以 10 µm 的步长采集共聚焦 z 轴层扫图像。实验材料为脑切片，其中植入了由红色 U-118/L1LE/mCherry 细胞和绿色 GSC16-4/GFP 细胞组成的混合细胞球。共聚焦图像采集时，脑切片被培养在 6 孔塑料细胞培养板中的膜插件上，使用 ELWD 20× 物镜（0.45 NA），该物镜提供了所需的额外工作距离。体渲染图像通过共聚焦显微镜软件的“Alpha Blending”模式生成，呈现出明显的 3D 效果。体渲染图像边缘标有微米刻度。建议通过手动前后拖动视频播放器中的进度条来观察细胞运动，而不是让视频以正常慢速自动播放，以获得最佳观察效果。请点击此处下载该视频。
补充视频 S10：活体 GSC 和 GBM 细胞共聚焦 4D 延时成像的体渲染视频。 该视频对应于 图 6D。在 20 小时内，每隔 10 分钟以 10 µm 的步长采集共聚焦 z 轴层扫图像。实验材料为脑切片，其中植入了由红色 U-118/L1LE/mCherry 细胞和绿色 GSC16-4/GFP 细胞组成的混合细胞球。共聚焦图像采集时，脑切片被培养在 6 孔塑料细胞培养板中的膜插件上，使用 ELWD 20× 物镜（0.45 NA），该物镜提供了所需的额外工作距离。体渲染图像通过共聚焦显微镜软件中的“Alpha Blending”模式生成，可呈现明显的 3D 效果。体渲染图像边缘标有微米刻度尺。建议通过手动前后拖动视频播放器中的进度条来观察细胞运动，而不是让视频以正常慢速自动播放，以便更清晰地观察。请点击此处下载该视频。
补充视频 S11：活体 GSC 和 GBM 细胞共聚焦 4D 延时成像的体渲染视频。 该视频对应于 图 6E。在 20 小时的时间内，每隔 10 分钟以 10 µm 的步长采集共聚焦 z 轴层扫图像。实验样品包含植入了混合细胞球体的脑切片，其中含有红色的 U-118/L1LE/mCherry 细胞和绿色的 GSC16-4/GFP 细胞。共聚焦图像采集时，脑切片被培养在 6 孔塑料细胞培养板中的膜插件上，使用 ELWD 20× 物镜（0.45 NA），该物镜提供了所需的额外工作距离。体渲染图像通过共聚焦显微镜软件中的“Alpha Blending”模式生成，可呈现明显的 3D 效果。体渲染图像边缘标有微米刻度尺。建议通过手动前后拖动视频播放器中的进度条来观察细胞运动，而不是让视频以正常慢速自动播放，以便更清晰地观察动态过程。请点击此处下载该视频。
讨论
向中脑（视顶盖）脑室注射细胞的实验方案中，关键步骤包括：在注射前和注射过程中，避免损伤卵内或胚胎周围的绒毛尿囊膜上的血管；尽管如此，在向中脑注射细胞时，可轻轻牵拉并固定紧贴胚胎的羊膜以调整头部位置。羊膜相对坚韧，可用精细镊子牵拉，并用一只手固定头部使其保持稳定，以便另一只手将细胞注射至视顶盖——即位于大脑中央的大型圆形结构。通常情况下，注射后胚胎的存活率在25%至75%之间，具体取决于尚不明确的因素；而几乎所有存活的胚胎均会在视顶盖中至少形成一个小肿瘤。制备可存活脑切片的关键步骤包括：吸去组织表面多余的液体，以确保在切片过程中琼脂糖能够牢固黏附脑组织，并在将组织放置到膜插件之前始终保持组织和切片处于低温状态。由于不同细胞类型形成球状体的速度和大小各不相同，因此应在聚HEMA板上接种的细胞密度以及收获球状体前的培养时间方面，针对每种细胞类型进行优化。
本文中的研究尚未经过正式的脑片存活性纵向研究。Yang 等人使用了与本研究类似的鸡胚脑片培养体系，并证明脑片至少在7天内保持良好的存活性16。先前的研究表明，当视顶盖（OT）组织被置于次优培养基中时，组织中会出现大量固缩核，而本研究中的脑片未出现此现象。此外，当脑片在次优条件下发生退化时，血管会断裂并呈现为成排的层粘连蛋白阳性球状结构（未展示）。因此，尽管本研究未通过膜片钳电生理记录或活化型caspase-3表达等方法检测细胞活性，但在次优培养条件下所观察到的各类细胞死亡指标在本研究中均未出现。
OT 一直受到关注 体内 脑肿瘤实验通常选择该区域，因为其脑室最大且最易于注射。在胚胎发育第5天（E5），胚胎体积仍足够小，可稳定停留在卵黄表面进行操作，此时所有脑区仅由一层薄薄的室管膜区构成，因此注射必须进入脑室。尽管如此，此类注射仍能成功形成包埋性肿瘤，且肿瘤细胞可侵袭脑实质。有时可在端脑或小脑中发现所形成的肿瘤，但这种情况并不常见。 离体 E15视顶盖切片在此主要用于实验，以便 离体 共培养结果可与 体内 注射实验。然而，前脑切片同样适用，且表面积更大，脑室较视顶盖更薄，这可能使前脑更适用于 离体 未与之相关联的共培养 体内 注射
已在此证明 体内 注射后进行组织固定，利用振动切片机制备组织切片，并对层粘连蛋白及其他标记物进行免疫染色，从而获得了脑组织中靠近血管的胶质母细胞瘤细胞（GBM细胞）和胶质瘤干细胞（GSCs）的高分辨率图像。通过共聚焦显微镜的z轴层扫图像，依据共聚焦软件及制造商的操作说明生成三维体积重建图像，显著提高了对肿瘤细胞与血管之间相互关系的分析能力。利用宽场荧光显微镜对表达GFP、mCherry及DiD标记的细胞进行活细胞延时成像具有可行性；然而，靠近高荧光强度类球体的迁移细胞有时会被其荧光信号遮蔽 "发光" 从类球体产生的非特异性背景荧光可通过仔细调整宽场成像的曝光时间在一定程度上减轻。使用共聚焦z轴层扫进行随时间推移的延时成像（4D）可完全消除类球体的离焦光晕，获得背景清晰黑暗、迁移细胞轮廓分明的高质量图像。尽管该方法未在原实验方案中描述，但其操作方式与宽场延时成像类似，均在脑切片置于6孔塑料板中的透明膜插件上进行。虽然共聚焦延时成像能够显著提高单个细胞及其行为的图像清晰度，但一项多点延时实验（在20小时期间，每隔10分钟采集每个位点包含10个z平面的z轴层扫数据）会对扫描头的检流计造成较大负担。鉴于此类使用可能显著缩短检流计的使用寿命，该方法需谨慎使用。
尽管鸡胚系统非常适用于两者 体内 注射和 离体 研究胶质母细胞瘤细胞行为的共培养实验中，该模型系统存在若干局限性。与所有异种移植系统一样，人类细胞被植入的环境并非人类大脑，但胶质母细胞瘤细胞的行为似乎与啮齿类动物模型及人类患者中的表现相似。在完成相关操作后 体内 在E5期进行注射实验时，通常允许肿瘤形成10天，至E15期结束。这段时间显然不足以研究肿瘤发生和细胞侵袭的全部过程。然而，本文已证明，在相对较短的时间内，脑实质中可形成实体瘤，肿瘤细胞在瘤体内相互作用并重新排列，且沿血管及弥散性地发生显著的脑组织侵袭。另一项局限性在于 体内 鸡胚系统不适合进行药物或其他处理，原因在于鸡胚发育过程中存在较大的卵黄以及功能性胚外循环系统。局部液体药物处理会导致药物扩散至体积大得多的卵黄部分，从而使得脑组织中的药物浓度高度可变且无法确定。同样，将药物通过静脉注射进入极为脆弱的胚外循环系统时，药物会从血管中渗漏或扩散出去，同样导致脑内药物浓度不可控。这也是该系统的主要局限性之一。 离体 采用脑片培养方法，以便不仅能够观察和追踪细胞行为 通过 延时显微镜，以及在培养皿中成功改变胶质母细胞瘤细胞行为的处理方法4 可以在更相关的脑组织环境中进行测试。
鸡胚原位脑肿瘤模型系统的建立被视为对现有胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤形成及侵袭性细胞行为研究体系和工具的重要补充。受精鸡卵在大多数地区都容易获得，且相比啮齿类动物成本低廉，无需动物饲养费用，胚胎具有很强的抗感染能力和韧性（即大部分操作可在实验台上进行），胚胎易于操作并可进行无壳培养19，此外，根据美国国立卫生研究院（NIH）指南，鸡胚不被视为脊椎动物，因此无需经过IACUC审批（具体机构要求可能有所不同）。因此，若研究问题和实验设计在其适用范围之内，该系统所具备的多种优势使其极具吸引力。已有多个研究团队利用鸡胚开展了GBM细胞的相关研究，但这些研究几乎均使用鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 或肢芽30，而非脑组织。此外，曾有研究报道在胚胎发育第2天（E2）将髓母细胞瘤植入鸡胚脑内31。毫无疑问，如本文所述，将鸡胚用作原位异种移植模型系统，相较于使用CAM模型，所得结果将更贴近人类GBM肿瘤生物学特性，具有更高的研究意义。
尽管这些研究才刚刚开始充分运用鸡胚脑肿瘤模型系统来研究人类胶质母细胞瘤（GBM）细胞和胶质母细胞瘤干细胞（GSC）的行为，但仍希望其他研究者能够拓展其应用范围，并发现更多潜在用途。可以预见，该系统不仅将揭示调控GBM肿瘤形成及细胞行为的机制，还能实现对特定药物和物质在特定患者细胞上的临床前测试。例如，若提前建立脑切片培养体系，则可将肿瘤细胞、手术切除的肿瘤组织碎片或患者来源的GBM类器官32直接置于体外（ex vivo）共培养体系中，并在数天内评估不同治疗方案的效果。同样，也可将解离的患者来源细胞直接注射到E5期鸡胚中脑组织中（in ovo），以评估其成瘤能力及对脑实质的侵袭性。因此，期望本文对方法及代表性结果的描述能够促进并鼓励更广泛地使用这一尚未被充分利用的系统，以推动脑癌研究的发展。
披露
所有作者均无利益冲突。
致谢
本工作部分由美国国家癌症研究所向 D.S.G. 提供的资助（R03CA227312）以及 Lisa Dean Moseley 基金会的慷慨资助支持。活体胶质母细胞瘤样本经患者知情同意后，通过 Helen F. Graham 癌症中心与研究所的组织获取中心获得。对 A.R. 的资助由美国国立卫生研究院国家研究资源中心和国家转化科学促进中心提供（UL1TR003107）。N.P.、A.L.、Z.W. 和 K.S. 的暑期本科生研究奖学金由特拉华大学本科生研究项目提供。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 cm x 1 cm 方形孔打孔器 | Birabira | N/A | |
| 1 mm 活检打孔笔 | Robbins Instruments | 20335 | |
| 6 孔插件板（Corning Transwell） | Millipore Sigma | CLS3450 | |
| 9" 一次性巴斯德吸管 | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| 15 mL 离心管 | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| 24 孔板 | Corning Costar | 3526 | |
| 50 mL 离心管 | Fisher Scientific | 05-539-9 | |
| 琼脂 | Fisher BioReagents | BP1423-500 | 用于包埋固定脑组织 |
| Alexa Fluor 488 标记的羊抗小鼠 IgG | Jackson Immunoresearch | 115-605-146 | |
| Alexa Fluor 647 标记的羊抗小鼠 IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-146 | |
| 铝箔 | ReynoldsWrap | N/A | |
| 氨苄青霉素 | Sigma Aldrich | A-9518 | |
| 抗整合素 α-6 单克隆抗体 GOH3 | Santa Cruz Biotechnology | sc-19622 | |
| 抗 L1CAM 单克隆抗体 UJ127 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53386 | |
| 抗层粘连蛋白单克隆抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| 抗巢蛋白单克隆抗体 10c2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
| 抗 Sox2 单克隆抗体 E-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
| 不含维生素 A 的 B27 添加剂 | GIBCO | 17504-044 | |
| 双苯并咪唑（Hoechst 33258） | Sigma-Aldrich | B2883 | 核染色剂 |
| 细胞培养箱 | Forma | 标准加湿 CO2 培养箱 | |
| 离心机 | Beckman Coulter | ||
| 共聚焦显微镜 | Nikon Instruments | C2si+ | 配备自制细胞培养室 |
| 共聚焦显微镜物镜 | Nikon Instruments | Plan Apo 物镜，共聚焦延时成像除外，使用 S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA 物镜 | |
| 共聚焦显微镜软件 | Nikon Instruments | NIS Elements | 版本 5.2 |
| 弯头镊子 | World Precision Instruments | 504478 | |
| 弯头剪刀 | Fine Science Tools | ||
| 弯头刮勺 | Fisher Scientific | 14-375-20 | |
| 氰基丙烯酸酯胶水 | Krazy Glue | KG-585 12R | |
| D-葡萄糖 | Millipore Sigma | G8270 | |
| DiD 远红荧光染料 | Invitrogen | V22887 | Vybrant DiD |
| DMEM | Sigma Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Sigma Aldrich | D8437 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
| 孵蛋器 | Humidaire | ||
| 电工胶带（10 mil 厚 / 254 µm） | Scotch | N/A | |
| 200 证明乙醇 | Decon Laboratories | 2701 | |
| 快绿 FCF 染料 | Avocado Research Chemicals | 16520 | |
| FBS | Gemini Bio-products | 900-108 | |
| 滤纸 | Fisher Scientific | ||
| 纱布 | Dynarex | 3353 | |
| 显微注射用玻璃毛细管 | World Precision Instruments | TW100-4 | |
| 甘油 | Fisher BioReagents | BP228-1 | 用于封片介质 |
| GSCs（人胶质母细胞瘤干细胞） | 不适用 | 从 Galileo 实验室患者 GBM 标本中分离，于 GSC 培养基中培养，并用编码 GFP 的慢病毒载体转导。 使用的细胞代数为第 10 至 30 代。 | |
| Hanks 平衡盐溶液（HBSS） | Corning | 21-020-CV | |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific | ||
| 肝素 | Fisher Scientific | BP2524-100 | |
| HEPES 缓冲液 | Sigma Aldrich | H0887 | |
| 马血清（HI） | Gibco | 26050-088 | |
| 人 FGF-2 | BioVision | 4037-1000 | |
| 人 TGF-α | BioVision | 4339-1000 | |
| 倒置相差显微镜 | Nikon Instruments | TMS | 用于常规观察培养细胞 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 | |
| 实验室封口膜 | Parafilm | ||
| Labquake 摇床 | LabIndustries | T400-110 | |
| L-谷氨酰胺:青霉素:链霉素 | Gemini Bio-products | 400-110 | |
| 低熔点琼脂糖 | Fisher Scientific | BP1360 | 用于包埋活体脑组织 |
| 基质胶 | Corning Matrigel | 354234 | |
| Medium 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| 金属振动切片机块 | |||
| 微量移液器吸头（20、200、1,000 µL） | Fisherbrand | ||
| 微量移液器（20、200、1,000 µL） | Gilson | ||
| 显微镜盖玻片（1.5 号厚度） | Fisherbrand | 12544A | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| NaH2PO4 + H2O | Fisher Scientific | S369 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328 | |
| 正常山羊血清 | Millipore Sigma | 526-M | |
| N-丙基没食子酸酯 | Sigma Aldrich | P3130 | 用于封片介质 |
| Parafilm | Parafilm | ||
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
| 铅笔 | |||
| 普通显微镜载玻片 | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| 塑料 35 mm 培养皿 | Becton Dickinson | 351008 | |
| 气动皮升泵 | World Precision Instruments | PV830 | |
| 聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯） （poly-HEMA） | Sigma Aldrich | P-3932 | |
| 双刃剃须刀片 | PACE | 用于切割固定脑切片 | |
| 蓝宝石刀 | Delaware Diamond Knives | 用于切割活体脑切片 | |
| 手术刀 | TruMed | 1001 | |
| 0.2 M pH 7.4 氰基乙酸钠缓冲液 | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| 振动切片机样品室 | 定制 | ||
| 体视解剖显微镜 | Nikon Instruments | SMZ1500 | 配备落射荧光装置 |
| 直头镊子 | World Precision Instruments | 500233 | |
| 直头剪刀 | Fine Science Tools | ||
| 蔗糖 | Mallinckrodt | 7723 | |
| 延时荧光显微镜（宽场荧光） | Nikon Instruments | TE2000-E | 配备自制细胞培养室（见 Fotos 等，2006） |
| 组织培养用聚苯乙烯培养皿 100 mm | Thermo Fisher Scientific | 130182 | 用于细胞培养 |
| 组织培养用聚苯乙烯培养皿 60 mm | Becton Dickinson | 353004 | 用于细胞培养 |
| 移液管 | American Central Scientific Co. | FFP011 | |
| 透明胶带 | Scotch | ||
| 吐温 X-100 | Sigma Aldrich | T-8787 | |
| 胰蛋白酶（0.25%）+ 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| U-118 MG 人胶质母细胞瘤细胞系 | ATCC | HTB-15 | 细胞经慢病毒载体转导，该载体编码 L1CAM 黏附蛋白的完整胞外域序列，随后再用编码 mCherry 的慢病毒载体 pUltra-hot 转导。 细胞代数未知。 |
| 真空泵 | Cole-Parmer | EW-07532-40 | "Air Cadet" |
| 振动组织切片机 | Vibratome | 3000 | 用于切割活体和固定脑切片 |
参考文献
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