本方案提供了一种针对混合物、连续型和分类研究因素的配方优化方法，可最大限度地减少实验设计构建中的主观选择。在分析阶段，采用了一种高效且易于使用的建模拟合流程。
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摘要
摘要
我们提出一种基于质量源于设计（Quality by Design, QbD）理念的方法，用于优化脂质纳米颗粒（LNP）配方，旨在为科研人员提供一个易于实施的工作流程。在这些研究中存在一个内在限制：可电离脂质、辅助脂质和聚乙二醇（PEG）化脂质的摩尔比总和必须为100%，这一混合物约束条件要求采用专门的实验设计与分析方法。本文聚焦于LNP设计优化中常用的脂质组分与工艺参数，通过采用空间填充设计（space-filling designs）并结合近期发展的自验证集成模型（self-validated ensemble models, SVEM）统计框架，提供了一套可避免传统混合-工艺实验在设计与分析中常见困难的操作步骤。该工作流程不仅能生成候选的最优配方，还能构建拟合统计模型的图形化汇总结果，从而简化对实验结果的解读。新识别出的候选配方可通过验证实验进行评估，也可选择性地纳入更全面的第二阶段研究中进一步验证。
引言
用于体内基因递送系统的脂质纳米颗粒（LNP）制剂通常包含四种类别的组分脂质，即离子化脂质、辅助脂质和聚乙二醇（PEG）脂质1,2,3。无论这些脂质是单独研究，还是与其他非混合因素同时研究，这些制剂的实验均需采用“混合物”设计，因为对于任一候选制剂而言，增加或减少其中任一种脂质的比例，必然导致其余三种脂质比例总和相应减少或增加。
为说明起见，假设我们正在优化一种脂质纳米颗粒（LNP）配方，该配方目前采用一个固定的配方组合，将作为基准进行比较。目标是最大化LNP的效力，其次力求最小化颗粒的平均粒径。实验中变化的研究因素包括四种组分脂质（可电离脂质、胆固醇、DOPE、PEG）的摩尔比例、N:P比、流速以及可电离脂质的类型。其中，可电离脂质和辅助脂质（包括胆固醇）的摩尔比例变化范围较宽，为10–60%，而PEG的比例在此示例中变化范围为1–5%。基准配方的具体组成以及其他因素的变化范围及其数值舍入精度详见补充文件1。本例中，科研人员能够在一天内完成23次实验运行（即23批独立的颗粒制备），并希望以此作为样本量，前提是满足最低要求。本实验的模拟结果见补充文件2和补充文件3。
Rampado 和 Peer4近期发表了一篇关于为优化纳米颗粒药物递送系统而设计实验的综述论文。Kauffman 等人5探讨了使用部分因子设计和确定性筛选设计6进行脂质纳米颗粒（LNP）优化的研究；然而，这类设计在处理混合约束时，若不采用效率较低的“松弛变量”（slack variables）7则无法实现，因此在存在混合因素时通常不被采用7,8。相反，能够纳入混合约束的“最优设计”（optimal designs）传统上被用于混合-过程实验9。这类设计针对研究因素的用户指定函数进行优化，仅当该函数准确反映研究因素与响应变量之间的真实关系时，才在某种意义下达到最优。需注意，文中“最优设计”与“最优配方候选物”（optimal formulation candidates）有所区别，后者指通过统计模型识别出的最佳配方。对于混合-过程实验，最优设计存在三个主要缺点。第一，若研究人员在设定目标模型时未能预见到研究因素之间的交互作用，则所得模型将存在偏差，可能导致筛选出的候选配方性能不佳。第二，最优设计通常将大部分实验点布置在因素空间的外边界上。在 LNP 研究中，若脂质或工艺参数处于极端水平时颗粒无法正确形成，则可能导致大量实验失败。第三，研究人员通常更倾向于在因素空间内部设置实验点，以便在不依赖模型的情况下直观了解响应曲面，并在因素空间此前未探索的区域直接观察实验过程。
另一种设计原则是采用空间填充设计，以在（混合物约束的）因子空间中实现近似均匀的覆盖10这些设计相对于最优设计牺牲了一定的实验效率9 （假设整个因子空间均可产生有效的配方）但在权衡中具备多项优势，适用于本应用场景。空间填充设计并不做任何 先验的 关于响应曲面结构的假设；这使其具有足够的灵活性，以捕捉研究因素之间未预期到的关系。这也简化了实验设计的生成过程，因为在调整所需试验次数时，无需对回归项的增减做出决策。当某些设计点（配方）导致配方失败时，空间填充设计能够对研究因素空间内失败边界的建模成为可能，同时还能在成功因素组合范围内支持对研究响应的统计建模。最后，因子空间内部的良好覆盖性允许在不依赖特定模型的前提下，对响应曲面进行图示化探索。
为了可视化混料-过程实验中的混料因子子空间，需使用特殊的三角形“三元相图”。图1说明了这种用法：在一个三维立方体中，三个组分各自可在0到1之间变化，其中满足各组分之和等于1这一约束条件的点以红色标出。该三组分混料约束将可行的因子空间缩减为一个三角形。在含有四种混料组分的脂质纳米颗粒（LNP）应用中，我们通过每次将两种脂质与一个代表其余脂质总和的“其他”轴进行组合，绘制六种不同的三元相图以表示整个因子空间。
图1：三角形因子区域。 在立方体内填充空间的图中，小的灰色点表示不符合混合约束的配方。较大的红色点位于立方体内接的一个三角形上，代表满足混合约束的配方。请点击此处查看此图的放大版本。
除了脂质混合物因素外，通常还存在一个或多个连续的工艺因素，例如 N:P 比值、缓冲液浓度或流速。也可能存在分类因素，例如可电离脂质类型、辅助脂质类型或缓冲液类型。目标是找到一种制剂（即脂质混合物及工艺参数的组合），以最大化某种效力指标和/或改善理化特性，例如减小粒径和多分散系数（PDI）、提高包封率，并减少副作用——如体重下降——在 体内 研究。即使从一个合理的基准配方开始，当遗传载荷发生变化，或考虑工艺参数或脂质类型改变时，也可能需要重新优化。
康奈尔大学7 为混合与混合-过程实验的统计学方面提供了权威论述，作者为 Myers 等。9 为优化提供了最相关混合设计与分析主题的出色总结。然而，这些著作可能使科研人员面临过多的统计学细节和专业术语。现代用于实验设计与分析的软件提供了一种稳健的解决方案，足以支持大多数脂质纳米颗粒（LNP）优化问题，而无需依赖相关理论。尽管更复杂或高优先级的研究仍可从与统计学家合作中受益，并可能采用最优设计而非空间填充设计，但我们的目标是提高科研人员的操作信心，鼓励在不依赖低效的每次改变一个因素（OFAT）测试的情况下对LNP配方进行优化11 或仅仅满足于首个符合规格的配方。
本文介绍了一种利用统计软件优化通用脂质纳米颗粒（LNP）配方问题的工作流程，按实际遇到的顺序解决设计与分析中的各项问题。事实上，该方法适用于一般的优化问题，并不仅限于LNP。在此过程中，本文还解答了若干常见问题，并基于实践经验与模拟结果提供了相应建议12。近期开发的自验证集成模型（self-validated ensemble models, SVEM）框架13显著改进了以往在分析混合-过程实验结果时较为脆弱的方法，本文采用该框架提出了一种简化的配方优化策略。尽管该工作流程以通用方式构建，可使用其他软件包实现，但JMP 17 Pro在提供SVEM以及我们发现对简化混合-过程实验复杂分析所必需的图形汇总工具方面具有独特优势。因此，实验方案中也提供了针对JMP的具体操作说明。
SVEM 采用与传统方法相同的线性回归模型基础，但使我们能够避免为拟合模型而需进行的繁琐修改 "完整模型" 通过使用前向选择或惩罚性选择（Lasso）基础方法来筛选候选效应。此外，SVEM 提供了改进的 "简化模型" 通过反复重新加权模型中每次运行的相对重要性，并对由此产生的预测模型进行平均，从而拟合出能够最小化数据中噪声（过程变异和分析变异）引入风险的结果。13,14,15,16,17,18SVEM 为混合-过程实验的建模提供了一个框架，该框架不仅比传统的单次回归方法更易于实施，而且能够生成更优的配方优化候选方案12,13SVEM 的数学细节超出了本文的范围，即使对其进行简要概述，也会偏离该方法在此应用中的主要优势：它为实践者提供了一种简单、稳健且准确的“一键运行”操作流程。
所展示的工作流程符合药物开发中的质量源于设计（Quality by Design, QbD）19 方法20。本研究的结果将有助于理解将物料属性和工艺参数与关键质量属性（critical quality attributes, CQAs）21 关联起来的功能关系。Daniel 等人22 讨论了在RNA平台生产中专门应用QbD框架的问题：我们的工作流程可作为该框架内的一个工具使用。
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方案
代表性结果部分所述实验是根据《实验动物护理和使用指南》进行的，并遵循本机构动物护理与使用委员会（IACUC）制定的指导原则。6至8周龄雌性Balb/C小鼠购自商业供应商。动物接受 随意摄取 标准饲料和水，饲养于标准条件下，光照/黑暗周期为12小时，温度为65-75 °F (~18-23 °C) 湿度为40-60%。
1. 记录研究目的、响应变量及影响因素
注意：本实验方案全程使用 JMP 17 Pro 进行实验设计与数据分析。其他等效软件可参照类似步骤操作。有关第 1 部分中所有操作步骤的示例和进一步说明，请参见补充文件 1。
- 在带有日期戳的文档中总结实验目的。
- 列出实验过程中将要测量的主要响应指标（CQAs）。
- 列出可能被测量的任何次要响应指标（例如，对理化性质的下游限制）。
- 列出可能与响应相关的工艺参数，包括与研究目的最相关的参数。
- 如果研究将持续多天，需包含一个以“天”为类别的“区组”因子。
注意：这可以平衡各天之间的因子设置，防止工艺均值的天间波动与研究因子发生混杂。 - 选择在研究中将要变动的因子以及将保持恒定的因子。
注意：使用风险优先级工具（如失效模式影响分析20）来选择最相关的因子子集（图2）。通常应允许所有脂质成分变动；尽管在某些预算受限的情况下，将PEG固定在特定比例是合理的。 - 确定各变动因子的变化范围及其相应的小数精度。
- 使用最小和最大经验法则确定研究设计的规模（即粒子的不同批次数量）。手动加入的对照基准运行不计入经验法则推荐的运行次数。
注意：以下经验法则假设响应为连续变量。最小经验法则假设在需要时可进行后续研究，并可对候选最优配方进行确认性实验。如果仅能进行确认性实验，则最好按照最大经验法则所建议的运行次数进行预算。对于二分类主要响应指标，应咨询统计学家以确定适当的运行次数。- 最小经验法则：每个混合因子分配三次运行，每个连续工艺因子分配两次运行，每个分类因子的每个水平分配一次运行。
注意：对于包含四个脂质因子、两个连续因子和一个三水平分类工艺变量的研究，建议的填充空间运行次数为 (3 × 4) + (2 × 2) + 3 = 19 次。如果预计某些运行可能因配方或测量问题而失败，应额外增加运行次数。 - 最大经验法则：启动用于构建最优设计的软件，输入构建二阶模型所需的参数（包括主效应、所有效应间的两两交互作用，以及连续工艺因子的二次效应），并根据软件算法计算最小运行次数。将软件得出的结果加1，即为最大经验法则所建议的运行次数。
注意：详细操作步骤请参见补充文件1。一个包含四个脂质因子、两个连续因子和一个三水平分类工艺变量的示例案例，推荐的运行次数为34次（软件建议33次 + 1）。超出此数量的运行次数更宜用于确认性或后续研究。
- 最小经验法则：每个混合因子分配三次运行，每个连续工艺因子分配两次运行，每个分类因子的每个水平分配一次运行。
图2：因果关系图。 该图展示了脂质纳米颗粒（LNP）制剂优化问题中的常见影响因素。请点击此处查看此图的放大版本。
2. 使用空间填充设计创建设计表
- 打开 JMP，通过菜单栏导航至 DOE > Special Purpose > Space Filling Design。
- 输入研究响应变量（参见 补充文件 1）。
- 可选：点击 添加响应 添加额外响应变量的列，并指明每个响应是需最大化、最小化还是设定目标值。
注意：这些设置可后续修改，且不影响实验设计。同样，也可在创建设计表后添加额外响应变量的列。 - 输入研究因素及其相应范围。使用 混合物 按钮添加混合物因素，使用 连续型 按钮添加连续型因素，或使用 类别型 按钮添加类别型因素。
注意：本示例研究使用 图 3 所示的因素及范围，包括可电离脂质摩尔比（0.1 至 0.6）、辅助脂质摩尔比（同样为 0.1 至 0.6）、胆固醇摩尔比（0.1 至 0.6）、PEG 摩尔比（0.01 至 0.05）以及可电离脂质类型（可为 H101、H102 或 H103）。 - 在 运行次数 字段中输入预先确定的设计运行数。
- 可选：通过 空间填充设计 标题旁的红色三角形菜单，在 高级选项 子菜单中将 平均聚类大小 从默认值 50 增加至 2000。
注意：这是空间填充算法的一个设置，可略微改善设计构建质量，但会增加计算时间。 - 生成所选因素和运行规模的空间填充设计表。点击 快速灵活填充，然后点击 生成表格。
注意：图 4 展示了某示例设计的前两次运行。 - 在表中添加一列 备注，用于标注任何手动创建的运行。双击第一个空白列标题以添加新列，然后双击新列标题以编辑其名称。
- 如适用，将基准对照运行手动纳入设计表中。为其中一个对照基准添加一个重复。在 备注 列中标注基准名称，并对基准重复行进行颜色编码，以便于图表识别。
- 通过双击第一个空白行标题添加新行，并输入基准因素设置。复制该行以创建基准的重复。选中这两行，然后导航至 行 > 颜色 以分配颜色，便于绘图。
注意：该重复可提供过程与分析变异的模型无关估计值，并为图形分析提供额外洞察。
- 通过双击第一个空白行标题添加新行，并输入基准因素设置。复制该行以创建基准的重复。选中这两行，然后导航至 行 > 颜色 以分配颜色，便于绘图。
- 若任何基准对照运行超出研究因素的范围，应在“备注”列中注明，以便后续分析时排除。
- 将混合物因素四舍五入至适当的精度。操作步骤如下：
- 选中混合物因素的列标题，右键单击其中一个列标题，导航至 新建公式列 > 变换 > 四舍五入…，输入正确的舍入间隔，然后点击 确定。
- 点击行与列标题交汇处的底部三角形，确保未选中任何行。
- 从新生成的四舍五入列中复制数值（Ctrl + C），粘贴（Ctrl + V）至原始混合物列中。最后，删除临时的四舍五入值列。
- 四舍五入脂质比例后，验证其总和是否等于 100%：选中混合物因素的列标题，右键单击其中一个，选择 新建公式列 > 合并 > 求和。若任一行的总和不等于 1，则手动调整其中一个混合物因素，确保该因素设置仍在其范围内。调整完成后删除求和列。
- 参照对混合物因素四舍五入的方法，对工艺因素进行四舍五入，使其符合各自精度要求。
- 将脂质列格式化为显示指定小数位数的百分比：选中列标题，右键单击，选择 标准化属性...。在下一个窗口中，将 格式 设为 百分比，并根据需要调整小数位数。
- 若添加了手动运行（如基准运行），需重新随机化表格行顺序：添加一列随机值（右键单击最后一列标题，选择 新建公式列 > 随机 > 正态随机）。通过右键单击该列标题，按升序排列此列，然后删除该列。
- 可选：添加一列 运行 ID。用当前日期、实验名称和表格中的行号填充该列。
注意：示例参见（图 5）。 - 生成三元图以可视化脂质因素上的设计点分布（图 6）。同时检查运行在工艺因素上的分布情况（图 7）：选择 图形 > 三元图。仅将混合物因素选为 X，作图 变量。
- 为检查工艺因素上的分布情况，选择 分析 > 分布，并将工艺因素输入至 Y，列。
注意：制剂科学家应确认所有运行的可行性。若存在不可行的运行，应考虑新发现的约束条件，重新设计实验。
图3：研究因素及范围。 实验软件中设置界面的截图有助于复现实验配置。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：空间填充设计的初始输出结果。 显示表格的前两行，需将参数设置四舍五入至所需的有效位数，同时确保脂质组分的总量之和为 1。基准组已手动添加至表格中。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：格式化后的研究表格。 因素水平已进行四舍五入和格式化处理，并添加了运行编号（Run ID）列。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：三元相图上的设计点。 23种制剂以相应的可电离脂质、辅助脂质和“其他”（胆固醇+PEG）的摩尔比例表示。中心的绿色点代表基准摩尔比33:33:33:1，即电离脂质（H101）:胆固醇:辅助脂质（DOPE）:PEG。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：实验中非混合过程因素的分布情况。 直方图显示了实验运行在可电离脂质类型、N:P 比值和流速之间的分布情况。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 运行实验
- 按照设计表中提供的顺序进行实验，并将读数记录在实验表中已设置的列中。
- 若对同一批次的相同配方进行了多次相同响应的检测，需计算该批次内各检测结果的平均值。为每次检测的测量值在表格中新增一列。
- 为获得平均值，选中所有相关列，右键单击其中一个选中的列标题，然后选择 新建公式列 > 合并 > 平均值。在后续的响应分析中使用该 平均值 列。
注意：若未重新开始配方制备，重复的检测仅反映检测本身的变异，不能视为独立的重复实验。
- 为获得平均值，选中所有相关列，右键单击其中一个选中的列标题，然后选择 新建公式列 > 合并 > 平均值。在后续的响应分析中使用该 平均值 列。
- 对于配方中出现的沉淀或 体内 耐受性问题（如严重的体重下降或死亡），应针对每种问题类型在新列中使用二元（0/1）指标进行记录。
4. 分析实验结果
- 绘制读数并检查响应值的分布情况：打开 图表 > 图形构建器 并将每个响应拖入 Y 每个小区的面积。对所有响应变量重复此操作。
- 检查彩色编码的重复运行之间的相对距离，如果包含重复实验的话。这有助于理解在基准点处的总变异（包括过程变异和分析变异）与由于在整个因子空间内因子设置变化所引起的变异之间的关系。图8).
- 确定是否应对原始响应变量进行建模，或应使用某种变换。对于取值限制为正但上方无界的情况（例如，效价），将正态分布和对数正态分布分别拟合到实验结果中。如果对数正态分布的AICc（校正后的赤池信息准则）更低，拟合效果更优，则对该响应变量进行对数转换。
- 导航至 分析 > 分布 并选择响应以 Y，列在生成的分布报告中，单击响应名称旁边的红色三角形，然后选择 连续拟合 > 拟合正态分布 和 连续拟合 > 拟合对数正态分布 从下拉菜单中。在随后的 比较分布 报告中，检查 AICc 值以确定哪种分布对响应变量的拟合更优。
- 要执行对数变换，右键单击响应值列标题并选择 新公式列 > 日志 > 日志当构建模型并保存了对数尺度上的预测列后，通过选择将响应变量转换回原始尺度 新公式列 > 日志 > 实验.
- 对于介于 0 和 1 之间的比例型响应变量，比较正态分布与贝塔分布的拟合效果。若贝塔分布的 AICc 值较低，则进行 logit 变换。在响应变量的分布报告中选择 连续拟合 > 拟合正态分布 和 持续拟合 > 拟合 Beta.
- 对于logit变换，在数据表中右键单击响应列的列标题，然后选择 新公式列 > 专业领域 > Logit建模后，保存预测值列。为恢复至原始量级，请使用 新公式列 > 专业领域 > 逻辑斯蒂.
注意：基于回归的SVEM分析对偏离正态分布具有较强的稳健性 响应分布的正态性。然而，这些转换可使结果更易于解释，并改善模型的拟合效果。
- 对于logit变换，在数据表中右键单击响应列的列标题，然后选择 新公式列 > 专业领域 > Logit建模后，保存预测值列。为恢复至原始量级，请使用 新公式列 > 专业领域 > 逻辑斯蒂.
- 在三元相图上绘制运行点。根据响应值（或经过变换后的响应值，若已进行变换）为数据点着色：开放 图 > 三元相图仅选择混合因素 X，绘图. 右键单击任意一个生成的图表，选择 行图例 然后选择（已转换的）响应列。
注：根据响应对点进行着色，可提供一种与模型无关的视觉视角，用于观察行为与混合因素之间的关系。 - 删除 模型 由空间填充设计生成的脚本。
- 针对每个响应变量，分别建立其作为研究因素函数的独立模型，对每个响应变量重复执行以下步骤。
注意：如果存在次要二分类结局（例如制剂失败或小鼠死亡），也需对该结局进行建模。将目标分布设置从 正常 至 二项式. - 构建一个 "完整" 包含所有候选效应的模型。该模型应包括各因子的主效应、各因子间的二阶与三阶交互作用、过程因子中的二次项和部分三次项，以及混合因子的Scheffé三次项23,24.
注意：每次响应均需使用相同的一组候选效应。SVEM模型选择技术将独立优化每个响应的模型，可能为每个响应生成独特的简化模型。 图9 展示了其中一些候选效应。以下子步骤详细说明了该过程。- 选择 分析 > 拟合模型.
- 确保区组因素（例如，Day）不与其他研究因素产生交互作用。选择所有区组因素并单击 添加. 在后续的任何子步骤中均不得包含这些因素。
注意：在模型中应考虑区组因素，但不应允许区组因素与其他研究因素产生交互作用。区组因素的主要目的是帮助控制实验的变异性，提高实验的灵敏度。 - 突出显示所有研究因素。修改 学位 将字段值设为3（默认值为2）。单击 阶乘到度数.
注：此操作在模型中包含主效应以及二阶和三阶交互作用。 - 在选择窗口中仅选择非混合因素。点击 宏 > 部分立方.
注意：此操作为连续过程因子及其交互作用引入二次效应 模型中其他非混合因素。 - 仅从选择列表中选取混合因素。点击 宏 > 谢费三次方. 停用默认设置 无截距 选项（参见 图9).
注意：在使用Lasso方法时，将截距项包含在模型中是一个关键步骤，在前向选择背景下同样具有帮助作用。传统的默认设置 无截距 通常会采用这种方法，因为在不进行如SVEM方法等修正的情况下，使用常规最小二乘回归程序同时拟合截距项和所有混合主效应是不可行的12. - 指定响应列：选中响应列并点击 Y.
- 更换 人格 设置为 广义回归. 保持 分布 设定为 正常.
- 单击旁边的红色三角形菜单，将此模型设置保存到数据表中，以便将其用于其他响应 模型设定 并选择 保存至数据表.
- 应用 SVEM 正向选择方法拟合简化模型，无需强制包含混合因子的主效应，并将预测公式列存储在数据表中。
- 从 拟合模型 对话框中，单击 运行.
- 对于 估算方法，选择 SVEM 正向选择.
- 展开 高级对照 > 力学术语 菜单并取消选中与该混合物主效应相关的复选框。仅保留 拦截 术语框应保持勾选状态。 图10 显示默认设置，其中主效应被强制纳入。在此步骤中，需要取消勾选这些选项框，以便模型能够根据向前选择法自行决定是否包含这些效应。
- 点击 开始 运行SVEM正向选择程序。
- 将SVEM模型的预测响应值与实际响应值进行对比作图，以验证其合理的预测能力。图11). 单击红色三角形旁边的 SVEM 正向选择 并选择 诊断图 > 实际值与预测值关系图.
- 单击旁边的红色三角形 SVEM 正向选择 并选择 保存列 > 保存预测公式 在数据表中创建一个包含预测公式的列。
- 可选：使用以下步骤重复上述操作 SVEM Lasso 作为 估算方法 以确定在执行后续步骤后是否建议采用不同的最佳配方。如果是，则运行这两种配方作为确认实验（见第5节），以观察哪种在实际中表现更优。12.
- 对每个响应变量重复模型构建步骤。
- 将所有响应变量的预测列保存至数据表后，使用“预测刻画器”（Profiler）平台绘制所有预测响应列的响应轨迹：选择 图表 > 轮廓仪，并选择上一步中创建的所有预测列 Y，预测公式，然后单击 好的 (图12).
- 确定候选最佳配方。
- 定义 "期望函数" 针对每个响应，需指明该响应应被最大化、最小化或匹配至目标值。将所有主要响应的重要性权重设为1.0，次要响应的重要性权重设为0.2。从 预测分析器 红色三角形菜单，选择 优化与期望值 > 期望函数， 然后 优化与期望值 > 设定期望值. 将设置输入到后续窗口中。
注意：这些重要权重是相对且主观的，因此值得在合理范围内（例如，从等权重到1:5权重）检验组合最优解对这些权重变化的敏感性。 - 命令 Profiler 找到可最大化期望函数的最优因子设置（图12）：从 Profiler 中选择 优化与期望值 > 最大化吸引力.
注意：在最优候选配方中，响应值的预测结果可能会高估效价等右偏响应值；然而，确认性实验将提供对这些候选配方更准确的观测结果。主要目的是 定位 最佳配方（的 设置 最佳配方） - 记录最佳因子设置，并注明每个响应所使用的重要权重：来自 预测分析器 菜单，选择 因子设置 > 记住设置.
- 定义 "期望函数" 针对每个响应，需指明该响应应被最大化、最小化或匹配至目标值。将所有主要响应的重要性权重设为1.0，次要响应的重要性权重设为0.2。从 预测分析器 红色三角形菜单，选择 优化与期望值 > 期望函数， 然后 优化与期望值 > 设定期望值. 将设置输入到后续窗口中。
- 可选：对于离子化脂质类型等分类因子，找出每个因子水平下的条件最优配方。
- 首先在分析器中设置因子的期望水平，然后按住 Ctrl 关键并左键单击该因子的图表内部，然后选择 锁定参数设置. 选择 优化与期望值 > 最大化吸引力 在将该因素固定于当前设定的条件下，寻找其最优值。
- 在继续操作前，使用用于锁定因子设置的同一菜单来解锁因子设置。
- 调整各响应变量的重要性权重后，重复优化过程（使用 优化与期望值 > 设定期望值），或许仅优化主要响应，或为某些次要响应设置更高或更低的重要性权重，或设定次要响应的目标 无 (图13).
- 记录新的最优候选（来自 预测分析器 菜单，选择 因子设置 > 记住设置)
- 生成因子空间中最佳区域的图形摘要：在允许的因子空间内，生成包含 50,000 行数据的数据表，每行包含随机生成的因子设置，以及各响应变量的简化模型预测值和联合期望函数值。
- 在 Profiler 中选择 随机表格输出设置 模拟运行次数？ 至50,000并单击确定。
注意：这将生成一个新表格，其中包含在每种50,000种配方下对响应值的预测结果。 可取性 列取决于响应项的权重系数，这些系数在当前设置中具有重要性权重 随机表格输出 选项被选中。 - 在新建的表格中，添加一个新列用于计算百分位数 可取性 列。在三元图中使用此百分位数列，而非原始数据列 可取性 柱。右键单击该 期望性 列标题并选择 新公式列 > 分布性 > 累积概率 创建一个新的 累积概率[期望值] 柱
- 生成以下步骤中描述的图形。反复更改图形的配色方案，以显示每种响应及每项预测的结果 累积概率[期望值] 柱
- 为四种脂质因子构建三元图。在表格中导航至 图表 > 三元体系 绘图，选择混合因子 X，绘图，然后单击 好的. 右键单击其中一个生成的图表，选择 行图例, 然后选择预测响应列。更改 颜色 下拉至 射流.
注：此图显示了在脂质因素方面表现最佳和最差的区域。 图14 显示在考虑最大化时联合满意度的百分位数 效价 （重要性=1）并最小化 大小 （重要性=0.2），同时对三元相图坐标轴上未显示的任何因素进行平均。 图15 显示原始预测大小。也可以根据其他因素对这些图表进行条件分解，例如，针对每种可电离脂质类型，使用局部数据过滤器（位于红色三角形菜单旁）分别创建一组独立的三元图 三元相图). - 类似地，使用 图表 > 图形构建器 将50,000个以颜色编码的点（代表不同的配方）与非混合过程因子进行单独或联合作图，以探索响应值与各因子之间的关系。寻找能够产生最高期望值的因子设置。在图形中探索不同因子的组合。
注意：绘制图形时，请使用 累积概率[满意度]， 但当以垂直轴表示偏好值并相对于工艺因素作图时，应使用原始数据 可取性 柱。该 期望性 柱也可以放置在坐标轴上 图表 > 三维散点图 可视化以及用于多变量探索的另外两个过程因素。 图16 展示了使用三种可电离脂质各自形成的全部制剂的综合期望性。最理想的制剂采用H102，而H101可提供一些具有潜在竞争力的替代方案。 - 将 Profiler 及其保存的设置重新保存至数据表。单击红色三角形旁边的 轮廓仪 并选择 保存脚本 > 转至数据表….
- 在 Profiler 中选择 随机表格输出设置 模拟运行次数？ 至50,000并单击确定。
图8：实验中测得的效价读数。 图中各点表示23次运行中观测到的效价数值；重复的基准运行以绿色显示。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：启动分析的软件对话框。已输入候选效应及目标效价响应，且未勾选“无截距”选项。请点击此处查看此图的放大版本。
图10．指定SVEM选项的附加对话框。默认情况下，脂质主效应被强制纳入模型中。由于模型中已包含截距项，我们建议取消勾选这些选项框，以避免强制纳入这些效应。请点击此处查看该图的放大版本。
图11：实测值与预测值关系图。 该图展示了各制剂的实际效价与SVEM模型预测值之间的关系。相关性未必如本示例中这般强，但预期至少应观察到中等程度的相关性，并用于检查是否存在离群值。 请点击此处查看该图的高清版本。
图12：预测分析器。 前两行图表显示了在最优配方条件下（由SVEM方法确定）预测响应函数的切片。最下面一行图表显示了配方的加权“期望值”，该值由最右列图表中的函数决定，表明效价应最大化，而粒径应最小化。请点击此处查看该图的放大版本。
图13：SVEM-前向选择法得到的三种最优配方候选方案。 调整各响应指标的相对重要性权重可能导致不同的最优配方。 请点击此处查看该图的放大版本。
图14理想度百分比的三元图。 该图显示了50,000种配方，按期望值百分位进行颜色编码, 其中 效价最大化的重要性权重设为1.0，分子大小最小化的重要性权重设为0.2。这些图显示，最优的制剂区域包含较低比例的可电离脂质和较高比例的聚乙二醇（PEG）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图15：预测粒径的三元相图。 该图显示了SVEM模型对50,000种配方的粒径预测结果。辅助脂质百分比越高，粒径越小；辅助脂质百分比越低，粒径越大。由于其他因素在所绘制的50,000种配方中自由变化，这表明该关系在其他因素（PEG、流速等）的取值范围内均成立。请点击此处查看该图的放大版本。
图16：包含三种不同可电离脂质类型的制剂的期望值的小提琴图。 每个点（共50,000个）代表允许因子空间内的一种独特配方。这些分布的峰值是通过预测分析工具解析计算出的最大期望值。H102的峰值最大，因此可产生最优配方。生成该结果模型所采用的SVEM方法会自动过滤掉统计上不显著的因素：此图的目的是评估各因子水平之间的实际显著性。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 验证实验
- 制备一个表格，列出先前已确定的最优候选物（图17).
注意： 真实效价 和 真实大小 值在 图 17 使用模拟生成函数进行填充：在实际操作中，这些函数将被获得 通过制定这些配方并测量其性能。- 将基准对照组纳入将要制定并测量的一系列候选实验中。
- 如果实验中的任何配方被发现产生理想结果，例如优于基准，则选择最佳配方加入候选表格，并与新配方一同重新测试。
注意：可手动将所需的运行添加到候选表中，或使用“分析器”窗口的 记忆设置 如果这些运行来自先前的实验。请确定该运行的行号，然后导航至 预测分析器 > 因子设置 > 设为行中的数据，然后输入行号。接着，选择 预测分析器 > 因素设置 > 记住设置 并进行适当标记（例如, "基准" 或 "上一次实验的最佳运行结果"). - 右键单击 记忆设置 在分析器中选择表格 制作成数据表.
注意：根据研究的优先级和预算，建议在每次验证运行中设置重复实验，尤其是在替换基准配方时。每种配方均应制备并分析两次，取平均结果用于排序。若某些候选配方在两次重复实验中响应值差异较大，需特别关注，这可能表明工艺变异性较高。 - 如有必要，可根据预算限制从已确定的候选对象中进一步筛选，以符合实验预算或剔除重复的候选对象。
- 进行验证实验。制备配方并收集读数。
- 检查原始实验结果与验证批次在基准测试或其他重复实验方案中的结果是否一致。若出现较大且意外的偏差，则应分析可能导致该偏差的因素，并评估验证批次的所有运行结果是否均受到影响。
- 比较候选最优配方的性能，探究是否有新的候选配方优于基准。
- 可选：将验证实验的结果添加至实验表格中，并重新运行第 4 节的分析。
注意：如果需要，工作流程的下一步将提供如何结合这些运行构建后续研究的说明。
图17：用于确认性实验的十个最优候选方案汇总表。 真实效价（True Potency）和真实粒径（True Size）数据来自模拟生成函数（未添加任何工艺或分析变异）。请点击此处查看该图的放大版本。
6. 可选：设计一项与确认实验同时进行的后续研究
- 根据以下标准评估是否需要开展后续研究：
- 确定最优配方是否位于某一因子边界上，并判断是否需要通过第二次实验来扩展至少一个因子的范围。
- 评估初始实验是否采用了相对较少的运行次数或较宽的因子范围，是否需要通过增加实验运行并更新分析，对已识别的最优区域进行“聚焦”分析。
- 检查是否引入了新的因子。这可能是一个分类因子的新增水平，例如一种额外的可电离脂质，或是在初始研究中保持恒定的某个因子，例如缓冲液浓度。
- 若上述条件均不满足，则进入第7步。
- 准备与确认性实验同时进行的额外实验运行。
- 定义因子范围，确保与初始研究的区域存在部分重叠。若无重叠，则必须重新设计一项新研究。
- 采用空间填充设计开发新的实验运行。选择 DOE > Special Purpose > Space Filling Design。
注意：对于高级用户，可考虑通过 DOE > Custom Design 采用D-最优设计。 - 生成空间填充运行后，手动将原始实验中位于新因子空间内的两到三个运行加入其中。按照第2节所述步骤添加行，并随机化行顺序，将这些运行随机分布于实验表中。
注意：这些运行将用于估计不同区组间响应均值的偏移。 - 将确认性运行与新的空间填充运行合并为一个单一表格，并对运行顺序进行随机化。使用 Tables > Concatenate ，然后创建一个新随机列并按其排序以实现运行顺序的随机化，具体方法见第2节。
- 配制新的配方并收集实验结果。
- 将新的实验运行及其结果合并至原始实验的数据表中，并添加一个实验-ID列以标明每项结果的来源。使用 Tables > Concatenate ，并选择 Create Source Column 选项。
- 验证每个因子的列属性是否显示了两项研究合并后的范围：右键单击每个因子的列标题，检查其 Coding 和 Mixture 属性范围（如存在）。
- 开始分析新实验的结果。
- 将实验-ID列作为模型中的一项，用作区组因子。确保该项不与研究中的其他因子产生交互作用。运行第4节中保存在数据表中的 Fit Model 对话脚本，选中实验-ID列并点击 Add ，将其加入候选效应列表。
- 在合并后的数据表上运行该 Fit Model 对话，联合分析新实验与初始研究的结果。按照之前的指导生成更新后的最优配方候选方案及图形摘要。
- 为验证结果，独立分析新实验的结果，排除初始实验的数据。即，在新的实验数据表上执行第4节所述的分析步骤。
- 确保由这些模型识别出的最优配方与联合分析结果高度一致。
- 审查图形摘要，确认联合分析与新实验结果的独立分析展现出相似的响应面行为（即响应值与各因子之间的关系相似）。
- 将新实验结果的合并分析与独立分析结果同初始实验进行一致性比较。使用相似的图形结构进行对比，并检查所识别的最优配方是否存在差异。
7. 记录研究的最终科学结论
- 若因本研究导致基准对照变更为新确定的配方，应记录新的设置，并注明记录其来源的设计和分析文件。
- 应保留所有实验表格和分析摘要，最好使用带日期戳的文件名，以供将来参考。
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结果
该方法已在广泛分类的两大类脂质中得到验证：MC3类经典脂质和类脂质（如C12-200），后者通常源自组合化学合成。与采用一次单因素法（OFAT）开发的基准脂质纳米颗粒（LNP）配方相比，通过本工作流程生成的候选配方在小鼠肝脏荧光素酶读数中常表现出效价提升4至5倍（对数尺度）。 图 18. 表1 展示了在两个优化阶段（初步研究和后续跟进研究）中，与基准对照性能相比，小鼠肝脏荧光素酶表达所观察到的相应提升。在第一阶段，重点是优化脂质比例，同时保持其他因素不变。在后续研究中，引入了一种额外的辅助脂质类型，并综合考虑脂质比例组成和辅助脂质类型进行优化。因此，选定新引入的辅助脂质类型与相应的优化脂质组成联合使用。显著增强的效力表明，这些优化后的组分可能具有更优的内体逃逸能力25.
可以通过模拟来展示该流程所产生的最优候选配方的预期质量。在本方案所用示例实验的框架内，我们可以针对不同的试验次数重复多次模拟，并根据模拟的过程生成函数来评估结果。为此，
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讨论
用于设计和分析混合-过程实验的现代软件使科学家能够通过结构化的流程优化其脂质纳米颗粒配方，避免了效率低下的单因素试验（OFAT）方法。近期开发的SVEM建模方法消除了许多以往可能使科学家分心于额外统计考量的复杂回归修正和模型简化策略。一旦收集到实验结果，SVEM分析框架提供了一种更易于实施且通常比传统建模方法产生更优模型的分析途径13。此外，基于各响应变量预测公式的图形化分析对科学家而言易于解读，能够清晰地总结响应变量在单个因素以及少量因素组合下的边际行为，而无需解释回归模型中高度相关的参数估计值。这使得科学家能够在SVEM自动剔除统计上不显著效应后，专注于评估各研究因素的实际重要性。
该工作流程已在实践中用于系统性地调整脂质组成以及N/P比、流速和混合比例等制剂参数，以实现优化，并筛选出最佳的辅助脂质类型、可电离脂质类型和缓冲液类型。这些实例的共同目标通常包括最大化 体内 或 体外 效力及包载不同载荷（如mRNA或DNA）以用于相关应用 体内 靶细胞，例如肝细胞，或在某些情况下可...
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披露
本工作流程所依据的实验设计策略已应用于两项专利申请，其中一位作者为发明人之一。此外，Adsurgo有限责任公司是认证的JMP合作伙伴。然而，本文的开发与发表均未接受JMP提供的任何形式的经济激励、鼓励或其他诱导。
致谢
我们感谢编辑和匿名审稿人提出的宝贵建议，这些建议 改进了 本文。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| JMP Pro 17.1 | JMP Statistical Discovery LLC |
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