利用设计的混合-过程实验与自验证集成模型（SVEM）优化脂质纳米颗粒（LNP）制剂的流程

摘要

本方案提供了一种针对混合物、连续型和分类研究因素的配方优化方法，可最大限度地减少实验设计构建中的主观选择。在分析阶段，采用了一种高效且易于使用的建模拟合流程。

摘要

我们提出一种基于质量源于设计（Quality by Design, QbD）理念的方法，用于优化脂质纳米颗粒（LNP）配方，旨在为科研人员提供一个易于实施的工作流程。在这些研究中存在一个内在限制：可电离脂质、辅助脂质和聚乙二醇（PEG）化脂质的摩尔比总和必须为100%，这一混合物约束条件要求采用专门的实验设计与分析方法。本文聚焦于LNP设计优化中常用的脂质组分与工艺参数，通过采用空间填充设计（space-filling designs）并结合近期发展的自验证集成模型（self-validated ensemble models, SVEM）统计框架，提供了一套可避免传统混合-工艺实验在设计与分析中常见困难的操作步骤。该工作流程不仅能生成候选的最优配方，还能构建拟合统计模型的图形化汇总结果，从而简化对实验结果的解读。新识别出的候选配方可通过验证实验进行评估，也可选择性地纳入更全面的第二阶段研究中进一步验证。

引言

用于体内基因递送系统的脂质纳米颗粒（LNP）制剂通常包含四种类别的组分脂质，即离子化脂质、辅助脂质和聚乙二醇（PEG）脂质^1,2,3。无论这些脂质是单独研究，还是与其他非混合因素同时研究，这些制剂的实验均需采用“混合物”设计，因为对于任一候选制剂而言，增加或减少其中任一种脂质的比例，必然导致其余三种脂质比例总和相应减少或增加。

为说明起见，假设我们正在优化一种脂质纳米颗粒（LNP）配方，该配方目前采用一个固定的配方组合，将作为基准进行比较。目标是最大化LNP的效力，其次力求最小化颗粒的平均粒径。实验中变化的研究因素包括四种组分脂质（可电离脂质、胆固醇、DOPE、PEG）的摩尔比例、N:P比、流速以及可电离脂质的类型。其中，可电离脂质和辅助脂质（包括胆固醇）的摩尔比例变化范围较宽，为10–60%，而PEG的比例在此示例中变化范围为1–5%。基准配方的具体组成以及其他因素的变化范围及其数值舍入精度详见补充文件1。本例中，科研人员能够在一天内完成23次实验运行（即23批独立的颗粒制备），并希望以此作为样本量，前提是满足最低要求。本实验的模拟结果见补充文件2和补充文件3。

....

方案

代表性结果部分所述实验是根据《实验动物护理和使用指南》进行的，并遵循本机构动物护理与使用委员会（IACUC）制定的指导原则。6至8周龄雌性Balb/C小鼠购自商业供应商。动物接受 随意摄取 标准饲料和水，饲养于标准条件下，光照/黑暗周期为12小时，温度为65-75 °F (~18-23 °C) 湿度为40-60%。

1. 记录研究目的、响应变量及影响因素

注意：本实验方案全程使用 JMP 17 Pro 进行实验设计与数据分析。其他等效软件可参照类似步骤操作。有关第 1 部分中所有操作步骤的示例和进一步说明，请参见补充文件 1。

1. 在带有日期戳的文档中总结实验目的。
2. 列出实验过程中将要测量的主要响应指标（CQAs）。
3. 列出可能被测量的任何次要响应指标（例如，对理化性质的下游限制）。
4. 列出可能与响应相关的工艺参数，包括与研究目的最相关的参数。
5. 如果研究将持续多天，需包含一个以“天”为类别的“区组”因子。
   注意：这可以平衡各天之间的因子设置，防止工艺均值的天间波动与研究因子发生混杂。
6. 选择在研究中将要变动的因子以及将保持恒定的因子。
   注意：使用风险优先级工具（如失效模式影响分....

结果

该方法已在广泛分类的两大类脂质中得到验证：MC3类经典脂质和类脂质（如C12-200），后者通常源自组合化学合成。与采用一次单因素法（OFAT）开发的基准脂质纳米颗粒（LNP）配方相比，通过本工作流程生成的候选配方在小鼠肝脏荧光素酶读数中常表现出效价提升4至5倍（对数尺度）。 图 18. 表1 展示了在两个优化阶段（初步研究和后续跟进研究）中，与基准对照性能相比，小鼠肝脏荧光素酶表达所观察到的相应提升。在第一阶段，重点是优化脂质比例，同时保持其他因素不变。在后续研究中，引入了一种额外的辅助脂质类型，并综合考虑脂质比例组成和辅助脂质类型进行优化。因此，选定新引入的辅助脂质类型与相应的优化脂质组成联合使用。显著增强的效力表明，这些优化后的组分可能具有更优的内体逃逸能力²⁵.

可以通过模拟来展示该流程所产生的最优候选配方的预期质量。在本方案所用示例实验的框架内，我们可以针对不同的试验次数重复多次模拟，并根据模拟的过程生成函数来评估结果。为此，

讨论

用于设计和分析混合-过程实验的现代软件使科学家能够通过结构化的流程优化其脂质纳米颗粒配方，避免了效率低下的单因素试验（OFAT）方法。近期开发的SVEM建模方法消除了许多以往可能使科学家分心于额外统计考量的复杂回归修正和模型简化策略。一旦收集到实验结果，SVEM分析框架提供了一种更易于实施且通常比传统建模方法产生更优模型的分析途径¹³。此外，基于各响应变量预测公式的图形化分析对科学家而言易于解读，能够清晰地总结响应变量在单个因素以及少量因素组合下的边际行为，而无需解释回归模型中高度相关的参数估计值。这使得科学家能够在SVEM自动剔除统计上不显著效应后，专注于评估各研究因素的实际重要性。

该工作流程已在实践中用于系统性地调整脂质组成以及N/P比、流速和混合比例等制剂参数，以实现优化，并筛选出最佳的辅助脂质类型、可电离脂质类型和缓冲液类型。这些实例的共同目标通常包括最大化 体内 或 体外 效力及包载不同载荷（如mRNA或DNA）以用于相关应用 体内 靶细胞，例如肝细胞，或在某些情况下可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
JMP Pro 17.1	JMP Statistical Discovery LLC