本文展示了一种基于BODIPY 493/503荧光的优化方案，用于肝组织中脂滴的表征。通过正交投影和三维重建技术，该荧光染料可有效区分微泡性与大泡性脂肪变性，可作为经典组织学方法评估肝脂肪变性的补充手段。
本文内容
摘要
摘要
脂滴（LDs）是一类特化的细胞器，介导脂质储存，在抑制脂毒性及防止游离脂肪酸（FAs）引起的细胞功能障碍方面发挥着极为重要的作用。肝脏在机体脂肪代谢中具有关键作用，因此持续面临脂滴在细胞内积聚的威胁，表现为微泡性和大泡性肝脂肪变性。对脂滴的组织学表征通常依赖脂溶性偶氮染料，例如油红O（ORO）染色，但该方法在肝脏样本中的应用存在诸多局限性。近年来，亲脂性荧光染料BODIPY 493/503因其能快速摄取并富集于中性脂滴核心，已成为可视化和定位脂滴的常用工具。尽管其在细胞培养中的大多数应用已有详尽描述，但在组织样本中将其作为脂滴成像工具的可靠证据仍较为有限。本文提出了一种基于BODIPY 493/503的优化方案，用于评估高脂饮食（HFD）诱导肝脂肪变性动物模型肝脏样本中的脂滴。该方案涵盖肝脏样本制备、组织切片、BODIPY 493/503染色、图像采集及数据分析。我们发现，经高脂饮食喂养后，肝细胞中脂滴的数量、荧光强度、面积占比及直径均显著增加。通过正交投影和三维重建，可完整观察脂滴核心中的中性脂质，其形态呈近乎球形的颗粒。此外，利用BODIPY 493/503荧光染料，我们能够区分微泡（1 µm < d ≤ 3 µm）、中等泡（3 µm < d ≤ 9 µm）和大泡（d > 9 µm），从而成功区分微泡性和大泡性脂肪变性。总体而言，该基于BODIPY 493/503荧光的方案是一种可靠且简便的肝脂滴表征工具，可作为经典组织学方法的有力补充。
引言
脂滴（LDs）传统上被视为能量储存库，是一类介导脂质储存的特化细胞器，其结构包含一个主要由胆固醇酯和甘油三酯（TGs）组成的疏水性中性脂质核心，并由一层磷脂单分子层包裹1,2,3。
脂滴（LD）的生成起始于内质网（ER），最初由三酰甘油（TAG）和甾醇酯的合成开始。中性脂质在低浓度时可弥散分布于内质网双分子层的两个小叶之间，但当其细胞内浓度升高时，则会聚集形成油相透镜状结构，并逐渐生长并从内质网膜上出芽，形成近乎球形的脂滴4。随后，来自内质网双分子层和细胞质的蛋白质，特别是脂滴包被蛋白（perilipin, PLIN）家族蛋白，会转位至脂滴表面，促进其出芽过程5,6,7,8,9。
通过新的脂肪酸合成以及脂滴（LD）的融合或聚集，脂滴可生长为不同大小。因此，不同细胞类型....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究中进行的所有动物实验均经科英布拉临床与生物医学研究所（iCBR）动物福利委员会（ORBEA，编号#9/2018）批准，并遵循国家和欧洲动物护理法规以及ARRIVE指南。
1. 实验设计
- 将13周龄雄性Wistar大鼠成对饲养于通风笼具中，环境条件控制在温度（22 °C ± 1 °C）、湿度（50%–60%）和光照（12小时明暗循环）下，并提供 随意摄取 可自由获取自来水和标准啮齿类动物饲料。
- 经过2周的适应期后，将大鼠随机分为两组。
- 分别给予对照组（CTRL，n = 6）标准饲料，高脂饮食组（HFD，n = 6）高脂饲料（45% kcal/fat），持续24周。
- 每周监测体重（BW）。每天按笼记录食物和饮料的消耗量。
2. 肝脏样品制备
- 肝脏解剖
- 准备蠕动泵：将70%乙醇通过管路冲洗，将27 G针头连接至管路出口端，并用冰浴（4 °C）的1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH ~7.4）预充管路（例如，使用内径1.6 mm硅胶管、IV微量输液装置，在蠕动泵上以200 rpm运行）。根据体重调整流速（例如，对于100–150 g的大鼠，使用约10–12 mL/min的流速）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
成功实施该技术应能实现脂滴的清晰染色，从而可同时表征脂滴的形态（基于三维重建的形状和脂质核心密度）及其空间分布、单位总面积内的数量和平均大小（通过上述流程进行评估，图1）。
图1：使用CellProfiler进行图像处理的示例。（A）对照组（CTL）中用BODIPY 493/503（绿色）染色的脂滴（LDs）及用DAPI（蓝色）染色的细胞核的原始图像。（B
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究旨在建立一种基于BODIPY 493/503荧光的脂滴（LD）评估方案，以开发一种用于评估肝脂肪变性的新型成像方法。鉴于肥胖与脂肪肝疾病之间存在强相关性，采用西式高脂饮食（HFD）建立肝脂肪变性动物模型26。通过定量甘油三酯比色检测试剂盒确认，HFD喂养动物肝脏中的甘油三酯（TG）含量显著升高，提示其肝脂质沉积状况加剧。随后，在低倍镜下使用荧光探针BODIPY 493/503对脂滴累积程度进行可视化观察。结果如预期所示，HFD组肝脏组织中可见广泛分布的囊泡样结构。通过正交投影和三维重建技术进一步观察发现，脂滴核心富含中性脂质，呈现为近乎球形的脂滴。此外，脂滴面积占总面积的比例显著增加（较对照组升高360%），且该区域极可能充满中性甘油三酯，这与其在HFD组中测得的定量水平一致（52.83 mg/g ± 6.73 mg/g；较对照组升高346%）。为进一步表征HFD喂养条件下脂滴的动态变化，分析了肝脂肪变性的微泡性或大泡性特征。依据文献中既往报道的脂滴直径范围4,46<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家和欧洲基金资助 通过 葡萄牙科学技术基金会（FCT）、欧洲区域发展基金（FEDER）和竞争力操作计划（COMPETE）：2020.09481.BD，UIDP/04539/2020（CIBB）和POCI-01-0145-FEDER-007440。作者谨此感谢iLAB—显微与生物成像实验室的支持，该实验室隶属于科英布拉大学医学院，是国家基础设施PPBI—葡萄牙生物成像平台（POCI-01-0145-FEDER-022122）的成员单位，同时感谢FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142项目的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.6 mm 内径硅胶管，I.V. 微滴输液套件 | Fisher Scientific | ||
| 4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-吲哚（BODIPY 493/503） | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% 乙醇 | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | 用于设计图像 | |
| 全自动分析仪 Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| 屏障笔（Liquid blocker super pap pen） | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| 刀片 | Leica | 221052145 | 用于冷冻切片机 |
| Cell Profiler 版本 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | 用于分析获取的图像 | |
| 盖玻片 | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| 冷冻模具 | Tissue-Tek | _ | |
| 冷冻切片机（含样本盘和散热装置）CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | 用于溶解 BODIPY 以配制 5 mg/mL 储存液。注意：有毒 且易燃。蒸气可能引起 刺激。应在通风橱中操作。 避免皮肤直接接触。 佩戴橡胶手套和防护眼镜。 |
| 干冰容器（泡沫塑料冷藏箱） | Novolab | A26742 | |
| Dumont 镊子 | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| 玻璃培养皿（高 25 mm，ø 150 mm） | Thermo Scientific | 150318 | 用于解剖后称量肝脏 |
| 甘油封片剂（Glycergel） | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism 软件，版本 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| 高脂饮食 | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| 氯胺酮（Nimatek 100 mg/mL） | Dechra | 791/01/14DFVPT | 使用终浓度为 75 mg/kg |
| 激光共聚焦扫描显微镜 （QUASAR 检测单元） | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 显微镜 | |
| 美托咪啶（Sedator 1 mg/mL） | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | 使用终浓度为 1 mg/kg |
| 针头 | BD microlance | 300635 | |
| 15 号无菌碳钢手术刀 刀片 | Swann-Morton | 205 | |
| 物镜：10x（Plan-Neofluar 10x/0.3）、20x（Plan-Apochromat 20x/0.8）和 40x（Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil） | Carl Zeiss, Germany | ||
| 画笔 | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | 用于处理冷冻切片 | |
| 蠕动泵（Minipuls 3） | Gilson | 1004170 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS，pH ~ 7.4） | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| 手术刀柄，125 mm（5"），3 号 | Swann-Morton | 0208 | |
| 载玻片染色系统 StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| 标准饮食 | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus 载玻片 | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT 包埋介质 | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| 甘油三酯比色法检测试剂盒 | Cayman Chemical | 10010303 | |
| 超声波清洗仪 | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas 弹簧剪刀 - 3 mm 刃口 | Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black 软件 | Zeiss |
参考文献
- Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
- Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可