方法文章

利用MouseWalker量化脊髓损伤小鼠模型中的运动功能障碍

DOI：

10.3791/65207

⸱

2023年3月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2iNOVA4Health, NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas, NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa, 3Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提供了一种利用 MouseWalker（MW）工具箱对自由行走小鼠的运动模式进行定量描述的实验流程，该流程涵盖从初始视频录制和追踪到后期定量分析的各个环节。采用小鼠脊髓挫伤模型以展示 MW 系统的应用价值。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

执行行走和跑步等复杂且高度协调的运动程序，依赖于脊髓及脊上神经回路的节律性激活。胸段脊髓损伤后，与上游神经回路的通信功能受损，进而导致运动协调性丧失，且恢复潜力有限。因此，为了更准确地评估药物或治疗干预后的恢复程度，亟需开发新的、更精细且精确的工具，以量化脊髓损伤动物模型中的步态、肢体协调性及其他运动行为的细微特征。多年来已发展出多种检测方法用于定量评估啮齿类动物自由行走行为，但这些方法通常缺乏对步态策略、足印模式及协调性的直接测量。为弥补这些不足，本文提供了一种更新版的 MouseWalker 系统，该系统结合了全内反射（fTIR）步道与追踪及量化分析软件。这一开源系统已被改进，可生成多种图形输出并提取运动学参数，同时配备一系列量化后分析工具，用于处理系统提供的数据。本文还展示了该方法如何与已建立的行为学检测相结合，对脊髓损伤后出现的运动功能障碍进行定量描述。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

四肢的有效协调并非四足动物所独有。人类的前肢与后肢协调对于完成多种任务仍然至关重要，例如游泳以及行走时的速度变化1。人类与其他哺乳动物之间在肢体运动学2、运动程序1,3,4以及本体感觉反馈回路5等方面具有保守性 ，在分析脊髓损伤（SCI）等运动障碍的治疗方案时应予以考虑6,7,8。

为了实现行走，前肢和后肢的多个脊髓连接必须正确建立并节律性地被激活，这一过程需要来自大脑的输入以及体感系统的反馈2,9,10。这些连接最终汇聚于中枢模式发生器（CPGs），分别位于颈段和腰段脊髓，对应支配前肢和后肢1,9,10。脊髓损伤（SCI）后，神经连接的中断以及抑制性胶质瘢痕的形成12常常限制了运动功能的恢复，其后果根据损伤严重程度不同，可从完全瘫痪到部分肢体功能受限不等。因此，精确量化SCI后运动功能的工具对于监测恢复进程以及评估治疗或其他临床干预措施的效果至关重要6。

用于脊髓损伤（SCI）小鼠挫伤模型的标准计量学评估方法是Basso小鼠评分量表（Basso mouse scale, BMS）13,14，该量表是一种非参数评分系统，通过在开放场地中观察小鼠躯干稳定性、尾巴位置、足底踏步能力以及前肢与后肢的协调性进行评估。尽管BMS在大多数情况下具有极高的可靠性，但仍需至少两名经验丰富的评分员从多个角度观察动物的运动，以充分考虑个体间的自然差异并减少评估偏差。

此外，还开发了其他一些检测方法，用于定量评估脊髓损伤（SCI）后的运动功能。这些方法包括转棒实验，用于测量动物在旋转圆柱体上停留的时间15；水平梯架实验，用于记录动物遗漏的横杆次数以及成功抓握梯架的次数16,17；以及平衡木行走实验，用于测量动物通过狭窄横梁所需的时间及其失误次数18。尽管这些实验能够反映多种运动功能障碍的综合情况，但均无法提供关于前肢与后肢协调运动的直接行走信息。

为了更具体且更全面地分析行走行为，研究人员已开发出其他检测方法，以重建步态周期和行走策略。其中一个例子是足迹测试，即在动物的脚掌上涂抹墨水，使其在一张白纸上行走并留下足迹图案19。尽管该方法操作简单，但提取步幅长度等运动学参数的过程繁琐且不够准确。此外，该方法缺乏对步态周期持续时间或肢体时序协调性等动态参数的记录，从而限制了其应用范围；事实上，这些动态参数只能通过逐帧分析啮齿类动物在透明表面行走时的视频来获取。在脊髓损伤（SCI）研究中，研究人员常采用跑步机并从侧位视角分析行走行为，包括重建步态周期以及测量各腿部关节的角度变化4,20,21。尽管这种方法可提供极为丰富的信息6，但它仅关注特定的一组肢体，且缺少对协调性等其他步态特征的评估。

为了填补这些空白，Hamers 及其同事开发了一种基于光学触觉传感器的定量检测方法，该传感器利用全内反射受抑（fTIR）原理22. 在该方法中，光通过玻璃传播 通过 内反射在足部按压时发生散射，最终被高速相机捕获。最近，该方法的一个开源版本——MouseWalker 已公开发布，该方法结合了全内反射（fTIR）行走装置与一套追踪及量化分析软件。23通过该方法，使用者可提取大量定量参数，包括步态、空间及行走模式、足印位置以及前肢与后肢的协调性，同时还能获得诸如足印图样（模拟墨染足垫实验）等可视化输出结果6）或相对于身体轴线的站立相。重要的是，由于其开源特性，可通过更新MATLAB脚本包来提取新的参数。

本文对先前发表的 MouseWalker23 系统的组装方法进行了更新。提供了该系统的搭建说明，涵盖实现最佳视频质量、追踪条件和参数获取所需的全部步骤。同时共享了额外的量化后分析工具，以增强对 MouseWalker（MW）输出数据集的分析能力。最后，通过在脊髓损伤（SCI）背景下获取可量化的运动功能指标，特别是步态周期和前肢-后肢协调性，展示了该工具的应用价值。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有操作、手术及术后护理程序均经分子医学研究所内部委员会（ORBEA）和葡萄牙动物伦理委员会（DGAV）批准，符合欧洲共同体指导方针（Directive 2010/63/EU）及葡萄牙动物护理法律（DL 113/2013），许可号为0421/000/000/2022。本研究使用9周龄雌性C57Bl/6J小鼠。所有实验均尽可能减少动物使用数量，并最大限度减轻实验动物的痛苦。MATLAB脚本及MW软件的独立版本为开源程序，可在GitHub获取
数据库https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker）。虽然MW软件最初使用MATLAB R2012b开发，但已适配为可在MATLAB R222b中运行。 图1 展示了MW的分析工作流程。

1. 设置小鼠行走分析仪（MouseWalker，MW）装置

  1. 按照先前所述方法组装微型行走装置（MW装置）23，或根据实验设计的具体需求进行调整（有关装置的更多细节，请参见材料表和补充图1）。
    注意：行走区域可加宽以适应较大的动物，例如大鼠。
  2. 检查动物行走所用的有机玻璃表面是否清洁且无划痕。使用柔软的清洁布，并尽量减少使用高浓度的有机溶剂（如氨水或乙醇），以免损坏有机玻璃（推荐使用3%过氧化氢、7%乙醇， 或任何适用于 有机玻璃的兼容且合适的消毒剂）。如有必要，更换有机玻璃。
  3. 使用配备快速镜头和大光圈（即较小的F值）的高速摄像机，以捕捉大量光线，这有助于记录全内反射（fTIR）信号（详见材料表）。
    注意：镜头不应产生光学畸变，尤其是在图像边缘区域。可通过拍摄已知图案（例如条纹或方格）并在ImageJ/FIJI24中测量区块尺寸来测试光学畸变（使用直线工具，然后点击分析 > 测量）。例如，一个1 cm大小的正方形在图像中心和边缘的像素尺寸应相同，差异应小于5%。
  4. 开启背景光源箱的多色LED灯带。
  5. 开启行走通道光源箱的白色LED灯带。
    注意：也可使用彩色LED灯带25，以方便区分足迹、动物身体与背景。
  6. 关闭室内灯光后，检查背景光源箱和行走通道的光照强度。如有必要，使用电位器或半透明塑料调节光照强度。需优化设置，使像素强度按以下顺序递增：动物身体 < 背景 < 足迹。
    1. 为检查动物身体、背景和足迹的像素强度，将图像序列在ImageJ/FIJI24中打开，点击分析 > 测量。足迹信号不应过度饱和，否则将无法界定足迹边界（即脚趾和足垫）（补充图2）。
  7. 在视频录制软件中调节行走通道的图像对比度。对比度可通过两种方式调节：调节LED灯带的亮度或调整相机镜头的光圈。
  8. 正确调整镜头位置，使其与45°反射镜处于同一高度并位于其中心，且与行走通道垂直（90°）。这将确保沿左右行走通道生成比例恒定的图像。
    注意：在多次录制过程中应避免改变相机位置（距离、高度和方向）。如有必要，可在三脚架应放置的位置标记地面，以保持图像特征的一致性。
  9. 将镜头对焦于有机玻璃表面。可通过使用一个不会造成损伤的物体接触有机玻璃表面来测试对焦效果。
    ​注意：当F值较低时，景深会变小，从而使对焦更加困难。
  10. 确保在实验过程中所有设置保持不变，因为任何变动都可能改变所录制视频的像素强度。

2. 视频采集

  1. 确保小鼠在测试前已熟悉实验房间和装置，至少预留1天时间进行适应（第0天）。为避免过度训练，应在与其他行为学测试不同的日期进行MW测试（建议在其他测试的次日进行）。
  2. 在视频录制软件中，确保至少有50 cm的行走区域可见。
  3. 调整录制设置以截除步道区域。这将减小视频文件大小并优化视频采集。
  4. 每次实验前拍摄一把普通尺子的照片或短视频。每厘米的像素数将用于后续的 "设置窗口" 用于校准视频。
  5. 开始视频采集，用手抓住动物尾部基部，将其放置在步道边缘，以避免 损伤。确保动物向前移动至平台的最远端。以每秒至少100帧的速度进行视频录制，以确保步态过渡的平滑性。
    1. 如有需要，可通过轻敲步道壁或弹指/拍手的方式促使动物移动。但应避免直接触碰动物，以免影响实验结果。
    2. 将视频直接保存为 TIFF（采用 LZW 压缩）、JPEG 或 PNG 格式的图像序列。若相机录制为原始 MOV 文件，则在 ImageJ/FIJI 中打开文件，将其转换为图像序列24 并点击 文件 > 保存为 > 图像序列 （或使用其他软件，例如 LosslessCut）25).
      ​注意：大多数动物被放入步道后会立即开始行走；因此，建议在放置动物之前就开始视频采集。

3. 为MW追踪软件准备视频

  1. 对每只小鼠拍摄足够数量的完整运行视频。每组条件下需要拍摄的小鼠数量以及所需的完整运行次数应根据具体的实验设计来确定。完整运行是指小鼠在行走通道上连续行走完整的50 cm，且中途无长时间停顿（本实验中选择三次完整运行）。
    注意：根据图像采集软件的不同，可能需要将视频裁剪至最小感兴趣区域（ROI），这将提高追踪和结果生成的速度。
  2. 在 ImageJ/FIJI24 中，通过点击 图像 > 栈 > 工具 > 创建子栈，选择小鼠出现在画面中的帧。MW 软件的追踪要求在所有帧中均能清晰看到小鼠的头部和尾部。然而，可以从单个视频记录中生成多个子栈，每个子栈后续代表一次独立的运行。
  3. 通过点击 文件 > 另存为 > 图像序列，将每个子栈分别保存在不同的文件夹中。每次开始分析一次运行时，MW 软件会自动在每个目录中创建一个子文件夹。

4. 追踪

  1. 打开 MATLAB，将包含 MW 脚本的文件夹添加到工作目录中，并在主命令行中运行 "MouseWalker.m"。
    注意：在 MATLAB 环境下使用 MW 软件，可在 MATLAB 主控制台查看跟踪错误信息，并选择所需的输出数据（通过打开主脚本文件 "MouseEvaluate.m" 并将输出项设置为 1 或 0：Excel 文件、脚印图、支撑轨迹和步态模式）。
  2. 将视频文件夹加载为 "输入目录"。用户也可选择输出文件夹；但此操作非必需，因为 MW 软件会自动在 "输入目录" 内创建一个名为 "Results" 的新文件夹。
  3. 使用箭头 "<<", "<", ">>", 和 ">" 检查视频帧是否已全部正确加载至 MW 软件中。
  4. 进入 "设置窗口"，其中包含所有校准和阈值参数。这些设置可能因背景和脚印的像素强度、身体和脚印的最小尺寸等因素而异（参见 补充图2 中的示例）。通过点击 预览 按钮测试更改某些参数的效果。
    1. 使用不同的绘图样式，包括 "身体 + 脚 + 尾巴"、"仅身体"、"仅脚" 和 "仅尾巴"，以帮助在调整阈值参数后区分身体各部分。
    2. 利用右侧面板中的工具测量亮度或尺寸（分别使用 "亮度" 和 "标尺" 按钮）。只要摄像机距离保持不变，所有设置均可保存为 "默认"。
  5. 调整完阈值参数后，检查视频是否已准备好进行自动跟踪。转到第一帧，点击 自动 开始跟踪。此步骤可实时观察，所需时间取决于视频大小和计算机性能，通常需几分钟。
    1. 如果自动跟踪错误地标记了身体特征，请取消自动跟踪，输入新设置，然后重新启动该过程。
  6. 跟踪完成后，检查是否需要手动校正。如需校正，请使用中间面板选择或取消选择，并标示右前（RF）、右后（RH）、左前（LF）和左后（LH）爪的脚印、头部、鼻部、身体（分为两个节段）和尾巴位置（分为四个节段）。通过点击 保存 按钮保存更改。
    注意：所有按钮和大多数命令均有快捷键（详见相关手册23）。为便于视频滚动和键盘快捷键执行，可使用带有可编程按钮和梭轮（如 Contour ShuttlePro V2）的硬件控制器。
  7. 点击 评估 以从已跟踪的视频生成输出文件。根据所选的输出类型（见步骤 4.1），此步骤可能需要几分钟。
  8. 检查所有图形输出数据图是否已保存在 "Results" 文件夹中。通过检查部分图形输出（例如 "支撑轨迹"）来验证跟踪的准确性，以确认所有爪子位置是否一致。
    1. 若发现错误，应手动校正跟踪（如可行；否则删除 "Results" 文件夹，并使用新设置重新执行自动跟踪），然后再次点击 评估 命令。
  9. 检查 MW 软件生成的所有定量测量值是否已保存在 Excel 表格中，并汇总在 "1. Info_Sheet" 中。确保 Excel 的公式分隔符选项与脚本匹配：小数分隔符必须为 ","，千位分隔符必须为 ";"。
  10. 使用 "MouseMultiEvaluate.m" 脚本将所有运行的测量结果汇总到一个新文件中以供分析。
    1. 首先，生成一个包含所有视频文件夹路径的 .txt 文件（例如 "Videofiles.txt"）。确保每一行对应一个视频。
    2. 然后，在命令行中输入 "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')"。将在工作目录中生成一个名为 "ResultSummary.xls" 的 Excel 文件（参见 GitHub 仓库中的示例）。
      ​注意：图2 表示 MW 软件从一只记录动物的视频中获得的图形输出。

5. 运动学数据分析工作流程

  1. 根据以下前提条件，编辑第 4.10 步生成的 Excel 表格，该表格包含使用所提供 Python 脚本进行处理的数据。
    1. 在第一列标题中，指定实验条件。每行以组/条件名称命名（同一组中的个体必须具有相同的名称）。第一组必须是对照组或基线组（此要求仅在绘制热图时强制执行，见第 5.6 步）。
    2. 在第二列中，指定动物编号。此信息为必填项，尽管在绘图生成过程中不会使用该信息。
    3. 从第三列开始，选择将用于分析的运动参数。确保第一行为参数名称（这些名称将随后出现在图表中）。
  2. 打开 Anaconda Navigator，并运行 Spyder 以打开所提供的 Python 脚本。
    注意：所有脚本均使用 Python 3.9.13 开发，在 Anaconda Navigator 2.1.4 中通过 Spyder 5.2.2 执行，可在材料表和 GitHub 仓库中获取（其中还包括附加材料，如示例视频、Excel 示例文件和常见问题解答文档）。脚本可在 Anaconda Navigator 之外运行；然而，该图形用户界面更加友好。
  3. 使用 "Rawdata_PlotGenerator.py" 生成原始数据图。这将允许将每个参数作为速度的函数进行可视化。
    1. 在 Spyder 中打开 "Rawdata_PlotGenerator.py"，然后点击运行按钮执行代码。
    2. 在自动弹出窗口中选择要分析的 Excel 文件及工作表名称。如果工作表名称未更改，请输入 "Sheet1"。
    3. 原始数据图将显示在绘图控制台（右上面板）中。要保存图表，请点击绘图控制台中的保存图像或保存全部图像按钮。
  4. 使用脚本 "Residuals_DataAnalysis" 计算用于数据分析的残差。该脚本将生成一个 CSV 文件，其中包含所有运动参数的残差计算结果。
    注意：由 MW 提取的许多步态参数随速度变化（例如摆动速度、步长、支撑时长、支撑直线度和步态指数）。因此，建议对基线实验中每个个体参数与速度进行最佳拟合回归模型，然后确定各实验组相对于该回归模型的残差值。随后，数据以与归一化残差线的差异形式表示26。
    1. 在 Spyder 中打开 "Residuals_DataAnalysis.py"，然后点击运行按钮执行代码。
    2. 在自动弹出窗口中选择要分析的 Excel 文件及工作表名称。如果工作表名称未更改，请输入 "Sheet1"。
    3. 将 CSV 文件保存在与数据相同的文件夹中。Excel 文件中的第一组必须是对照组（或基线组）。
  5. 使用 "PCA_PlotGenerator.py" 脚本执行主成分分析（PCA）。
    注意：这种无监督的降维方法用于生成更简洁的数据表示27,28,29（图 3A、B）。PCA 脚本包括以下步骤：首先对数据进行预处理，进行中心化和标准化；然后 PCA 算法计算协方差矩阵，以确定变量之间的相关性，并计算协方差矩阵的特征向量和特征值，以识别主成分。选择前两个或前三个主成分分别用于二维或三维图中的数据表示。图中的每个点对应一只动物，代表一个不同的抽象变量。使用不同颜色的点来区分特定组别。因此，点的聚类反映了相应个体共享的相似行走模式。
    1. 在 Spyder 中打开 "PCA_PlotGenerator.py"，然后点击运行按钮执行代码。
    2. 在自动弹出窗口中选择要分析的 Excel 文件及工作表名称。如果工作表名称未更改，请输入 "Sheet1"。
    3. 确保 PCA 二维和三维图出现在绘图控制台（右上面板）中。每种颜色代表一个不同的组，图例位于图的旁边。要保存图表，请点击绘图控制台中的保存图像按钮。
  6. 使用 "Heatmap_PlotGenerator.py" 生成热图。确保热图生成器创建一个表格，显示基线组（或对照组）与其他组之间在每个运动参数上的统计学差异27（图 4）。每列表示一个组，每行对应一个特定的运动参数。
    注意：统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后接 Tukey 事后检验（适用于正态分布）或 Kruskal-Wallis 方差分析后接 Dunn 事后检验（适用于非正态分布）。分析中排除了异常值。P 值通过颜色编码表示，红色和蓝色分别表示相对于对照组（或基线组）的增加或减少。颜色深浅表示统计学显著性，颜色越深表示显著性越高，颜色越浅表示显著性越低。*** 对应 P < 0.001；** 对应 P < 0.01；* 对应 P < 0.05。白色表示无变化。
    1. 在 Spyder 中打开 "Heatmap_PlotGenerator.py"，然后点击运行按钮执行代码。
    2. 在自动弹出窗口中选择要分析的 Excel 文件及工作表名称。如果工作表名称未更改，请输入 "Sheet1"。
    3. 在第二个自动弹出窗口中选择数据类型：原始数据或残差数据。若未选择选项，则默认为残差数据。
    4. 热图将出现在绘图控制台（右上面板）中。要保存图表，请点击绘图控制台中的保存图像按钮。
      注意：Excel 文件中的第一组必须是对照组（或基线组）。
  7. 使用 "Boxplots_PlotGenerator.py" 生成箱形图。该工具将允许生成表示每组所有运动参数值分布的箱形图（图 5、图 6 和 图 7）。
    注意：每个箱体包含中位数（中间线），箱体的下边缘和上边缘分别代表 25% 和 75% 四分位数。须线表示完整数据集的范围，不包括异常值。异常值定义为低于或高于 25% 和 75% 四分位数 1.5 倍四分位距的任何数值。
    1. 在 Spyder 中打开 "Boxplots_PlotGenerator.py"，然后点击运行按钮执行代码。
    2. 在自动弹出窗口中选择要分析的 Excel 文件及工作表名称。如果工作表名称未更改，请输入 "Sheet1"。
    3. 在第二个自动弹出窗口中选择数据类型：原始数据或残差数据。若未选择选项，则默认为残差数据。
    4. 箱形图将出现在绘图控制台（右上面板）中。要保存图表，请点击绘图控制台中的保存图像或保存全部图像按钮。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

标准的BMS系统用于描述脊髓损伤（SCI）后的粗大运动功能缺陷14。由于其具有主观性，通常还需结合其他定量检测方法，以对运动功能进行更详细和精细的评估。然而，这些检测方法无法提供关于步态周期、行走模式以及前肢-后肢协调性的具体信息，而这些信息对于理解脊髓神经环路如何维持功能并在不完全性脊髓损伤后发生适应性变化至关重要。本节将介绍MW工具箱如何帮助监测脊髓损伤后的运动功能恢复情况，并提供有关行走行为的补充信息。

研究样本分为两组，均为9周龄的雌性C57Bl/6J小鼠：脊髓损伤（SCI）实验组（n = 11），该组动物接受椎板切除术，随后使用Infinite Horizon撞击器在T9/T10脊柱节段造成中至重度挫伤（见材料表）；假手术对照组（n = 10），该组仅在相同脊柱节段进行椎板切除术（图1，步骤1）。对SCI组和假手术组动物的运动行为监测持续30天。MW测试在术前适应日（基线）、伤后15天、22天和30天（dpi）进行（

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文通过分析脊髓损伤（SCI）后的运动行为，展示了MouseWalker方法的潜力。该方法能够揭示步态、足印和行走模式中的特定改变，而这些改变往往无法通过其他标准检测方法发现。除了提供MouseWalker软件包的更新版本外，还介绍了使用配套Python脚本进行数据分析的工具（见步骤5）。

由于运动分析系统（MW）生成了大量数据以及一系列反映高度复杂运动过程的运动学参数，因此采用了主成分分析（PCA）；事实上，PCA 已被广泛应用于与此类似的其他运动学数据集27,35,36（图 3）。这种降维技术是一种简单且稳健的方法，所需假设极少，能够定量识别运动学特征，并快速将其与对照组或基线条件区分开来。此外，还生成了热图，以快速识别出与基线存在统计学差异的参数（图 4），这些参数随后可进...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢 Laura Tucker 和 Natasa Loncarevic 对稿件提出的建议，以及里斯本分子医学研究所 João Lobo Antunes 啮齿类动物设施提供的支持。作者感谢圣卡萨神经科学奖——脊髓损伤研究梅洛与卡斯特罗奖（MC-36/2020）为 L.S. 和 C.S.M. 提供的经费支持。本研究得到了科学技术基金会（FCT）（PTDC/BIA-COM/0151/2020）、iNOVA4Health（UIDB/04462/2020 和 UIDP/04462/2020）以及 LS4FUTURE（LA/P/0087/2020）对 C.S.M. 的资助。L.S. 获得了 CEEC 个人首席研究员合同（2021.02253.CEECIND）的支持。A.F.I. 获得了科学技术基金会（FCT）博士奖学金（2020.08168.BD）的支持。A.M.M. 获得了科学技术基金会（FCT）博士奖学金（PD/BD/128445/2017）的支持。I.M. 获得了科学技术基金会（FCT）博士后奖学金（SFRH/BPD/118051/2016）的支持。D.N.S. 获得了科学技术基金会（FCT）博士奖学金（SFRH/BD/138636/2018）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
45º 反射镜 
2 根铝型材（2 x 2 cm），高 16 cm，每侧各 1 根Misumi
2 根铝型材（2 x 2 cm），长 23 cm，倾斜 45°，每侧各 1 根Misumi
1 根铝型材（2 x 2 cm），长 83 cmMisumi
87 x 23 cm 反射镜普通玻璃供应商 
黑色卡纸填充物 普通文具供应商我们使用了 2 块，尺寸分别为 69 x 6 cm 和 69 x 3 cm，用于限制镜面反射
背景背光
109 x 23 cm 有机玻璃（厚 0.9525 cm）普通五金供应商
2 根侧向铝型材（4 x 4 cm），长 20 cm，每侧各 1 根Misumi
多色 LED 灯带普通五金供应商
用于覆盖有机玻璃的白色不透明纸普通文具供应商
fTIR 支撑底座和支柱
2 根铝型材（4 x 4 cm），高 100 cmMisumi
60 x 30 cm 公制光学平台板Edmund Optics #54-641
M6 12 mm 螺钉Edmund Optics 
M6 六角螺母和垫圈Edmund Optics 
fTIR 步道 
109 x 8.5 cm 有机玻璃（厚 1.2 cm）普通五金供应商109 x 8.5 cm 有机玻璃（厚 1.2 cm）
长 109 cm 的 U 型槽铝基座，折叠部分高 1.6 cm、深 1.9 cm（用于固定有机玻璃）普通五金供应商
2 根侧向铝型材（4 x 4 cm），长 20 cm，每侧各 1 根Misumi
黑色卡纸填充物 普通文具供应商我们在每侧使用了 2 块填充物，以覆盖有机玻璃边缘，避免出现亮边
M6 12 mm 螺钉Edmund Optics 
高速相机（安装在三脚架上）
Blackfly S USB3FLIR#BFS-U3-32S4M-C此为推荐型号。要求为至少以每秒 100 帧的速度进行录制
无限地平冲击器 
Infinite Horizon Impactor Precision Systems and Instrumentation, LLC.#0400
镜头
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mmNikon#1929推荐使用此镜头，但也可使用其他镜头。请确保其具有较大光圈（即较小的 F 值），以便捕捉 fTIR 信号
软件
MATLAB R2022bMathWorks
Python 3.9.13 Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5 Spyder Project Contributors
步道侧壁 
2 块大尺寸矩形亚克力板，尺寸为 100 x 15 cm任意家居装修便利店
2 块梯形亚克力侧板，长度为 6-10 cm，高 15 cm任意家居装修便利店
GitHub 资源
文件夹名称URL
箱形图https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots用于生成箱形图的脚本
文档https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs附加文档
热图https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps用于生成热图的脚本
Matlab 脚本https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20ScriptMouseWalker 的 Matlab 脚本
主成分分析https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots用于执行主成分分析的脚本
原始数据图https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots用于生成原始数据图的脚本
残差分析https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis用于从原始数据计算残差的代码

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
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