提供了一种利用 MouseWalker（MW）工具箱对自由行走小鼠的运动模式进行定量描述的实验流程，该流程涵盖从初始视频录制和追踪到后期定量分析的各个环节。采用小鼠脊髓挫伤模型以展示 MW 系统的应用价值。
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本文内容
摘要
摘要
执行行走和跑步等复杂且高度协调的运动程序，依赖于脊髓及脊上神经回路的节律性激活。胸段脊髓损伤后，与上游神经回路的通信功能受损，进而导致运动协调性丧失，且恢复潜力有限。因此，为了更准确地评估药物或治疗干预后的恢复程度，亟需开发新的、更精细且精确的工具，以量化脊髓损伤动物模型中的步态、肢体协调性及其他运动行为的细微特征。多年来已发展出多种检测方法用于定量评估啮齿类动物自由行走行为，但这些方法通常缺乏对步态策略、足印模式及协调性的直接测量。为弥补这些不足，本文提供了一种更新版的 MouseWalker 系统，该系统结合了全内反射（fTIR）步道与追踪及量化分析软件。这一开源系统已被改进，可生成多种图形输出并提取运动学参数，同时配备一系列量化后分析工具，用于处理系统提供的数据。本文还展示了该方法如何与已建立的行为学检测相结合，对脊髓损伤后出现的运动功能障碍进行定量描述。
引言
四肢的有效协调并非四足动物所独有。人类的前肢与后肢协调对于完成多种任务仍然至关重要，例如游泳以及行走时的速度变化1。人类与其他哺乳动物之间在肢体运动学2、运动程序1,3,4以及本体感觉反馈回路5等方面具有保守性 ，在分析脊髓损伤（SCI）等运动障碍的治疗方案时应予以考虑6,7,8。
为了实现行走，前肢和后肢的多个脊髓连接必须正确建立并节律性地被激活，这一过程需要来自大脑的输入以及体感系统的反馈2,9,10。这些连接最终汇聚于中枢模式发生器（CPGs），分别位于颈段和腰段脊髓，对应支配前肢和后肢1,
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方案
所有操作、手术及术后护理程序均经分子医学研究所内部委员会（ORBEA）和葡萄牙动物伦理委员会（DGAV）批准，符合欧洲共同体指导方针（Directive 2010/63/EU）及葡萄牙动物护理法律（DL 113/2013），许可号为0421/000/000/2022。本研究使用9周龄雌性C57Bl/6J小鼠。所有实验均尽可能减少动物使用数量，并最大限度减轻实验动物的痛苦。MATLAB脚本及MW软件的独立版本为开源程序，可在GitHub获取
数据库https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker）。虽然MW软件最初使用MATLAB R2012b开发，但已适配为可在MATLAB R222b中运行。 图1 展示了MW的分析工作流程。
1. 设置小鼠行走分析仪（MouseWalker，MW）装置
- 按照先前所述方法组装微型行走装置（MW装置）23，或根据实验设计的具体需求进行调整（有关装置的更多细节，请参见材料表和补充图1）。
注意：行走区域....
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结果
标准的BMS系统用于描述脊髓损伤（SCI）后的粗大运动功能缺陷14。由于其具有主观性，通常还需结合其他定量检测方法，以对运动功能进行更详细和精细的评估。然而，这些检测方法无法提供关于步态周期、行走模式以及前肢-后肢协调性的具体信息，而这些信息对于理解脊髓神经环路如何维持功能并在不完全性脊髓损伤后发生适应性变化至关重要。本节将介绍MW工具箱如何帮助监测脊髓损伤后运动功能的恢复情况，并提供有关行走行为的相关信息。
研究样本分为两组，均为9周龄的雌性C57Bl/6J小鼠：脊髓损伤（SCI）实验组（n = 11），该组动物接受椎板切除术，随后使用Infinite Horizon撞击器在T9/T10脊柱节段造成中至重度挫伤（见材料表）；假手术对照组（n = 10），该组仅在相同脊柱节段进行椎板切除术（图1，步骤1）。对SCI组和假手术组动物的运动行为持续监测30天。MW测试在术前适应日（基线）、伤后15天、22天和30天（dpi）进行（
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讨论
本文通过分析脊髓损伤（SCI）后的运动行为，展示了MouseWalker方法的潜力。该方法能够揭示步态、足印和行走模式中的特定改变，而这些改变往往无法通过其他标准检测方法发现。除了提供MouseWalker软件包的更新版本外，还介绍了使用配套Python脚本进行数据分析的工具（见步骤5）。
由于运动分析系统（MW）生成了大量数据以及一系列反映高度复杂运动过程的运动学参数，因此采用了主成分分析（PCA）；事实上，PCA 已被广泛应用于与此类似的其他运动学数据集27,35,36（图 3）。这种降维技术是一种简单且稳健的方法，所需假设极少，能够定量识别运动学特征，并快速将其与对照组或基线条件区分开来。此外，还生成了热图，以快速识别出与基线存在统计学差异的参数（图 4），这些参数随后可进.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢 Laura Tucker 和 Natasa Loncarevic 对稿件提出的建议，以及里斯本分子医学研究所 João Lobo Antunes 啮齿类动物设施提供的支持。作者感谢圣卡萨神经科学奖——脊髓损伤研究梅洛与卡斯特罗奖（MC-36/2020）为 L.S. 和 C.S.M. 提供的经费支持。本研究得到了科学技术基金会（FCT）（PTDC/BIA-COM/0151/2020）、iNOVA4Health（UIDB/04462/2020 和 UIDP/04462/2020）以及 LS4FUTURE（LA/P/0087/2020）对 C.S.M. 的资助。L.S. 获得了 CEEC 个人首席研究员合同（2021.02253.CEECIND）的支持。A.F.I. 获得了科学技术基金会（FCT）博士奖学金（2020.08168.BD）的支持。A.M.M. 获得了科学技术基金会（FCT）博士奖学金（PD/BD/128445/2017）的支持。I.M. 获得了科学技术基金会（FCT）博士后奖学金（SFRH/BPD/118051/2016）的支持。D.N.S. 获得了科学技术基金会（FCT）博士奖学金（SFRH/BD/138636/2018）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 45º 反射镜 | |||
| 2 根铝型材（2 x 2 cm），高 16 cm，每侧各 1 根 | Misumi | ||
| 2 根铝型材（2 x 2 cm），长 23 cm，倾斜 45°，每侧各 1 根 | Misumi | ||
| 1 根铝型材（2 x 2 cm），长 83 cm | Misumi | ||
| 87 x 23 cm 反射镜 | 普通玻璃供应商 | ||
| 黑色卡纸填充物 | 普通文具供应商 | 我们使用了 2 块，尺寸分别为 69 x 6 cm 和 69 x 3 cm，用于限制镜面反射 | |
| 背景背光 | |||
| 109 x 23 cm 有机玻璃（厚 0.9525 cm） | 普通五金供应商 | ||
| 2 根侧向铝型材（4 x 4 cm），长 20 cm，每侧各 1 根 | Misumi | ||
| 多色 LED 灯带 | 普通五金供应商 | ||
| 用于覆盖有机玻璃的白色不透明纸 | 普通文具供应商 | ||
| fTIR 支撑底座和支柱 | |||
| 2 根铝型材（4 x 4 cm），高 100 cm | Misumi | ||
| 60 x 30 cm 公制光学平台板 | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm 螺钉 | Edmund Optics | ||
| M6 六角螺母和垫圈 | Edmund Optics | ||
| fTIR 步道 | |||
| 109 x 8.5 cm 有机玻璃（厚 1.2 cm） | 普通五金供应商 | 109 x 8.5 cm 有机玻璃（厚 1.2 cm） | |
| 长 109 cm 的 U 型槽铝基座，折叠部分高 1.6 cm、深 1.9 cm（用于固定有机玻璃） | 普通五金供应商 | ||
| 2 根侧向铝型材（4 x 4 cm），长 20 cm，每侧各 1 根 | Misumi | ||
| 黑色卡纸填充物 | 普通文具供应商 | 我们在每侧使用了 2 块填充物，以覆盖有机玻璃边缘，避免出现亮边 | |
| M6 12 mm 螺钉 | Edmund Optics | ||
| 高速相机（安装在三脚架上） | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | 此为推荐型号。要求为至少以每秒 100 帧的速度进行录制 |
| 无限地平冲击器 | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| 镜头 | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | 推荐使用此镜头，但也可使用其他镜头。请确保其具有较大光圈（即较小的 F 值），以便捕捉 fTIR 信号 |
| 软件 | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| 步道侧壁 | |||
| 2 块大尺寸矩形亚克力板，尺寸为 100 x 15 cm | 任意家居装修便利店 | ||
| 2 块梯形亚克力侧板，长度为 6-10 cm，高 15 cm | 任意家居装修便利店 | ||
| GitHub 资源 | |||
| 文件夹名称 | URL | ||
| 箱形图 | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | 用于生成箱形图的脚本 | |
| 文档 | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | 附加文档 | |
| 热图 | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | 用于生成热图的脚本 | |
| Matlab 脚本 | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker 的 Matlab 脚本 | |
| 主成分分析 | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | 用于执行主成分分析的脚本 | |
| 原始数据图 | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | 用于生成原始数据图的脚本 | |
| 残差分析 | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | 用于从原始数据计算残差的代码 |
参考文献
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion.
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