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方法文章

洁净室环境与细胞治疗中的微生物控制与监测策略

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DOI：

10.3791/65209

⸱

2023年3月17日

 ,  , 
1Sterility Testing Service, Department of Laboratory Medicine, Clinical Center, National Institutes of Health

本文内容

摘要

本方案总结了在洁净室环境中最大限度降低微生物负荷的最佳实践，包括环境监测、工艺监测和产品无菌检测等策略。该方案适用于需要符合现行良好组织操作规范和现行药品生产质量管理规范标准的生产和检测机构。

摘要

一个经过充分验证且全面的方案对于将细胞治疗产品生产区域及相应检测实验室中的微生物生物负荷降至最低至关重要，该方案需包含严格的更衣、清洁、环境监测和人员监测措施，以确保设施处于受控状态。保障产品质量安全 通过 质量控制措施（如无菌检测）是监管要求，适用于经最低限度操作（361章节）和非最低限度操作（351章节）的人体细胞、组织以及细胞和组织来源产品（HCT/Ps）。本视频提供了一步一步的指导，介绍如何在洁净室环境中建立并实施最佳的无菌操作规范，包括更衣、清洁、物料暂存、环境监测、工艺监测，以及采用直接接种法进行产品无菌检测，该方法由美国药典（USP）提供<71>）以及美国国立卫生研究院（NIH）替代无菌检测方法。本方案旨在为需符合现行良好组织操作规范（cGTP）和现行药品生产质量管理规范（cGMP）的机构提供参考指南。

引言

通过环境监测（EM）、工艺监测和产品无菌检测来实施强有力的微生物监测计划，是细胞治疗实验室现行良好组织规范（cGTP）和现行药品生产质量管理规范（cGMP）的法规要求1。此外，美国食品药品监督管理局（FDA）要求执行产品质量控制（QC）检测的实验室，其设施和控制措施应与无菌灌装操作所采用的设施和控制措施相当2。

本方案包含四个主要部分：1）无菌操作，包括人员更衣、清洁及物料准备；2）环境监测，包括可存活空气与表面培养以及非存活粒子空气监测；3）工艺过程监测，包括沉降平板和戴手套指尖取样；4）产品无菌检测 通过 美国药典（United States Pharmacopeia, USP） <71> 方法3 或美国国立卫生研究院替代无菌检测方法4当结合使用时，这些措施可有效确保设施始终处于受控状态。

本文所述技术并非新颖；然而，监管机构和专业组织目前的标准缺乏详细指导，导致微生物监测的缺失，或非标准化操作的实施，尤其是在现场生产和产品无菌检测迅速发展的学术中心1,5,6。本方案可作为制定微生物监测与控制计划的指南，结合终端用户验证和风险评估后，可满足监管要求。

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方案

1. 无菌操作

  1. 人员进入洁净室的更衣程序
    注意：本程序基于在非分级区域进行初步更衣，随后进入国际标准化组织（ISO）8级区域，再进入ISO7级区域。该程序适用于尝试将现有空间改造为洁净室功能的实验室。理想情况下，所有初步更衣应在ISO8级区域（而非非分级区域）内完成。
    1. 固定松散的头发。洗手并更换为刷手服（建议穿长袖刷手服上衣和全长刷手裤）。取用洁净室专用鞋并穿上鞋套。
    2. 首先使用酒精类手部消毒剂进行手部消毒，并在后续每一步操作之间再次消毒：如需要，佩戴非无菌手套，然后佩戴胡须罩（如有可见面部毛发）。佩戴非无菌圆帽；若未使用长袖刷手服上衣，则需用非无菌袖套覆盖前臂。
    3. 脱去鞋套，在脱去鞋套后，将每只脚踏在ISO8级缓冲间门前的粘尘垫上。确保进入前整只脚底完全接触粘尘垫。丢弃鞋套，并用70%无菌异丙醇（sIPA）对手套和门把手进行去污处理。进入ISO8级缓冲间。
    4. 取用无菌头罩、无菌口罩、无菌连体服、无菌靴套和护目镜。用70% sIPA对手套进行去污。佩戴护目镜，并按照步骤1.5的要求将物品放置于洁净表面。
    5. 在专用洁净室鞋上穿戴新的一双非无菌鞋套，然后踏上二级缓冲间门前的粘尘垫。确保每只脚的全部区域均与粘尘垫充分接触。用70% sIPA对手套进行去污。取用已准备好的更衣用品，进入二级ISO7级缓冲间，停留在分界线的污染侧。
    6. 仅接触更衣材料的内侧，穿戴无菌头罩和无菌连体服，确保头罩颈部部分完全塞入连体服内，形成完整密封。穿戴二级无菌靴套。在每次穿戴步骤之间，均用70% sIPA对手套进行去污。
    7. 确认更衣正确无误后，用70% sIPA对手套进行去污，然后进入ISO7级区域。
      注意：应定期检查更衣材料的完整性。若发现破损，应立即退出洁净室并重新更衣。
  2. 生物安全柜（BSC）内的更衣程序
    1. 按照上述步骤1.1进行更衣，并增加以下操作。
    2. 取用无菌手套和无菌袖套。按照步骤1.4清洁生物安全柜，并按照步骤1.5将物品摆放就位。用70% sIPA对手套进行去污。
    3. 以无菌方式将无菌袖套穿在连体服外，如有拇指环则使用。将无菌手套戴在现有手套外，确保手套袖口覆盖无菌袖套。在每一步操作之间，均用70% sIPA对手套进行去污。进入生物安全柜。
      注意：应定期检查更衣材料的完整性。若发现破损，应立即退出洁净室并重新更衣。
  3. 脱除更衣材料
    1. 退出生物安全柜，小心脱去外层手套和无菌袖套。用70% sIPA对内层手套进行去污。
    2. 依次进入二级和一级缓冲间，每步之间等待门完全关闭。按以下顺序脱除物品：外层无菌靴套、连体服、头罩和口罩。
    3. 退出一级缓冲间，脱去非无菌更衣材料。
      注意：在非分级区域脱除物品的顺序不重要；但非无菌内层鞋套应保留在洁净室专用鞋上，以便在非分级区域存放。
    4. 使用酒精类手部消毒剂对手部进行消毒，然后换回日常服装。
  4. 清洁洁净室表面及生物安全柜
    1. 组装手持式清洁拖把，或取用一块洁净低 lint 擦拭布。若使用低 lint 擦拭布，将其折叠成四分之一大小，并在每次擦拭不同表面时翻转至干净面。用经批准的消毒剂充分浸润拖把头或擦拭布。
    2. 从后向前（或从上到下）依次清洁生物安全柜，采用重叠擦拭方式，顺序如下：HEPA 高效过滤器扩散格栅（生物安全柜顶部）、生物安全柜后壁、两侧壁、视窗以及工作台面。最后使用70% sIPA擦拭生物安全柜视窗，以去除残留的消毒剂。参见图1了解典型的生物安全柜清洁模式。
  5. 将材料和设备转移至受控环境
    1. 对所有需从非分级或较低分级区域转移至较高分级区域（例如从ISO8级区域转移至ISO7级区域）的材料进行去污处理（即“暂存”），以最大限度减少微生物的转移。在相同ISO等级区域之间转移材料无需暂存。
      注意：若材料已进行终端灭菌且处于多层包装中，可移除外层包装袋/袋，直接将材料转移至受控区域；无需擦拭内层包装袋/袋。
    2. 取用一块低 lint 擦拭布，将其折叠成四分之一大小，以便在擦拭布变脏时翻转至干净面。用70% sIPA或经批准的消毒剂浸润擦拭布。
    3. 使用重叠擦拭方式清洁材料/设备的外表面。确保擦拭所有区域，包括可拆卸包装的密封内侧、设备上的凹槽/缝隙以及其他不规则形状物品的隐蔽部位。对于带轮设备，确保在暂存过程中彻底擦拭整个轮子（可能需要轻轻倾斜设备以便转动轮子）。

显示矩形空间内气流方向的气流模式示意图，箭头指示流动方向。
图1：生物安全柜清洁路径示例。 从后向前（或从上到下），按以下顺序使用重叠擦拭法对生物安全柜进行清洁：HEPA高效过滤器扩散口（生物安全柜顶部）、生物安全柜后壁、两侧壁、视窗门以及工作台面。最后，使用70%异丙醇（sIPA）擦拭生物安全柜的视窗门，以去除残留的消毒剂。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 环境监测（EM）

  1. 可存活表面取样
    1. 按照步骤1.5准备采样所需的材料，并按照第1节的要求进入洁净区域并穿戴防护服。
      注意：在任何指定位置，表面采样应在空气采样之前进行。若使用多个平板对一个区域进行表面采样，不得在完全相同的位置重复采样。仅使用接触平板对平坦表面进行采样，以确保琼脂与表面充分接触，并避免可能对琼脂造成的损伤。
    2. 为每个采样点收集并标记一个卵磷脂酶吐温大豆酪蛋白琼脂（TSALT）平板和一个卵磷脂酶吐温沙氏葡萄糖琼脂（SABLT）平板。用一只手握住平板底部，无菌操作打开皿盖，注意避免触碰凸起的琼脂表面。
    3. 轻轻将凸起的琼脂接触待采样表面，确保整个琼脂表面与采样区域充分接触，并对平板施加适当压力。使平板与表面保持接触至少5秒。
    4. 关键：采样时切勿在待测表面横向移动接触平板，以免将潜在菌落扩散至表面区域，导致难以分辨单个菌落。采样过程中切勿对接触平板施加过大压力，以防琼脂表面破裂。
    5. 无菌操作下盖上皿盖，注意不要触碰凸起的琼脂表面。若接触平板带有锁扣系统，应将皿盖锁紧。使用70% sIPA清洁采样区域，去除表面残留的培养基。将平板松散装袋，并按照下述方法进行培养 表1显示在TSALT表面采样平板上生长的三个菌落形成单位（CFUs）呈现两种不同菌落形态的代表性图像如图所示 图2. 图3 显示TSALT平板边缘出现菌落生长，表明样品采集过程中无菌操作技术不当导致污染。
  2. 可存活空气采样
    1. 按照步骤1.5准备采样所需的材料，并按照第1节的要求进入洁净区域并穿戴洁净服。
    2. 为每个采样点收集并标记一个胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板和一个沙氏葡萄糖琼脂（SAB）平板。通过无菌操作握住采样头外缘取下采样头，以避免污染采样头，完成空气采样器的准备。
    3. 一手持采样头，将培养基无菌放入采样器的平板架中。若存在一个比其他突出更长的插针，应先将培养基对准较长的插针插入，再将平板向下压入其余插针，以固定平板。
    4. 无菌地取下培养皿盖，将其放置于已清洁的表面上，避免干扰，直至采样完成。无菌地重新安装并固定采样头，仅握持其外缘，以避免污染采样头。若使用多头空气采样器，则对剩余的培养基重复步骤 2.2.2–2.2.4。
    5. 将空气采样器放置在采样位置，采样头朝向气流的主要方向。确保非生物气溶胶采样器（若同时采样）的排气不会干扰生物气溶胶采样器。确认空气采样器已设置为经过验证的参数，并启动采样周期。
    6. 采样周期完成后，仅握住采样头的外缘以避免污染，无菌操作下将其从采样器上取下。一手持采样头，另一手无菌操作盖上琼脂平板的皿盖。从平板架上取下平板，将平板松散地装入袋中，并按照所述方法培养培养物 表1.
    7. 用70% sIPA对采样头及平板架周围的区域进行消毒。仅握住外边缘，无菌操作固定采样头。若使用多头空气采样器，在剩余培养基上重复步骤2.2.6和步骤2.2.7。
      注意： 图4 显示一个TSA主动空气采样培养，其生长源于被污染的采样头。相反， 图5 显示一次无菌落生长的TSA主动空气采样培养结果。图像中可见采样头撞击空气留下的凹痕。
  3. 非活性采样
    1. 每天使用前，对激光粒子计数器进行零点检查。将等动力采样头直接或通过一段导管连接至粒子计数器的采样口，具体连接方式根据采样位置的需要而定。
    2. 若使用导管，应使用较短的长度，因为导管 >1 米长可能导致在计数 ≥ 的颗粒时出现问题1 µm 并可能导致管道出现不必要的弯曲。确保粒子计数器已设置为经过验证的参数。建议设置约30秒的延迟，以便在采样开始后离开采样区域，避免干扰气流。
    3. 将激光粒子计数器的等速采样头置于采样位置，使等速采样头朝向气流主要运动方向。确保活性空气采样器的排气（若同时采样）不会干扰非活性采样器。对于气流非单向或气流模式未知的区域，应使等速采样头垂直向上。
      注意：如果旋转式消毒剂或70% sIPA已在空气采样器附近气溶胶化，请至少等待5分钟后，再开始采样循环。
    4. 启动采样循环，并缓慢退出采样区域，以避免干扰气流。
      关键提示：采样周期内，切勿在空气采样器附近气溶胶化液体，否则将导致非活性颗粒计数显著升高。
    5. 当采样完成后，取回激光粒子计数器。记录平均粒子数 0.5 µm某些机构还可能对数据进行追踪和趋势分析 5.0 µm.
    6. 重复步骤 2.3.3–2.3.6，对下一个采样点进行采样。若在不同房间或生物安全柜之间移动，需用 70% sIPA 或经批准的消毒剂擦拭非活性粒子采样器的外表面。避免将消毒剂带入等动力采样头内部，否则可能导致粒子计数不准确。
类别培养基培养条件培养观察结果
环境监测TSA（可存活空气）30 °C-35 °C，常温空气，至少3天培养结束时观察各设施的质量保证（QA）小组应为每种采样类型和位置建立警戒限和行动限。基于ISO分类的可存活样品的行动限可参考PIC/S 009-16（附录）18 和 ISO-14644-1 7。非可存活空气样品的行动限通常设定为ISO限值的某一百分比（例如99%）。可存活样品的警戒限通常设定为行动限或ISO限值的某一百分比（例如95%）。有关警戒限和行动限的建立以及所选培养条件的验证，详见PDA TR-13 和 USP<1116>8,9。
SAB（可存活空气）20 °C-25 °C，常温空气，至少7天
TSALT（可存活表面）30 °C-35 °C，常温空气，至少3天环境监测平板的代表性图像见图2、图3、图4 和 图5。
SABLT（可存活表面）20 °C-25 °C，常温空气，至少7天
工艺监测TSA（沉降平板）30 °C-35 °C，常温空气，至少3天仅作参考信息。在产品无菌检查失败后进行OOS调查时，可提供有用信息。
SAB（沉降平板）20 °C-25 °C，常温空气，至少7天参见图6以了解阳性沉降平板的示例。
戴手套手指指尖取样TSALT30 °C-35 °C，常温空气，至少48小时，随后在20 °C-25 °C下继续培养至少5天19。戴手套手指取样（GFS）的可接受标准为＜1 CFU/平板（即无菌生长），依据为PIC/S 009-16（附录）18。各设施的质量保证部门可根据实际情况调整可接受标准。
产品无菌检查TSB（USP<71>）20 °C-25 °C，常温空气，至少14天培养期间定期观察（第3、5、7和14天）无菌生长。
FTM（USP<71>）30 °C-35 °C，常温空气，至少14天
iFA+（NIH方法）30 °C-35 °C，常温空气，至少14天由BacT/ALERT Dual-T仪器自动监测。强烈建议在培养结束时对每瓶进行肉眼检查，以发现霉菌球。参见图8，了解BacT/ALERT未能自动检出的可见霉菌球示例。
iFN+（NIH方法）
SAB（NIH方法）20 °C-25 °C，至少14天培养期间定期观察（第3、5、7和14天）

表1：推荐的培养条件及预期结果汇总。 此处所述的培养条件是基于美国国立卫生研究院（NIH）使用的经验证程序所提出的建议。每位最终使用者均需对其自身的微生物检测程序进行验证。由于设施设计、设施内微生物群落以及产品风险等级等变量的不同，各机构之间的微生物控制与检测策略可能有所差异。

培养皿中的细菌菌落、琼脂培养基、微生物生长实验、黄色色素。
图 2：TSALT 平板上的生长情况。 TSALT 表面采样平板显示三个菌落形成单位（CFU），具有两种不同的菌落形态。请点击此处查看该图的放大版本。

显示细菌菌落生长的培养皿，用于微生物培养分析。
图 3：采样过程中 TSALT 平板的污染情况。 TSALT 平板表面培养显示在平板边缘存在单个菌落，提示采样过程中无菌操作不当。请点击此处查看该图的放大版本。

显示抗生素耐药模式的细菌菌落培养皿，微生物学实验。
图4：使用受污染的空气采样头获得的培养物。 TSA 主动空气采样培养的示例展示 >100 个菌落形成单位（CFU），菌落形态多样。生长模式表明采样头受到污染。 请点击此处以查看此图的放大版本。

培养皿中的细菌干扰图样；微生物学实验中的波动现象。
图 5： TSA 活菌空气平板上无菌生长。 该 TSA 活菌空气平板经培养后显示无菌落生长。图像中可见活性空气采样头留下的压痕。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 过程监测

  1. 沉降平板法（被动式空气监测）
    1. 将标记好的TSA和SAB平板放置在工作区域附近，但应置于不影响实验操作的区域。记录采样开始时间，并在无菌条件下打开两个平板的盖子，将盖子放置在超净台内远离工作区域的洁净表面上。
    2. 为防止琼脂干燥，沉降平板的暴露时间最长不得超过4小时。在操作结束后盖上平板盖子。将平板松散地装入袋子中，并按照表1所述条件进行培养。图6显示了TSA空气沉降平板上的单个菌落污染物。
  2. 戴手套手指取样（GFS）
    1. 准备两个标记好的TSALT平板。无菌操作下取下一个平板的盖子，并将其放置在远离采样区域的洁净工作表面上。
    2. 轻轻滚动一只手的每个手指和拇指的指腹部分，使其接触平板表面（图7）。应尽可能取每个手指/拇指的最大表面积，而非指尖。施加适当压力，使琼脂表面产生轻微压痕，但不得破坏琼脂表面。
    3. 将盖子无菌地重新盖回平板上，并对另一只手重复步骤3.2.2。采样完成后，使用70% sIPA对手部进行消毒。将平板松散地装入袋子中，并按照表1所述条件进行培养。

琼脂培养皿中的细菌生长；用于微生物菌落观察与分析的实验。
图6：TSA沉降平板上的菌落生长情况。 该TSA沉降平板显示了在生物安全柜内进行被动空气过程监测期间培养出的一种污染物的单个菌落。请点击此处查看该图的放大版本。

培养皿指纹采集，法医学方法；戴手套的手在实验室环境中按压琼脂。
图7：戴手套手指采样。 左侧展示的是使用每个手指/拇指最大表面积（或指腹）正确采集戴手套手指样本的方法。右侧展示的是仅采集指尖部分的错误操作过程。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 通过直接接种法进行无菌检测

  1. 依据 USP<71> 进行直接接种
    1. 为每份送检样品各准备一瓶标记好的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和一瓶标记好的流体硫乙醇酸盐培养基（FTM）。在测试过程中，为活性表面取样各准备一个 TSALT 和一个 SABLT，为沉降平板各准备一个 TSA 和一个 SAB 平板，为手套冲洗取样（GFS）准备两个 TSALT 平板。
    2. 按照步骤 1.2 的要求在生物安全柜（BSC）内穿戴防护服。按照步骤 1.4 清洁 BSC。按照步骤 1.5 将材料放入 BSC 中。按照步骤 2.1 对关键工作区域进行接触取样，取样后用 70% sIPA 擦拭表面。在工作区附近按照步骤 3.1 准备 TSA 和 SAB 沉降平板。
    3. 取待检样品及其对应的 TSB 和 FTM 瓶。如果 TSB 和 FTM 瓶带有隔膜塞，需取下保护帽，并用无菌酒精棉片擦拭隔膜表面；如果 TSB 和 FTM 瓶为螺旋盖，则松开瓶盖（但不要取下）。
    4. 涡旋混匀待检样品，以确保形成均匀的悬浮液。使用无菌注射器和皮下注射针头（用于带隔膜塞的瓶子）或移液器（用于螺旋盖瓶），将经验证体积的待检样品（最多 10 mL/瓶）接种至培养瓶中。
    5. 接种后，用无菌酒精棉片擦拭隔膜，并插入无菌通气装置，以便在培养期间进行气体交换。对于螺旋盖瓶，盖紧瓶盖但将盖子松开 1/4 至 1/2 圈，以允许培养期间气体交换。对本批次中需测试的每一份待检样品重复步骤 4.1.3–4.1.5。
    6. 无菌封闭 TSA 和 SAB 沉降平板，并记录取样结束时间。按照步骤 3.2 进行手套冲洗取样（GFS），取样后用 70% sIPA 擦拭手套。将平板 loosely 装入塑料袋中，并按照 表 1 所述条件培养培养物。
    7. 将所有测试材料移出 BSC，并按照步骤 1.4 清洁 BSC。
  2. 依据 NIH 替代无菌检测方法进行直接接种
    1. 为每份待检样品各准备一个标记好的 iFA+、一个标记好的 iFN+ 以及一个 SAB 平板。在测试过程中，为活性表面取样各准备一个 TSALT 和一个 SABLT，为沉降平板各准备一个 TSA 和一个 SAB 平板，为手套冲洗取样（GFS）准备两个 TSALT 平板。
    2. 按照步骤 1.2 的要求在生物安全柜（BSC）内穿戴防护服。按照步骤 1.4 清洁 BSC。按照步骤 1.5 将材料放入 BSC 中。按照步骤 2.1 对关键工作区域进行接触取样，取样后用 70% sIPA 擦拭表面。在工作区附近按照步骤 3.1 准备 TSA 和 SAB 沉降平板。
    3. 取待检样品及其对应的 iFA+、iFN+ 和 SAB 平板。取下 iFA+ 和 iFN+ 瓶的保护帽，并用无菌酒精棉片擦拭隔膜表面。
    4. 涡旋混匀待检样品，以确保形成均匀的悬浮液。使用无菌注射器和皮下注射针头将经验证体积的待检样品（最多 10 mL/瓶）接种至培养瓶中。接种后用无菌酒精棉片擦拭隔膜。将培养瓶置于 BacT/ALERT Dual-T 仪器中，按照 表 1 所述条件进行培养。
    5. 使用移液器将经验证量的待检样品（不超过 500 µL/平板）接种至 SAB 平板，并用无菌接种环划线分离。静置 10 分钟，以确保样品在倒置培养时不会流到平板盖上。将每块接种了待检样品的 SAB 平板放入塑料袋中， loosely 扎紧袋口，并按照 表 1 所述条件进行培养。
    6. 无菌封闭 TSA 和 SAB 沉降平板，并记录取样结束时间。按照步骤 3.2 进行手套冲洗取样（GFS），取样后用 70% sIPA 擦拭手套。将平板 loosely 装入塑料袋中，并按照 表 1 所述条件培养培养物。在培养期结束时对 BacT/ALERT 培养瓶进行肉眼检查，对于仪器可能未检出的霉菌团块至关重要（图 8）。
    7. 将所有测试材料移出 BSC，并按照步骤 1.4 清洁 BSC。

培养皿中细菌菌落生长；微生物实验；用于培养分析的琼脂培养基。
图 8：BacT/ALERT 系统未能检出的霉菌生长情况。肉眼可见但 BacT/ALERT 系统未能自动检测到的霉菌团示例。基于这些发现，我们建议对所有 BacT/ALERT 培养瓶进行终末肉眼检查，并在 NIH 替代无菌检测方法中增加使用 SAB 培养基进行真菌培养。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

预期结果见表1。应对环境监测数据进行审核，并针对超出行动限、警戒限或ISO限值的情况开展相应的调查并采取适当措施。若非活性微粒超标，应按照ISO 14644-附录A第A.5.5节7执行。如果该超标情况可归因于一个可立即识别的异常事件，则应记录原始取样结果，注明忽略该原始结果，并详细描述该异常事件。可在相关位置重新取样一次。如果无法将超标归因于可立即识别的异常事件，则应记录取样结果，并在发现超标（OOS）结果后立即在该位置重新采集一组非活性微粒样品，该样品可用于调查过程。根据ISO 14644-附录A第A.5.6节，应对超标结果进行调查，并纠正已识别的根本原因。

无菌检查失败会导致USP<71>培养基出现浑浊，或在BacT/ALERT瓶和/或SAB平板上观察到微生物生长（图8）。应将分离出的微生物鉴定至种属水平，并根据临床需要进行相应的药敏试验。检测实验室应完成调查，以确定该异常结果（OOS）是否有效，或是否存在可能导致OOS的...

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讨论

本方案中有若干关键环节，包括在洁净室和生物安全柜（BSC）内维持无菌操作技术和单向气流。最佳操作实践包括缓慢而有意识地移动，以尽量减少气流扰动。无菌操作应从产品的侧面进行，而非从上方操作。推荐采用密闭系统工艺，并使用最终灭菌的原辅材料。应避免在关键区域说话以及倚靠墙壁或设备。同样，在无菌操作完成前，应避免不必要的非无菌物品接触以及拾取掉落的物品。生物安全柜内的物品应合理摆放，防止阻塞气流，并保持气流从洁净区向污染区单向流动。操作人员进出生物安全柜的频率应尽量减少。在取样或检测过程中，对所有活动进行完整记录也至关重要，包括所有物料、设备和工艺所涉及的批号、有效期、校准日期、起止时间以及检测人员等信息。

此处所述的环境监测程序依赖于手动孵育和菌落计数。环境监测方案的设计由最终使用者自行决定。取样位点和检测频率应参照PDA技术报告13进行指导。8 并通过风险评估进行论证，该评估需结合实验室工作流程、产品接近程度、场所关键性、持续时间以及每个工作流程步骤所涉及的人员数量8一个典型的环境监测（EM...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院临床中心院内研究计划资助。本文内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20-25°C 培养箱实验室自选
30-35°C 培养箱实验室自选
酒精类手部消毒剂实验室自选
BacT/ALERT Dual-T 仪器BioMerieux Industry
胡须罩实验室自选
生物安全柜（BSC）实验室自选
洁净室鞋实验室自选
流体硫乙醇酸盐培养基（FTM）Hardy Diagnostics U84USP
手持式清洁拖把Contec2665LF
皮下注射针头实验室自选
iFA+ BacT/ALERT 瓶Biomerieux412990
iFN+ BacT/ALERT 瓶Biomerieux412991
等动力采样头实验室自选
激光粒子计数器TSI Incorporated9500-01
LpH IIISteris1S16CX
镜子实验室自选
非无菌圆顶帽实验室自选
非无菌手套实验室自选
非无菌鞋套实验室自选
非无菌袖套实验室自选
Parafilm 封口膜实验室自选
Peridox RTUContecCR85335IR
塑料袋实验室自选
含卵磷脂酶和吐温的沙氏葡萄糖琼脂（SABLT）Hardy Diagnostics P595USP，辐照灭菌
沙氏葡萄糖琼脂（SAB）Hardy Diagnostics W565USP，辐照灭菌
护目镜实验室自选
手术服（上衣和裤子）实验室自选
Spor-Klenx RTUSteris6525M2
无菌 70% 异丙醇（IPA）Decon CiDehol8316
无菌酒精擦拭巾实验室自选
无菌鞋套Kimberly Clark货号根据尺寸不同而变化
无菌连体防护服Kimberly Clark货号根据尺寸不同而变化
无菌面罩实验室自选
无菌手套实验室自选
无菌头罩Kimberly Clark货号根据尺寸不同而变化
无菌低尘擦拭布TexwipeTX3210
无菌拖把清洁垫ContecMEQT0002SZ
无菌袖套Kimberly Clark36077
无菌涂布棒Fisher Scientific14665231
无菌注射器实验室自选
粘性地垫实验室自选
胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）Hardy Diagnostics W570RUSP，辐照灭菌
含卵磷脂酶和吐温的胰蛋白胨大豆琼脂（TSALT）Hardy Diagnostics P520RUSP，辐照灭菌
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）Hardy Diagnostics U46USP
导管实验室自选
Vesphene IIISteris1S15CX
可存活空气采样器Hardy Diagnostics BAS22K
涡旋振荡器实验室自选

参考文献

  1. Cundell, T., Atkins, J. W., Lau, A. F. Sterility testing for hematopoietic stem cells. Journal of Clinical Microbiology. , 10.1128/jcm.01654-22 (2023).
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