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高通量筛选以获得蛋白质晶体学的晶体初筛结果

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DOI：

10.3791/65211

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2023年3月10日

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1National High-Throughput Crystallization Center, Hauptman-Woodward Medical Research Institute, 2Department of Biochemistry, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, The State University of New York

本文内容

摘要

本方案详细描述了高通量结晶筛选实验的全过程，涵盖从1,536微孔板的制备到6周实验周期结束的各个步骤。内容包括样品准备、成像获取，以及用户如何利用人工智能驱动的图形用户界面快速高效地分析数据，识别大分子结晶条件。

摘要

X射线晶体学是解析大分子结构最常用的技术，但将蛋白质结晶为适合衍射的有序晶格这一关键步骤仍然具有挑战性。生物分子的结晶过程主要依赖实验探索，该过程可能耗费大量人力，对资源有限机构的研究人员而言尤为困难。在国家高通量结晶（HTX）中心，已实施高度可重复的方法以促进晶体生长，包括一种自动化的高通量1,536孔油下微批量板系统，旨在广泛筛选多种结晶条件。这些结晶板通过先进的成像手段在6周内持续监测，以深入了解晶体生长过程，并准确识别有价值的晶体信号。此外，通过采用经过训练的人工智能评分算法识别晶体信号，结合开源且用户友好的实验图像浏览界面，显著简化了晶体生长图像的分析流程。本文描述了配制结晶混合液和结晶板、成像以及识别晶体信号的关键步骤与仪器设备，确保实验可重复性，并提高成功结晶的可能性。

引言

尽管结构生物学方法已取得巨大进展，X射线晶体学仍是生成大分子高质量结构模型的一种可靠且常用的方法。截至2023年1月，蛋白质数据库（PDB）中超过85%的三维结构模型均来源于基于晶体的结构解析方法1。此外，X射线晶体学在解析蛋白质-配体结构方面仍然不可或缺，这是药物发现与开发过程中的关键环节2。尽管蛋白质结晶在过去半个多世纪以来一直是结构生物学的主要技术，但基于物理性质3或序列信息4,5来预测结晶可能性的方法仍处于初级阶段。

结晶条件的预测更加困难；即使对于模式蛋白，预测其可能的结晶条件方面的进展也十分有限6,7。其他研究曾尝试基于蛋白质同源性以及从PDB中挖掘的条件来确定结晶条件8,9,10。然而，PDB中所包含的预测信息有限，因为其中仅收录最终成功的结晶条件，而必然遗漏了为优化晶体生长所进行的大量实验过程。此外，许多PDB条目缺乏包含这些细节的元数据，例如试剂混合物配方、结晶形式、温度以及结晶所需时间11,12。因此，对于许多目标蛋白而言，最可行的确定结晶条件的方法仍是通过实验，尽可能在广泛的化学条件下进行筛选。

为了使结晶筛选尽可能高效且全面，研究人员已探索了多种方法并取得了显著成效，包括稀疏矩阵法13、不完全因子筛选法14、添加剂15，16、引晶技术17以及成核剂18。Hauptman-Woodward 医学研究所（HWI）国家高通量结晶中心开发了一条高效的结晶筛选流程，采用油下微批量法19，结合自动化液体处理与成像技术，能够在使用相对极少的样品和试剂混合物体积的条件下，快速确定初步的结晶条件（图1）。该流程包含1,536种独特的试剂混合物，其组成基于以往证实有利于蛋白质晶体生长的条件，并在化学成分上具有高度多样性，以覆盖尽可能广泛的潜在结晶条件20，21，22。广泛地采样结晶条件可显著提高发现一种或多种可行结晶路径的可能性。

关于筛选所需条件数量的正式分析在文献中较少见。一项研究关注了不同筛选实验的取样布局，发现组分的随机取样（类似于不完全因子设计）是最全面且高效的取样方法23。另一项关于筛选的研究指出，在许多情况下，即使非常全面的1,536孔筛选也仅获得一个晶体结果24；而一项最新的研究强调，大多数商业筛选试剂盒对已知与筛选命中相关的结晶空间采样不足25。并非所有结晶苗头都能产生适合数据收集的衍射质量晶体，原因可能包括晶体内部的固有无序、衍射能力限制或晶体缺陷；因此，扩大条件筛选范围的额外优势在于可提供可用于优化的不同晶体形态。

蛋白质结晶实验的格式也会影响筛选的成功率。气相扩散法是高通量结晶应用中最常用的实验设置，被包括EMBL汉堡分站和巴斯德研究所高通量筛选中心在内的先进结晶中心所采用26,27,28。HTX中心采用油下微批量法（microbatch-under-oil method）；尽管该方法使用较少，但它是一种稳健的技术，可最大限度减少样品和结晶试剂混合液的消耗20,21,22。油下微批量法的一个优势在于，特别是在使用高黏度石蜡油时，液滴在实验过程中仅发生轻微蒸发，这意味着在液滴混合后即可达到平衡浓度。如果在油下微批量法中观察到成功的结晶结果，通常比气相扩散法更容易重现这些条件，因为在气相扩散法中，结晶发生在液滴与储液之间平衡过程中的某个未明确定义的时间点。对于高通量结晶方法而言，结晶结果的可重复性是可取的，因为这些方法通常会产生尺寸极小的蛋白质晶体，难以直接用于单晶X射线衍射实验，必须经过优化。

可溶性蛋白质的高通量结晶筛选体系由自行配制的混合试剂、市售现成筛选试剂盒以及经实验室改良的商业筛选试剂盒组成22。这些混合试剂最初采用不完全因子策略进行开发，参考了以往成功的结晶混合条件20。筛选体系中包含的市售试剂有多种聚合物、结晶盐、聚乙二醇（PEG）、离子组合，以及采用稀疏矩阵法和不完全因子法设计的筛选试剂盒。此外，部分试剂在加入筛选体系前经过修饰：包括添加剂筛选试剂盒、pH值与缓冲液筛选试剂盒、离子液体添加剂筛选试剂盒以及聚合物筛选试剂盒。

已利用已知的结晶条件与策略，结合微批量油下系统的优势，设计出包含1,536种结晶混合液的筛选流程。该流程采用自动化液体处理、自动明场成像以及手性晶体的二次谐波非线性成像（SONICC）技术。液体处理与成像的自动化可减少湿实验工时，并提高实验重复性。高通量自动化结晶筛选要求晶体生长监测过程也必须实现自动化。通过先进的成像技术，可有效辅助识别出阳性晶体信号。该系统同时采用对培养板进行标准明场成像和多光子检测增强技术，以提升晶体检测的灵敏度与准确性 通过 一种带有SONICC的晶体成像系统图2）。SONICC 结合了二次谐波生成（SHG）29 显微镜与紫外双光子激发荧光（UV-TPEF）30 显微镜检测微小晶体以及被沉淀物遮蔽的晶体。SONICC成像可判断孔中是否含有蛋白质通过 紫外-双光子激发荧光（UV-TPEF）和晶体（通过 SHG）。除了对蛋白质晶体进行正向鉴定外，还可利用先进的成像方法获取额外信息。在加入样品前对混合液（cocktail-only）进行成像可作为阴性对照；这些图像可用于识别加样前孔板的外观，包括盐晶体和碎片等。此外，SHG 和紫外双光子激发荧光（UV-TPEF）成像有助于区分蛋白质晶体与盐晶体，并可用于可视化蛋白质-核酸复合物材料。31.

高通量结晶实验的重复监测 通过 成像结果会产生大量需要检查的图像。为了减轻用户负担并提高识别阳性晶体的几率，已开发出自动化的晶体评分方法。HTX中心参与了“结晶结果的机器识别”（MAchine Recognition of Crystallization Outcomes, MARCO）评分算法的开发。MARCO是一种深度卷积神经网络架构，由学术界、非营利组织、政府机构和产业界合作伙伴组成的联盟共同研发，用于对明场孔板图像进行分类。32该算法的训练使用了来自多个机构的近五十万张明场图像，这些图像源自采用不同结晶方法和不同成像设备的结晶实验。该算法输出一个概率评分，用于指示给定图像属于以下四类图像中的哪一类： "晶体", "清晰", "沉淀物"，以及 "其他"MARCO 的报告分类准确率为 94.5%。通过采用实现该算法的软件并配备图形用户界面（GUI），可进一步增强晶体检测功能，便于用户便捷、简单地查看图像，并支持人工智能辅助评分功能。32,33MARCO Polo 图形用户界面（GUI）专为与HTX中心的成像和数据管理系统无缝集成而设计，用于在1,536孔筛选中识别阳性结果，并通过人工参与对排序后的结果列表进行审查。此外，该GUI作为在GitHub上提供的开源软件，可方便地进行修改，以满足其他实验室团队的特定需求。

本文介绍了使用机器人液体处理系统将筛选试剂和蛋白质同时加入油下微批量高通量实验的设置过程。HTX中心拥有一套独特的仪器设备和资源，这些在其他机构中并不常见，其目标是为有需求的用户提供筛选服务和教育资源。展示机器人辅助的高通量技术的方法与能力，将使科研界了解现有技术，并为其自身的结构解析工作做出决策提供依据。

方案

1. 准备或购买用于十六个96孔深孔板的混合液

  1. 通过将试剂分配至96孔深孔（DW）板中，制备实验室自制的化学试剂混合物。使用自动化液体处理仪分配并混合盐、缓冲液、聚合物和水的储备溶液。
  2. 使用自动化液体处理仪或多通道移液器，向已商业购买的96孔DW板筛选体系中添加额外组分，以制备经实验室改良的化学试剂混合物。
  3. 购买市售的DW板。
  4. 将标记好的96孔DW板在−20 °C条件下保存12至18个月。
    ​注意：步骤1.1和1.2中制备的试剂混合物共填充10/16块96孔DW板，另有5/16块96孔DW板直接使用购买的产品。在进行1,536孔板加样时，需同时设置一块96孔DW板，以避免添加剂筛选体系发生沉淀（见第3节）。

2. 将混合液分装至384孔板

  1. 将96孔深孔板在4 °C下过夜解冻。在开始制备384孔板前，将其恢复至室温（20–23 °C）。
    注意：室温条件适用于配制混合试剂板。制备这些板时主要需避免产生沉淀，因为沉淀可能堵塞液体处理设备，并导致混合试剂中各组分浓度发生不可预知的变化。
  2. 根据需要通过倒置充分混匀深孔板，以溶解任何持续存在的不透明沉淀。若某些孔中仍有沉淀，可将深孔板在30 °C下温育以促进溶解。
  3. 使用配备96通道注射器或移液头的液体处理机器人，将四个96孔深孔板中的混合试剂各50 µL转移至一个384孔板中。四个96孔深孔板的样品以象限方式分配至384孔板（例如，96-DW1的A1孔转移至384-plate1的A1孔，96-DW2的A1孔转移至384-plate1的B1孔，依此类推）（图3）。
  4. 将16个96孔深孔板中的15个转移至384孔板中用于储存。
  5. 将384孔板在−20 °C下保存，最长可保存6个月，用于后续1,536孔板的制备。

3. 准备含油和结晶溶液的1,536孔板

  1. 使用具备缓慢吸液和加样能力的机器人液体处理系统，向每块1,536孔板的每个孔中加入5 µL石蜡油。将含油的板子在4 °C下储存，最长可保存6个月。
  2. 将第2节中的384孔板在4 °C下过夜解冻。翻转板子以混匀溶液并溶解沉淀物。将板子在30 °C下孵育，以溶解持续存在的沉淀物。
  3. 为制备添加剂筛选组分，使用最终的96孔深孔板（其中含有0.1 M HEPES pH 6.8和30% PEG3350），通过液体处理机器人或多通道移液器将其与商业添加剂筛选试剂混合。
  4. 通过将步骤3.3中制备的缓冲PEG3350溶液与添加剂筛选试剂按1:1比例混合，向相应的384孔板中每孔分配50 µL，制备添加剂筛选溶液。
  5. 使用配备384针筒或移液头的液体处理机器人，向1,536孔板的每个孔中加入200 nL的混合溶液。将四块384孔板“印制”到1,536孔板中，使四个象限被填满（例如，384-板1的A1孔对应1,536孔板的A1孔，384-板1的A2孔对应1,536孔板的A3孔，依此类推）（图3）。
  6. 在将板子于4 °C储存最多4周之前，先以150 × g离心5分钟。

4. 样品提交

  1. 提交样品前，请在即将进行的筛选实验截止日期前发送预约邮件。邮件中需注明筛选实验的数量、样品名称、项目负责人（PI）及所属机构，以及样品所需的任何特殊处理要求。筛选实验大约每月进行一次，每年共进行12次。
  2. 在寄送样品前，完成样品提交表单。
    1. 新用户需设置一个密码，该密码将在第7节中用于下载结晶图像。
    2. 已有账户的用户请使用现有密码，或在此步骤中更改密码。
  3. 将样品置于1.5 mL离心管中提交。确保大分子样品均一且浓度足够高，以促进结晶。使用预结晶测试（通常包含硫酸铵或PEG 4,000）来评估合适的样品浓度，通过观察不同浓度样品是否形成澄清液滴或出现沉淀来判断34。
    注意：在提交样品前，可进行多种质量检测以评估纯度和均一性，包括SDS-PAGE、凝胶过滤和动态光散射（DLS）等。即使存在微量杂质，也可能影响结晶过程。目前，建立一块1,536孔板需要500 µL样品体积。相关测试正在进行中，以降低所需样品体积。
    1. 避免使用浓度高于50 mM的缓冲液，以及可能在筛选过程中结晶的磷酸盐。
    2. 避免使用过量增溶剂，包括浓度高于10% w/v的甘油。
  4. 使用干冰、湿冰或冰袋将样品包装于密封容器中，确保运输过程中维持适当的温度。
  5. 在实验运行期间，于周一至周三通过优先加急快递寄送样品。
  6. 样品寄出后，请发送邮件提供快递单号。

5. 在制备好的1,536孔板中进行样品设置

  1. 拆包样品后，立即在用户指定的温度下进行孵育。
  2. 解冻后，将样品在10,000 × g 室温下静置2分钟。在设置前目视观察样品，以确定是否存在沉淀、颜色变化及样品状态。
  3. 将1,536孔板预热至23 °C，并在150 × g条件下离心 g 孵育5分钟。使用明场成像对仅含混合液的孔板进行成像，作为阴性对照。
    注意：所有孔板在加样前均需进行明场成像，以便识别在加入样品前已含有晶体或碎屑的孔，作为阴性对照。此外，该步骤还可用于识别结晶缓冲液出现异常的孔 不 已送达。将培养板恢复至室温可消除板表面的冷凝水，从而获得清晰的图像。
  4. 使用液体处理机器人将200 nL样品加入1,536孔板的每个孔中。以150 × g 并将培养板置于 4 °C、14 °C 或 23 °C 培养。
    ​注意：微批量油下实验可通过手动将蛋白质和混合液滴加至所需油相下方来设置。然而，为获得可重复的结果，建议每种蛋白质和混合液的用量不少于1 µL。

6. 监测1,536孔板中晶体的形成

  1. 样本加入1,536孔板后，在第1天、第1周、第2周、第3周、第4周和第6周进行明场成像。
  2. 在23 °C培养的样品，于第4周时间点进行SHG和紫外双光子激发荧光（UV-TPEF）的SONICC成像；在14 °C或4 °C培养的样品，于第6周时间点进行上述成像。
    ​注意：对于高通量1,536微孔板，SONICC成像的时间点设定在第4周和第6周，因为晶体通常会在这些时间点出现。对于在油下微批量法或蒸汽扩散实验中使用的96孔板，建议在更早的时间窗口内进行SONICC成像。
  3. 使用内部LIMS系统自动将实验图像传输至用户账户，并通知用户 通过 一个自动化的 HTSLab 电子邮件守护进程，用于通知成像已完成。

7. 图像分析

  1. 从 HWI 的 FTP 站点获取每个 .rar 文件的筛查图像。
    注意：1,536孔板筛选产生的图像输出包含多个文件，其中包括明场图像、SHG图像和紫外双光子激发荧光（UV-TPEF）图像。每种成像模式或时间点对应一个独立的.rar文件。每个.rar文件解压后，包含使用特定成像模式在特定时间点采集的1,536孔板中每个孔的图像。
    1. 使用 FileZilla 客户端或其他选项访问 ftp 数据。
      注意：建议使用 FileZilla 客户端来管理大量文件传输，以最大限度地减少计算崩溃。
      1. 如果需要在用户计算机上安装 FileZilla 客户端，请下载 FileZilla 软件。
      2. 如果 FileZilla Client 已安装或在安装完成后，单击 FileZilla 图标 打开软件。
      3. 使用 FileZilla 输入主机 ftp 网站地址、用户名和密码，登录远程 ftp 服务器。
      4. 将 .rar 文件下载到目标目录。
  2. 使用由人工智能驱动的开源图形用户界面查看、评分和分析结晶图像。
    注意：该图形用户界面（GUI）可在大多数 Windows、Mac 和 Linux 操作系统（OS）上使用，相关操作系统的下载说明可在 GitHub 网站获取。MARCO Polo 是一个开源的图形用户界面，整合了高通量结晶中心（HTX Center）所采用的 1,536 孔高通量结晶筛选实验的元数据。该界面可由任何人从 GitHub 下载，并可根据其他实验室团队的特定需求进行修改。
    1. 下载文件后，在图形界面中打开 .rar 文件（参见 补充图 S1).
      1. 点击 导入，选择 图像 从下拉菜单中，然后选择 从 RAR 压缩包/目录.
      2. 点击 浏览文件夹 在弹出窗口中，然后导航到包含图像的文件夹。
      3. 选择所需的文件，然后通过点击导入到图形用户界面中 打开. 等待文件出现在 精选路径 窗口。在图形用户界面中选择一个或多个文件以下载，并点击 导入运行.
    2. 查看窗口中第一个孔的图像 幻灯片查看器 通过点击图形用户界面中的 > 在样本名称左侧点击符号，然后通过双击选择相应的图像读取方式（读取方式按日期和图像类型列出——明场、紫外双光子激发荧光或二次谐波生成）。
    3. 通过调整整个窗口的大小来放大图像。 图像详情 方框包含有关图像的信息，包括评分信息（在读取结果评分前为空）。 鸡尾酒详情 盒子包含有关鸡尾酒成分的元数据。
    4. 通过点击进入下一个孔 下一步 按钮在 导航 面板或按键盘上的右箭头键。通过在井号输入框中输入井号来导航至特定孔。 按孔编号 窗。
    5. 通过勾选来查看所有已导入图形用户界面的测序读段 显示所有日期 盒子
    6. 通过勾选查看所有已导入图形用户界面中的光谱 显示所有光谱 盒。单击 光谱交换 单击按钮以单独查看每个光谱图像。
  3. 使用 MARCO 算法对晶体图像进行评分，首先在窗口左侧列表中高亮选择特定的运行项，然后点击 分类选定运行 按钮。在 MARCO 评分信息中查看 图像详情 在对全部1,536个孔完成成像读数评分后，即可关闭窗口。
    注意：分类所需时间通常为 2-5 分钟，具体取决于计算机的速度和可用内存。该算法会生成将内容分类的评分 "晶体", "清晰", "沉淀物"，或 "其他" 类别。每个孔的分类所关联的数值反映了该孔包含此类对象的可能性。
    1. 通过勾选所需选项框来查看部分已评分的图像 图像滤波 面板并点击 提交筛选条件 按钮。例如，通过勾选由 MARCO 分类为晶体的图像复选框，仅查看这些图像 晶体 以及 MARCO 盒子并点击 提交筛选条件.
  4. 手动评分晶体图像以生成 "人类评分" 设置。通过点击相应的按钮为孔分配评分（该 "晶体", "清晰", "沉淀物"，或 "其他" 按钮位于 分类 窗口底部的面板）。或者，使用键盘上的数字小键盘来分配评分（1 = "晶体", 2 = "清除", 3 = "沉淀物", 4 = "其他"）。将一个人工评分的图像指定为 "收藏" 通过勾选 收藏？ 盒子
    注意：仅通过勾选由人工分类为晶体的图像来查看 晶体 以及 人类 盒子并点击 提交筛选条件. 点击 收藏夹 框内 过滤 面板进一步筛选返回的图像，仅返回被人工评分且标记为收藏的晶体图像。
  5. 使用 平板观察仪 标签可同时查看多个孔。在第二个 平板观察仪 选项卡中的 对照组 面板中，从下拉菜单选择 16、64 或 96 张图像 每板图像数 部分。使用 图像滤波选项卡 以灰显方式处理不感兴趣的图像。选择 应用滤镜 用于筛选图像的盒子。
    注意：例如，选择 "人类" 和 "晶体" 盒子中，只有经人工判定为晶体的孔才会清晰可见。
    1. 导航至 平板观察仪 点击标签 下一步 单击按钮以查看下一组16/64/96张图像。默认情况下，被评分为空晶的图像显示为红色，清晰的图像显示为蓝色，被评分有沉淀的图像显示为绿色，其他类型的图像显示为橙色。可通过下拉菜单更改颜色。
    2. 通过勾选相应复选框，选择要在孔板上显示的信息 标签 表。
    3. 点击 保存 视图 保存当前视图的图像文件。
    4. 点击 光谱交换 在多孔图像中切换明场、二次谐波成像（SHG）和紫外双光子激发荧光（UV-TPEF）图像。
  6. 点击 导出，然后从下拉菜单中选择适当的文件类型，以导出评分文件供其他程序使用。
    注意：CSV（逗号分隔值）文件可与 Microsoft Excel 或 Google Sheets 等电子表格程序兼容。JSON（JavaScript 对象表示法）文件可用大多数文本编辑器打开。PPTX（PowerPoint 演示文稿）可用于展示来自 Polo 的图像，包括明场、紫外双光子激发荧光（UV-TPEF）和二次谐波生成（SHG）图像的比较。文件以 .xtal 格式保存，以便在 MARCO Polo 图形用户界面（GUI）中重新打开。
    1. 单击以保存 .xtal 格式文件 文件 在页面顶部，然后选择 保存运行 或 保存运行为提供文件名和目录路径。
    2. 单击以打开 .xtal 格式文件 导入 并选择 图像 然后 从已保存的运行. 浏览至适当的文件位置，单击文件名，然后单击 打开.

结果

1,536孔晶体筛选实验的结果包括在第0天（阴性对照）、第1天、第1周、第2周、第3周、第4周和第6周采集的七套完整的明场图像集（图4）。对于在23 °C下孵育的板，SONICC图像在第4周采集；而对于在4 °C或14 °C下孵育的板，SONICC图像则在第6周采集。总体而言，一旦样品寄出，用户可预计在样品到达后的1天内完成板的设置。图像将在采集后陆续上传。晶体筛选实验在6周后结束。

1,536 孔板的设置使得所有筛选实验均可在同一个板上进行，从而减少了样品消耗，并便于不同成像模式之间的成像和直接比较。图 4展示了单一混合条件下的晶体生长时间过程的代表性结果。在整个实验过程中对板进行自动成像，可通过明场成像识别快速和缓慢生长的晶体。紫外双光子激发荧光（UV-TPEF）和二次谐波产生（SHG）成像可用于对明场成像中观察到的阳性信号进行交叉验证，并分别表明所观察到的晶体具有蛋白质性质和晶体结构（图 5A、B）。此外，非线性相干成像（SONICC）能够识别因沉淀物或膜状物遮挡而难以观察的晶体（图 5C），或可能被误判为沉淀物的微晶（图 5D）。对于某些晶体，缺乏 SHG 信号并不能排除其为晶体的可能性，因为某些点群本身不产生 SHG 信号35,36，如 图 5C 中的四方晶系甜蛋白（thaumatin）晶体所示。相反，对于不含色氨酸残基的蛋白质，预期将缺乏 UV-TPEF 信号。UV-TPEF 和 SHG 信号的观察还有助于识别非蛋白质的盐晶体，这类晶体在明场下可见，并表现出强烈的正性 SHG 信号，但无 UV-TPEF 信号（图 5E）。

借助 MARCO Polo 图形用户界面（GUI），可简化针对板式设置的图像分析流程，该界面还集成了从 HWI 服务器进行 ftp 数据传输的功能（可作为使用 FileZilla 传输文件的替代方案）。MARCO Polo GUI 支持便捷地浏览板式和图像，并利用 MARCO 算法进行计算图像评分，从而使用户能够快速从 HTX 中心下载、查看和分析图像结果。在 MARCO Polo GUI 中实现的 MARCO 评分算法，能够在不到 5 分钟的时间内完成对整个 1,536 孔板图像的评分。由 MARCO 算法标记为结晶的图像可由 Polo GUI 进一步按评分排序并显示。由于 MARCO 算法在优化过程中侧重于晶体识别并尽可能减少假阴性，以避免遗漏任何阳性结果，因此可能产生假阳性标记。然而，MARCO 算法能够将需人工检查的图像范围缩小至最有可能含有晶体的孔位，从而显著减轻用户的数据处理负担。该算法在用户友好的 MARCO Polo 查看平台中实现了便捷集成，并具备根据 MARCO 评分对图像进行排序的功能，极大提升了用户快速分析数据集并准确判定晶体阳性结果的能力。

蛋白质结晶过程示意图；1,536孔板设置，包含成像和机器人操作，晶体生长。
图 1：HTX中心开展的高通量1,536孔结晶筛选实验示意图。 （1）此步骤中，向每孔加入5 µL石蜡油和200 nL试剂混合液（实验方案步骤3.1和步骤3.5）。右侧展示了一个仅含油和混合液的孔的示意图及代表性图像。（2）样品送达HTX中心（实验方案步骤5.1）。（3）此步骤中，向每孔加入200 nL样品（实验方案步骤5.4）。（4）通过明场成像对全部1,536个孔随时间进行监测，（5）同时结合紫外双光子激发荧光（UV-TPEF）和二次谐波产生（SHG）模式（实验方案步骤6）。（6）使用基于人工智能的开源图形用户界面（GUI）查看、评分和分析结晶图像（实验方案步骤7）。缩写：HTX = 高通量结晶；UV-TPEF = 紫外双光子激发荧光；SHG = 二次谐波产生；AI = 人工智能；GUI = 图形用户界面。 请点击此处查看该图的放大版本。

显微成像微孔板：明场、紫外-双光子激发荧光（UV-TPEF）、二次谐波生成（SHG）用于光子实验分析。
图2：单个包含筛选实验的1,536孔板，通过明场、紫外-双光子激发荧光（UV-TPEF）和二次谐波生成（SHG）成像技术进行成像。 图中上方展示了以一枚美国1美分硬币作为尺寸参照的1,536孔板。每个筛选实验在设置前进行一次明场成像，并在加样后进行六次明场成像（共七组明场图像，左侧）。这些孔板在4周或6周时分别接受紫外-双光子激发荧光成像（UV-TPEF，中部）和二次谐波生成成像（SHG，右侧）。缩写：UV-TPEF = 紫外-双光子激发荧光；SHG = 二次谐波生成。 请点击此处查看该图的放大版本。

高通量检测工作流程；从96孔板到384孔板，再到1536孔板示意图。
图3：示意图展示1,536孔板的生成过程。 使用十六个96孔深孔板（DW）将四个384孔板打孔成型，每个384孔板的每个象限通过分配结晶试剂混合物填充。四个96孔深孔板填充一个384孔板（中）。四个384孔板用于打孔成型单个1,536孔板（右）。缩写：DW = deep well（深孔）。 请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-4明场与SHG显微成像；六周内的结晶过程；第4周UV-TPEF分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65211/65211fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4">
图4：1,536孔筛选实验中单个孔的代表性时间进程。 在样品设置前（第0天）、第1天、第1周、第2周、第3周、第4周和第6周进行明场成像。在23 °C孵育的平板于第4周使用SONICC成像。比例尺 = 80 µm（明场），200 µm（SHG，UV-TPEF）。缩写：SONICC = 手性晶体的二阶非线性成像；UV-TPEF = 紫外双光子激发荧光；SHG = 二次谐波生成。 请点击此处查看该图的放大版本。

晶体样品的明场、紫外双光子激发荧光、二次谐波显微成像；光学表征与光谱分析。
图 5：高通量 1,536 孔晶体筛选实验的代表性成像结果。 显示了五个示例孔的明场、紫外双光子激发荧光（UV-TPEF）和二次谐波生成（SHG）成像结果。(A,B) 蛋白质晶体在明场、UV-TPEF 和 SHG 三种成像模式下均清晰可见。(C) 在明场成像中被膜遮挡的蛋白质晶体可通过 UV-TPEF 成像观察到；但由于点群不兼容，该晶体在 SHG 成像中未被检测到。(D) 通过 UV-TPEF 和 SHG 成像确认的微晶示例，若无此技术可能被误判为沉淀物。(E) 盐晶体在明场和 SHG 成像中呈现晶体形态，但无 UV-TPEF 信号。比例尺 = 200 µm。孔直径 = 0.9 mm。缩写：UV-TPEF = 紫外双光子激发荧光（UV-two-photon excited fluorescence）；SHG = 二次谐波生成（second harmonic generation）。请点击此处查看本图的高清版本。

补充图 S1：在 MARCO Polo 中打开图像文件。 图像文件可通过在 MARCO Polo 图形用户界面中导航至 导入 | 图像 顶部的标签（a）。请注意，文件也可以传输 通过 的 从 FTP 工具可直接在 MARCO Polo 中使用（a），或如第 7.2 步协议所述通过 FileZilla 传输。要导入已下载的文件，请选择 图像 | 从 Rar 压缩包/目录在弹出的窗口中，选择 浏览文件夹 （b）并导航至保存微孔板图像文件的文件目录。文件加载后 精选路径 窗口 (c)，选中一个文件，然后点击 导入运行 （d）MARCO Polo 图形用户界面将识别出正确的 鸡尾酒文件 与图像一同导入的元数据 请点击此处下载此文件。

讨论

该方法描述了一种高通量蛋白质结晶筛选流程，在微滴油封条件下，仅需500 µL样品即可完成1,536个独立的结晶实验。该流程依赖液体处理机器人，可快速且可重复地辅助实验设置，同时结合计算图像分析资源MARCO Polo，该资源已定制化用于通过MARCO算法分析1,536孔板图像，以识别并分离出晶体阳性结果。

单个筛选液滴的体积很小（样品与混合液以1:1比例混合，总体积为400 nL），这意味着仅需极少量的样品即可确定具有结晶的阳性条件。这种微小的液滴尺寸必然产生微小晶体，无法通过传统的 loop 法捞取。已有方法被开发用于从1,536孔板中收获晶体37；此外，含有晶体的板也可直接用于同步辐射光源的原位（in situ）数据收集38。如果能够开发出可靠的晶体收获方法，结合同步辐射技术的进步和微聚焦光束的应用，将有望获得更有价值的衍射数据集。此外，所获得的 晶体还可作为种子，用于后续的结晶优化工作。

SONICC成像在识别微小蛋白质晶体以及隐藏于沉淀物下方的蛋白质晶体方面具有明显优势。尽管如此，并非所有样品类型都适用于SHG和紫外双光子激发荧光（UV-TPEF）成像。例如，含有极少或不含芳香族色氨酸残基的蛋白质将表现出不明确的UV-TPEF信号。此外，属于特定空间群的晶体（包括中心对称空间群或点群432）无法通过SHG成像检测到。含有荧光团的样品有时会干扰SHG信号，导致信号被抵消或强度增强，因此对于含金属的蛋白质或含有荧光基团的蛋白质，需谨慎解读SHG信号。然而，在多数情况下，可以合理解释SHG或UV-TPEF信号的缺失，因此这些信号的缺乏并不一定排除蛋白质晶体存在的可能性。

微批量油下法为高通量晶体学中更常用的气相扩散法提供了一种替代方案。重要的是，结晶方法会影响初筛结果的识别39，这为在高通量筛选中采用不同结晶方法提供了依据。自动化成像和基于SONICC的技术有助于在为期6周的实验过程中快速识别蛋白质晶体。最后，MARCO Polo图形用户界面（GUI）使用户能够快速分析1,536个条件下的图像，以确定具有潜力的初筛阳性孔用于后续优化。HTX中心所具备的能力，包括由机器人支持的高通量实验系统，以及先进的成像和计算分析工具，为结构生物学领域做出了重要贡献，帮助研究人员有效应对基于晶体的结构研究中的一个主要瓶颈：寻找合适的结晶条件。

披露

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

我们衷心感谢用户将珍贵的样品委托给我们进行晶体筛选，同时也感谢他们提供的宝贵反馈和建议，这些意见帮助我们不断完善和开发资源，以更好地服务于结构生物学领域。我们还要感谢Ethan Holleman、Lisa J Keefe博士和Erica Duguid博士，他们推动了MARCO Polo图形用户界面（GUI）的开发。我们感谢HWI同事的支持与建议，特别是Diana CF Monteiro博士。本研究获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）基金项目R24GM141256的资助支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1536 孔 Imp@ct LBR LoBaseGreiner Bio-One790 801
乙酸Hampton ResearchHR2-853
AlumaSeal II 密封膜Hampton ResearchHR8-069
溴化铵Molecular DimensionsMD2-100-247
氯化铵Hampton ResearchHR2-691
氢氧化铵Hampton ResearchHR2-855
硝酸铵Hampton ResearchHR2-665
磷酸氢二铵Hampton ResearchHR2-629
磷酸二氢铵Hampton ResearchHR2-555
硫酸铵Hampton ResearchHR2-541
硫氰酸铵Molecular DimensionsMD2-100-301
Bicine pH 9.0Hampton ResearchHR2-723
Bis-tris 丙烷 pH 7.0Hampton ResearchHR2-993-08
乙酸钙Hampton ResearchHR2-567
二水氯化钙Hampton ResearchHR2-557
CAPS pH 10.0Rigaku Reagents未提供
透明密封膜Hampton ResearchHR4-521
七水硫酸钴Molecular DimensionsMD2-100-42
Crystal Screen HT 筛选试剂盒Hampton ResearchHR2-130
FormulatorFormulatrix
甘油Hampton ResearchHR2-623
Gryphon 液体处理机器人Art Robbins Instruments
HEPES pH 7.0Hampton ResearchHR2-902-03
HEPES pH 7.5Hampton ResearchHR2-902-08
HWI HTX 中心样品提交表https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/    
盐酸Hampton ResearchHR2-581
Index HT 筛选试剂盒Hampton ResearchHR2-134
离子液体筛选试剂盒Hampton ResearchHR2-214
溴化锂Molecular DimensionsMD2-100-312
氯化锂Hampton ResearchHR2-631
一水硫酸锂Hampton ResearchHR2-545
四水乙酸镁Hampton ResearchHR2-561
六水氯化镁Hampton ResearchHR2-559
六水硝酸镁Hampton ResearchHR2-657
七水硫酸镁Hampton ResearchHR2-821
四水氯化锰Millipore Sigma63535-50G
一水硫酸锰Molecular DimensionsMD2-100-310
MARCO Polo 图形用户界面下载https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/
Matrix Platemate 2 x 3 液体处理机器人Thermo Scientific
MES pH 6.0Hampton ResearchHR2-943-09
Mosquito 液体处理机器人SPTLabtech
石蜡油/白色矿物油，赛波特黏度 340-365（100 °F） Sigma AldrichPX0045-3
PEG 1000Hampton ResearchHR2-523
PEG 2000Hampton ResearchHR2-592
PEG 20000Hampton ResearchHR2-609
PEG 3350Hampton ResearchHR2-527
PEG 400Hampton ResearchHR2-603
PEG 4000Hampton ResearchHR2-529
PEG 6000Hampton ResearchHR2-533
PEG 8000Hampton ResearchHR2-535
PEG/Ion HT 筛选试剂盒Hampton ResearchHR2-139
PEGRx HT 筛选试剂盒Hampton ResearchHR2-086
板位预约htslab@hwi.buffalo.edu
乙酸钾Hampton ResearchHR2-671
溴化钾Hampton ResearchHR2-779
碳酸钾Molecular DimensionsMD2-100-311
氯化钾Hampton ResearchHR2-649
硝酸钾Hampton ResearchHR2-663
磷酸氢二钾Hampton ResearchHR2-635
磷酸二氢钾Hampton ResearchHR2-553
磷酸三钾Molecular DimensionsMD2-100-309
硫氰酸钾Hampton ResearchHR2-695
配备 SONICC 的 Rock Imager 1000Formulatrix
Rock Imager 54Formulatrix
氯化铷Millipore SigmaR2252-10G
SaltRx HT 筛选试剂盒Hampton ResearchHR2-136
Silver Bullets 筛选试剂盒Hampton ResearchHR2-096
Slice pH 筛选试剂盒Hampton ResearchHR2-070
乙酸钠 pH 5.0Hampton ResearchHR2-933-15
溴化钠Hampton ResearchHR2-699
氯化钠Hampton ResearchHR2-637
柠檬酸钠 pH 4.2Hampton ResearchHR2-935-01
柠檬酸钠 pH 5.6Hampton ResearchHR2-735
氢氧化钠Hampton ResearchHR2-583
二水钼酸钠Molecular DimensionsMD2-100-207
硝酸钠Hampton ResearchHR2-661
磷酸二氢钠Hampton ResearchHR2-551
五水硫代硫酸钠Molecular DimensionsMD-100-307
StockOptions Polymer 筛选试剂盒Hampton ResearchHR2-227
Tacsimate pH 7Hampton ResearchHR2-755
TAPS pH 9.0bioWORLD40121071
Tris pH 8Hampton ResearchHR2-900-11
Tris pH 8.5Hampton ResearchHR2-725
ViaFLO 384Integra
ViaFLO 384 384 通道移液头（0.5–12.5µL）Integra
ViaFLO 384 96 通道移液头（300µL）Integra
二水乙酸锌Hampton ResearchHR2-563

参考文献

  1. PDB data distribution by experimental method and molecular type. RCSB Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/summary (2022).
  2. Maveyraud, L., Mourey, L. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), 1030(2020).
  3. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  4. Elbasir, A., et al. DeepCrystal: A deep learning framework for sequence-based protein crystallization prediction. Bioinformatics. 35 (13), 2216-2225 (2019).
  5. Zucker, F. H., et al. Prediction of protein crystallization outcome using a hybrid method. Journal of Structural Biology. 171 (1), 64-73 (2010).
  6. George, A., Wilson, W. W. Predicting protein crystallization from a dilute solution property. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (4), 361-365 (1994).
  7. Jia, Y., Liu, X. -Y. From surface self-assembly to crystallization: prediction of protein crystallization conditions. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6949-6955 (2006).
  8. Slabinski, L., et al. XtalPred: A web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
  9. Abrahams, G. J., Newman, J. BLASTing away preconceptions in crystallization trials. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (3), 184-192 (2019).
  10. Rosa, N., et al. Tools to ease the choice and design of protein crystallisation experiments. Crystals. 10 (2), 95(2020).
  11. Newman, J., et al. On the need for an international effort to capture, share and use crystallization screening data. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (3), 253-258 (2012).
  12. Lynch, M. L., Dudek, M. F., Bowman, S. E. A searchable database of crystallization cocktails in the PDB: analyzing the chemical condition space. Patterns. 1 (4), 100024(2020).
  13. Jancarik, J., Kim, S. -H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24 (4), 409-411 (1991).
  14. Carter, C. W. Efficient factorial designs and the analysis of macromolecular crystal growth conditions. Methods. 1 (1), 12-24 (1990).
  15. McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: An alternative strategy for crystallizing macromolecules. Journal of Structural Biology. 156 (3), 387-406 (2006).
  16. McPherson, A., Nguyen, C., Cudney, R., Larson, S. The role of small molecule additives and chemical modification in protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (5), 1469-1474 (2011).
  17. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  18. Thakur, A. S., et al. Improved success of sparse matrix protein crystallization screening with heterogeneous nucleating agents. PLoS One. 2 (10), 1091(2007).
  19. Chayen, N. E., Stewart, P. D. S., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil-a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
  20. Luft, J. R., et al. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 142 (1), 170-179 (2003).
  21. Luft, J. R., Snell, E. H., DeTitta, G. T. Lessons from high-throughput protein crystallization screening: 10 years of practical experience. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 465-480 (2011).
  22. Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. 20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. , (2023).
  23. Segelke, B. W. Efficiency analysis of sampling protocols used in protein crystallization screening. Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 553-562 (2001).
  24. Luft, J. R., Newman, J., Snell, E. H. Crystallization screening: the influence of history on current practice. Acta Crystallographica Section F. 70 (7), 835-853 (2014).
  25. Mlynek, G., Kostan, J., Leeb, S., Djinovic-Carugo, K. Tailored suits fit better: Customized protein crystallization screens. Crystal Growth & Design. 20 (2), 984-994 (2019).
  26. Mueller-Dieckmann, J. The open-access high-throughput crystallization facility at EMBL Hamburg. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (12), 1446-1452 (2006).
  27. Weber, P., et al. High-throughput crystallization pipeline at the crystallography core facility of the Institut Pasteur. Molecules. 24 (24), 4451(2019).
  28. Lin, Y. What's happened over the last five years with high-throughput protein crystallization screening. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (8), 691-695 (2018).
  29. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55 (4), 379-386 (2011).
  30. Madden, J. T., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Two-photon excited UV fluorescence for protein crystal detection. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 839-846 (2011).
  31. Fleming, A. M., et al. Second harmonic generation interrogation of the endonuclease APE1 binding interaction with G-quadruplex DNA. Analytical Chemistry. 94 (43), 15027-15032 (2022).
  32. Bruno, A. E., et al. Classification of crystallization outcomes using deep convolutional neural networks. PLoS One. 13 (6), 0198883(2018).
  33. Holleman, E. T., Duguid, E., Keefe, L. J., Bowman, S. E. Polo: An open-source graphical user interface for crystallization screening. Journal of Applied Crystallography. 54 (2), 673-679 (2021).
  34. Niesen, F. H., et al. An approach to quality management in structural biology: Biophysical selection of proteins for successful crystallization. Journal of Structural Biology. 162 (3), 451-459 (2008).
  35. Padayatti, P., Palczewska, G., Sun, W., Palczewski, K., Salom, D. Imaging of protein crystals with two-photon microscopy. Biochemistry. 51 (8), 1625-1637 (2012).
  36. Haupert, L. M., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Modeling the SHG activities of diverse protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (11), 1513-1521 (2012).
  37. Luft, J. R., Grant, T. D., Wolfley, J. R., Snell, E. H. A new view on crystal harvesting. Journal of Applied Crystallography. 47 (3), 1158-1161 (2014).
  38. Bruno, A. E., Soares, A. S., Owen, R. L., Snell, E. H. The use of haptic interfaces and web services in crystallography: An application for a 'screen to beam' interface. Journal of Applied Crystallography. 49 (6), 2082-2090 (2016).
  39. Baldock, P., Mills, V., Stewart, P. S. A comparison of microbatch and vapour diffusion for initial screening of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 168 (1-4), 170-174 (1996).

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