通过3C获得A：面向本科生的染色体构象捕获技术

摘要

本文详细介绍了染色体构象捕获（3C）技术的一种改进方法，重点强调本科生的参与和学习过程。

摘要

染色体构象捕获（3C）是一种强大的工具，衍生出一系列类似的技术（例如 Hi-C、4C 和 5C，本文统称为 3C 技术），可提供染色质三维结构的详细信息。3C 技术已被广泛应用于多种研究中，从监测癌细胞中染色质结构的变化，到鉴定增强子与基因启动子之间的相互作用。尽管许多使用这些技术的研究着眼于复杂的样本类型（即单细胞分析）并提出全基因组范围的重大科学问题，但人们常常忽略的是，3C 技术建立在基础分子生物学方法之上，适用于多种类型的研究。通过聚焦于染色质结构的特定科学问题，这一前沿技术可用于提升本科生科研与教学实验课程的体验。本文介绍了一种 3C 实验方案，并针对以本科生为主的教育机构，在本科生科研与教学实践中实施该技术提供了相应的调整建议与重点说明。

引言

生物体的基因组不仅包含发挥功能所需的所有基因，还包含如何以及何时使用这些基因的全部指令。这使得调控对基因组的可及性成为细胞最重要的功能之一。尽管存在多种控制基因功能的机制，但从基本层面来看，基因调控归结为调控性转录因子（转-因子）结合到其特异的DNA序列（顺式-调控序列）。这种能力并非与生俱来，而是由细胞核内基因组的组织/结构所调控，后者控制着这些序列的可及性/暴露程度 顺式-调控序列到 转-因素^1,2,3。如果 转-因子无法找到其 顺式-调控序列，然后 转因子无法执行其调控功能。这使得理解基因组在细胞核中的组织方式成为重要的研究课题。

普遍认为，在间期，真核生物细胞核内的染色体占据各自独立的区域，并锚定于核纤层和核基质上图1），从而使染色体更像一块披萨片，而不是盘中的一根意大利面条。染色体通过蛋白质-DNA相互作用（染色质）实现部分压缩，这些相互作用使染色体的某些区域发生扭曲和成环。通过电子显微镜和三维DNA荧光技术 原位 杂交（FISH）以及DNA标记技术（如荧光标记和人工DNA甲基化）发现，染色质的非活性区域紧密聚集在细胞核边缘^4,5,6而活跃的、松散程度较高的染色质区域则位于细胞核内部^7,8,9,10这些实验能够提供染色体动态的全景视角，但在捕捉DNase中观察到的基因启动子区域附近的局部变化方面作用有限。^11,12 和核小体^13,14,15 研究。

揭示更高分辨率染色质动态的关键在于三维染色体作图技术（3C）的建立。3C技术本身包含四个主要步骤：染色质交联、限制性内切酶消化染色质、染色质连接以及DNA纯化（图2）。通过该过程生成的新型人工DNA片段可被进一步表征，以揭示线性距离较远的DNA片段之间的紧密物理关联¹⁶。3C技术成为多种衍生技术的基础，这些技术利用3C的初始步骤来回答更广泛的全基因组问题（例如Hi-C、4C、ChIP-C）。这一系列3C技术已发现染色体被组织成多个离散的单元，称为拓扑关联结构域（TADs）。TADs由基因组编码，其特征是由未形成环的边界所夹持的染色质环结构^16,17,18,19。TAD边界由两个在进化上保守且普遍存在的因子维持，即CCCT结合因子（CTCF）和黏连蛋白（cohesion），它们阻止不同TAD内的环状结构相互作用^16,20。这些染色质环的形成依赖于反式作用因子与其调控序列之间的相互作用，以及CTCF和黏连蛋白的参与²¹。

尽管许多使用3C技术的研究提出的是全基因组范围的广泛问题，并采用复杂的样品采集技术，但3C技术的基本原理建立在基础分子生物学技术之上。这使得3C技术在本科科研和教学实验中具有很高的应用价值。3C技术可用于回答范围较小、目标明确的问题，并且本质上具有良好的可扩展性（可应用于单个基因²²、染色体¹⁶和/或全基因组¹⁸），具体取决于研究问题的焦点和方向。该技术已被广泛应用于多种模式系统^7,16,19,23，并被证实具有高度的灵活性和适用性。因此，3C技术非常适合本科生学习：学生在掌握常用分子生物学技术的同时，还能获得针对特定科学问题开展研究的宝贵经验。

本文提供了一种基于先前已发表方案^24,25,26,27的3C文库构建的改进方案。该方案已针对约1 × 10⁷个细胞进行优化，但即使使用低至1 × 10⁵个细胞也能成功构建3C文库。该方案具有良好的通用性，已成功用于从斑马鱼胚胎、斑马鱼细胞系以及年轻成虫期（YA）秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中制备3C文库。本方案同样适用于哺乳动物细胞系，经进一步调整后也可用于酵母。

这些改进的目的是使3C技术更易于本科生掌握。在设计过程中，特别注意采用与本科生教学实验室中可实现的技术相类似的方法。3C技术为本科生提供了丰富的学习机会，有助于他们掌握基本的分子生物学技术，从而在实验操作、课堂教学以及毕业后的科研或职业发展中受益。

方案

1. 引物设计

注意：3C 引物设计工具可在线获取²⁸。或者，学生也可自行设计定制引物（见下文）。

1. 引物位置的确定
   1. 打开 UCSC 基因组浏览器（http://genome.ucsc.edu/），选择研究的生物体，并使用 3C 方法搜索待评估的基因组区域。
   2. 在下一个窗口中，点击浏览器下方的 Mapping and Sequencing 选项卡中的 Restr Enzymes，以激活酶切位点轨道。
   3. 输入将要使用的 限制性内切酶，并将 显示模式 设置为 pack，然后点击 Submit。
   4. 在 Variation and Repeats 部分，确保 RepeatMasker 设置为 dense。
   5. 以限制性酶切位点为参考，识别位于非屏蔽重复区域（黑色条带以外）的目标位点。通过点击 position（最上方轨道） 并拖动至所需长度（约 600 bp），高亮显示限制性位点上下游各 300 个碱基对（bp）的序列。
   6. 松开鼠标后，将弹出一个对话框。记录基因组位置，点击 Zoom in，使浏览器根据所选区域重新调整视图。
   7. 将鼠标悬停在浏览器顶部工具栏的 View 选项卡上，在下拉菜单中选择 DNA。
   8. 保留默认选项，注意屏蔽序列的标注方式（可选择将其显示为 N's），然后点击 get DNA。
   9. 高亮的序列将在窗口中显示。将该序列复制并粘贴至 Primer3 软件（https://primer3.ut.ee/）。
   10. 使用 Primer3 的默认设置，点击 Pick primers 生成引物。
   11. 在 结果 中，注意限制性内切酶位点的位置，并选择能够扩增出 200–500 bp PCR 产物 且 限制性位点 位于 中间 的引物。
   12. 按照上述步骤，设计距离目标位点 1 千碱基（kb）、2 kb、5 kb、10 kb 和 20 kb 的测试引物。
   13. 为设计输入对照引物，重复上述步骤，选择距离目标位点 1–2 kb 且不含限制性酶切位点（即不会被切割）的区域进行引物设计。
2. 引物功能验证
   1. 为验证引物功能，使用梯度稀释的引物浓度和纯化的基因组 DNA 设置 PCR 反应。通过定量或半定量方法，确定引物是否能够扩增出预期产物。
   2. 对未能通过验证的引物重新设计。

2. 第1天

注意：在染色质交联和细胞核收集步骤之后，可暂停实验流程（于 −20 °C 冷冻保存）。对于本科生而言，这些步骤平均耗时 5–6 小时。

1. 青年期（YA）C. elegans 细胞核收集（改编自 Han 等人²⁹）
   1. 染色质交联
      1. 在 50 mL 锥形管中，用 30 mL M9 培养基收集 5,000 条青年期线虫，在室温（RT）下以 400 × g 离心 2 分钟。
      2. 用 M9 培养基再洗涤线虫沉淀 3 次，以去除细菌。
      3. 弃去上清液，将线虫沉淀重悬于含 2.7 mL 37% 甲醛（终浓度为 2%）的 47.3 mL M9 培养基中，在室温下振荡（摇动或旋转）孵育 30 分钟。
         警告：操作甲醛时需谨慎，应在通风橱内佩戴适当的个人防护装备（PPE，包括实验服、合适的手套和眼部防护）。甲醛是一种刺激物，可影响眼睛、鼻子、喉咙和肺部。
      4. 在室温下以 400 × g 离心线虫 2 分钟。
      5. 弃去上清液，将线虫沉淀重悬于 50 mL 1 M 甘氨酸溶液中，在室温下以 400 × g 离心 2 分钟。
   2. 细胞核收集
      1. 将线虫沉淀重悬于 6 mL 预冷的 NP 缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，40 mM NaCl，90 mM KCl，2 mM EDTA，0.5 mM EGTA，0.1% Tween 20，0.2 mM DTT，0.5 mM 亚精胺，0.25 mM 精胺，1× 完整蛋白酶抑制剂）中。
      2. 将线虫悬液转移至冰上预冷的 7 mL 宽口 Dounce 匀浆器中，匀浆 15 次，冰上静置 5 分钟。
      3. 将线虫悬液转移至冰上预冷的 7 mL 窄口 Dounce 匀浆器中，匀浆 20 次，冰上静置 5 分钟。
      4. 将线虫悬液转移至洁净的 15 mL 锥形管中，并加入 NP 缓冲液至总体积为 10 mL（约添加 4 mL）。
      5. 在高速下涡旋线虫悬液 30 秒，样品在冰上孵育 5 分钟。
      6. 重复上一步操作。
      7. 在 4 °C 下以 100 × g 离心 5 分钟。
      8. 将上清液转移至新的 15 mL 锥形管中。
      9. 检查样品中是否存在线虫碎片。取 10 µL 样品在光学显微镜下观察。若存在线虫碎片，则在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 5 分钟，将沉淀重悬于 10 mL 新鲜 NP 缓冲液中，再以 100 × g 在 4 °C 离心 5 分钟。弃去沉淀，检查上清液中是否仍有线虫碎片，并重复此步骤直至样品中无可见线虫碎片。
         注：也可通过将样品依次经 40 µm 细胞筛过滤 6 次，再经 20 µm 细胞筛过滤 6 次，以去除线虫碎片。
      10. 若样品中无线虫碎片，取 5 µL 样品，加入 5 µL 甲基绿派洛宁染液（细胞核呈蓝色），使用血细胞计数板计数细胞核数量。
      11. 在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 5 分钟。
      12. 弃去上清液，将样品置于冰上并立即进行后续操作；或快速冷冻细胞核，并在 −80 °C 下保存。
2. 染色质消化
   1. 将细胞核重悬于 450 µL 无菌水中，转移至洁净的 1.5 mL 微离心管中。
   2. 向交联样品中加入 60 µL 10× DpnII 限制性内切酶缓冲液，充分混匀。
      ​注：也可使用其他能够切割交联 DNA 的限制性内切酶。
   3. 加入 15 µL 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）以通透细胞核，在 37 °C 下振荡孵育 1 小时。
      ​警告：SDS 具有刺激性，若摄入或经皮肤吸收则有毒。操作时需谨慎，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、合适的手套和眼部防护）。
   4. 加入 75 µL 20% Triton X-100 以淬灭 SDS，并在 37 °C 下振荡孵育 1 小时。
   5. 从样品中取出 10 µL 作为未消化对照，4 °C 保存。
   6. 加入 400 U DpnII 酶，在 37 °C 下振荡过夜孵育。

3. 第2天

注意：本科生平均需要 5 小时完成这些步骤。

1. 染色质消化
   1. 额外加入 200 U 的 DpnII，并在 37 °C 下振荡孵育样品 4 小时，以确保交联样品完全消化。
   2. 从样品中取出 10 µL 作为消化对照。
   3. 通过在 65 °C 下孵育 20 分钟（或根据制造商说明）使限制性内切酶热失活。继续进行步骤 2.1.3。
   4. 如果该酶不能通过加热失活，则加入 80 µL 的 10% SDS，在 65 °C 下孵育 30 分钟。然后加入 375 µL 的 20% Triton X-100，轻轻旋转混匀。在 37 °C 下孵育 1 小时，然后继续进行步骤 2.2。
2. 染色质连接
   1. 将样品转移至一个新的 50 mL 圆底管中，用分子级 H₂O 调整体积至 5.7 mL，并轻轻旋转混匀。
   2. 加入 700 µL 的 10× T4 连接酶缓冲液，并轻轻旋转混匀。
   3. 加入 60 U 的 T4 DNA 连接酶，并轻轻旋转混匀。
   4. 在 16 °C 下过夜孵育。

第3天

注意：本科生平均需要 15-30 分钟完成这些步骤。过夜培养后，样品可进行冷冻保存。

1. 蛋白质消化与逆转交联
   1. 向3C样品中加入30 µL蛋白酶K（10 mg/mL），在65 °C下振荡孵育过夜。向未消化组和消化对照组中各加入5 µL蛋白酶K（10 mg/mL），在65 °C下振荡孵育过夜。

第4天

注意：本科生平均需要 4-5 小时完成这些步骤。

1. 3C 文库的纯化
   1. 向 3C 样品中加入 30 µL 核糖核酸酶 A（RNase A，10 mg/mL），轻轻旋转混匀。在 37 °C 下孵育 45 分钟。
   2. 向样品中加入 7 mL 苯酚-氯仿，振荡混匀。
      警告：苯酚-氯仿对皮肤和眼睛具有刺激性，接触后若未及时处理可导致灼伤。应在通风橱内操作，并佩戴适当的眼部防护装备和手套（腈类手套）。
   3. 在室温下以 3,270 × g 离心 15 分钟。收集水相，转移至一个新的洁净 50 mL 锥形管中。加入等体积的氯仿，振荡混匀。
   4. 在室温下以 3,270 × g 离心 15 分钟。收集水相，转移至一个新的洁净 50 mL 锥形管中。加入 7.5 mL 分子级 H₂O、35 mL 100% 乙醇，以及（可选）7 µL 甘油（glycogen，1 mg/mL）。振荡混匀后，置于 −80 °C 冷冻直至样品完全冻结。
      注意：样品完全冻结可能需要 1 小时或更长时间。此步骤可暂停实验流程。
      1. 在 3C 样品冷冻的同时，纯化对照样品。用分子级水将对照样品体积调整至 500 µL，加入 2 µL 核糖核酸酶 A（RNase A，10 mg/mL），轻弹管壁混匀。
      2. 短暂离心，使液体沉至管底。在 37 °C 下孵育 45 分钟。
      3. 向对照样品中加入 1 mL 苯酚-氯仿，振荡混匀。在室温下以 3,270 × g 离心 15 分钟。收集对照样品的水相，转移至洁净的 1.5 mL 微离心管中。
      4. 加入等体积的氯仿，振荡混匀。在室温下以 3,270 × g 离心 15 分钟。收集对照样品的水相，转移至洁净的 1.5 mL 微离心管中。
      5. 加入 1 mL 100% 乙醇和 2 µL 甘油（glycogen，1 mg/mL）。振荡混匀后，在 −80 °C 下孵育 30 分钟。
      6. 在 4 °C 下以 3,270 × g 离心 15 分钟。弃去上清液，加入 750 µL 预冷的 70% 乙醇。
      7. 在 4 °C 下以 3,270 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将样品在空气中干燥。用 50 µL 分子级 H₂O 重悬沉淀。可选择冷冻保存或继续进行第 6 步。
   5. 在 4 °C 下以 3,270 × g 离心 60 分钟。弃去上清液，加入 10 mL 预冷的 70% 乙醇。通过振荡混匀使 DNA 沉淀破碎并分散。
   6. 在 4 °C 下以 3,270 × g 离心 30 分钟。弃去上清液，将样品在室温下部分风干。用移液器反复吹打，将沉淀重悬于 150 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）中。此即“3C 文库”。
      ​注意：可将样品冷冻保存，或继续进行后续分析。

第5天

注意：本科生平均需要 1-2 小时完成这些步骤。

1. 使用对照引物的标准曲线评估样品质量
   1. 对3C样品及所有对照样品进行DNA浓度定量，并将样品调整至30 µg/µL（若浓度允许）。将各样品连续两倍稀释四次，得到每个样品的五个稀释梯度（1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x）。
      注：若难以准确测定浓度，可按上述指示进行连续稀释，并继续后续操作。
   2. 使用对照引物为每个稀释后的3C样品、基因组对照和酶切对照设置PCR反应体系：1 µL DNA、10 µL 5x反应缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs、1 µL 10 mM对照引物（正向与反向引物混合）、1 µL Taq DNA聚合酶、36 µL水。
   3. 根据PCR仪专用软件的操作说明，设置标准曲线PCR程序，循环条件如下：98 °C预变性30 s；进行30个循环（98 °C变性5 s、60 °C退火5 s、72 °C延伸10 s）；72 °C终延伸1 min；4 °C保存。
   4. 使用软件生成各样品的标准曲线。软件生成曲线后，记录PCR扩增效率和R²值。
2. 确定DNA浓度
   1. 为确定3C样品的DNA浓度，需将其与已知浓度的基因组DNA样品进行比较。将样品稀释至30 ng/µL，并将基因组对照从10 ng/µL开始以两倍梯度逐级稀释至0.01 ng/µL，构建标准曲线。
      注：若难以准确测定浓度，可将样品稀释1:10后继续后续操作。
   2. 使用对照引物为每个稀释后的3C样品、基因组对照和酶切对照设置PCR反应体系：1 µL DNA、10 µL 5x反应缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs、1 µL 10 mM对照引物（正向与反向引物混合）、1 µL Taq DNA聚合酶、36 µL水。
   3. 根据PCR仪专用软件的操作说明，设置标准曲线PCR程序，循环条件如下：98 °C预变性30 s；进行30个循环（98 °C变性5 s、60 °C退火5 s、72 °C延伸10 s）；72 °C终延伸1 min；4 °C保存。
   4. 使用软件生成样品的标准曲线，并将3C样品的扩增曲线绘制在标准曲线上。将3C样品的扩增量与已知浓度基因组DNA反应生成的标准曲线进行比较，并将3C样品调整至30 ng/µL。
3. 确定染色质相互作用的存在与否
   1. 使用30 ng的3C样品、基因组对照样品和酶切对照样品设置qPCR反应体系：1 µL DNA、10 µL 5x反应缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs、1 µL 10 mM引物（正向与反向引物混合）、1 µL Taq DNA聚合酶、36 µL水。
      注：反应中应使用对照引物、针对特定基因组位点的检测引物，以及用于检测染色质相互作用的检测引物组合（位点“a”正向引物与位点“b”反向引物）（图3）。
   2. 根据PCR仪软件的操作说明，设置PCR程序如下：98 °C预变性30 s；进行40个循环（98 °C变性5 s、60 °C退火5 s、72 °C延伸10 s）；72 °C终延伸1 min；4 °C保存。
   3. PCR完成后，检查扩增曲线。确保PCR反应呈现指数扩增，每个循环扩增量翻倍。
      注：未呈现指数扩增的反应无法进行进一步分析。
   4. 根据PCR仪软件的操作说明，设定qPCR实验的阈值。
   5. 导出所有样品的Ct值。
   6. 利用未酶切对照（UC）和酶切对照（DC）样品的检测引物（TP）与对照引物（CP）的Ct值，根据公式（1）计算酶切效率。
      已酶切百分比 = 100 -      (1)
   7. 酶切效率应在80%–90%范围内。记录这些数值（图4A）。
   8. 利用未酶切对照（UC）和3C样品（3C）的检测引物组合（TPC）与对照引物（CP）的Ct值，根据公式（2）计算相对染色质相互作用强度。
      染色质相互作用 = 100 -       (2)
   9. 将每种检测引物组合下各样品的数值绘制成柱状图。
   10. 将3C样品的信号与对照样品进行比较，判断3C样品是否在特定染色质相互作用上表现出富集。相对于对照样品出现富集的3C样品可视为条件阳性，需通过Sanger测序进行验证（图4B）。
       注：在分析图表数据时，需注意除非使用“对照模板”（见讨论部分），否则不同反应之间（即不同引物组合之间）的丰度不可比较。
4. 3C产物的鉴定
   1. 将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离。
   2. 使用紫外灯箱或凝胶成像系统观察PCR产物是否具有预期大小的条带。
      注：构建良好的3C文库通常包含多种不同长度的DNA片段，尽管引物已验证特异性，3C文库的PCR产物仍可能出现多条带（图5A）。这并不影响3C文库的分析。
   3. 切下对应于预期片段大小的条带，并按照商业试剂盒说明或以下自制方案进行凝胶回收。
      警告：紫外线具有致癌性，应尽量减少暴露时间。操作时应佩戴防紫外线护目镜、样品防护罩、手套和实验服。
      1. 制作自制纯化柱：用针头在0.5 mL离心管底部戳一个小孔。
      2. 取少量脱脂棉球中的棉花，填入0.5 mL离心管底部，填充量不超过管体积的一半。
      3. 将0.5 mL离心管放入1.5 mL离心管中，确保小管稳定地置于大管边缘上，而非落入管内。
      4. 小心将凝胶片段切成小块，放入纯化柱的0.5 mL管中。
      5. 将整个装置置于−20 °C冰箱中冷冻5分钟，然后在室温下以13,000 × g离心3分钟。
      6. 保留含有缓冲液中提取DNA的1.5 mL管，丢弃含有琼脂糖残渣的0.5 mL管。
      7. 纯化后的DNA可送测Sanger测序，使用3C片段的正向和反向引物进行测序。
   4. 使用Blat鉴定染色质互作位点
      1. 测序完成后，根据测序报告判断样品是否符合质量控制标准。
      2. 对于通过质控的序列，在测序编辑软件（如Another Plasmid Editor, ApE）中打开.seq和.ab1（迹线）文件，检查.ab1文件中碱基识别峰是否清晰，并对.seq文件中误识别的峰进行手动修正。
      3. 使用编辑后的.seq文件，搜索DpnII酶切位点。根据测序结果，该位点应位于序列中间位置附近。
      4. 为确认序列是否为目标序列，选中DpnII位点及其上游30–50 bp的序列（对应于3C检测中所用基因组位点的正向引物区域），将该序列在目标物种基因组中进行Blat比对。确保比对到的基因组位点与引物设计位点一致。
      5. 对反向引物序列重复上述步骤，确保返回的基因组位点与反向引物设计位点一致。

结果

该实验流程将产生一个实验性3C样本和两个对照样本（未消化和已消化样本）。利用这三个样本进行qPCR检测。根据这些结果，计算（公式1）并记录消化效率（表1）。通过上述计算可知，在检测的七个基因组位点上，3C样本的平均消化效率约为88%（表1的平均值）。

接下来，使用不同基因组位点特异性引物组合（表2）和qPCR检测样品中是否存在长距离染色质相互作用。根据这些结果，计算了相对于对照引物组的产物丰度（公式2），并绘图进行比较（图4）。这些数据表明，在10个反应中有8个为长距离相互作用的条件性阳性结果。

随后将PCR反应产物在琼脂糖凝胶上进行电泳。对八个条件阳性样本和一个阴性反应样本的预期PCR产物进行凝胶纯化，并送交进行Sanger测序。代表性阳性反应（蓝色箭头，蓝色框）和阴性反应（红色箭头，红色框）的结果如图所示（图5）。

图1：细胞核中的染色体结构。 细胞核内假想的染色体组织方式。（A）核膜，黑色线条；（B）核纤层，橙色；（C）异染色质，致密线条；（D）常染色质，松散环状结构。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：3C 实验流程示意图。 线性染色体上的远端区域（蓝色、黄色和粉色）通过调控环在细胞核内被拉近。(A) 环状结构由转录因子（灰色圆圈和黑色星形）介导；这些相互作用通过化学交联得以保留。(B) 通过酶切消化（黑色线条）打断环状结构。(C) 消化产生的黏性末端将远端的染色质片段连接在一起。(D) 从蛋白质中纯化出 DNA。(E) 鉴定片段内的序列并将其比对回基因组。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：3C 引物设计方案。 3C 引物围绕目标基因组位置不同距离的限制性酶切位点进行设计。粉红色箭头表示围绕 DpnII 位点设计的实验引物组。这些实验引物可混合搭配使用，以评估该区域的染色质成环情况。橙色引物代表不含 DpnII 位点的阴性对照。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：3C实验的代表性qPCR数据。 3C测试引物组的相对丰度。(A) 对照图，显示未消化对照（蓝色）、已消化对照（灰色）和3C样品（橙色）中产物的相对丰度。(B) 3C实验；未消化对照（蓝色）、已消化对照（灰色）和3C样品（橙色）中不同测试引物组合所得产物的相对丰度。请点击此处查看此图的放大版本。

图 5：3C qPCR 产物的可视化。 上图显示了qPCR终点产物的凝胶电泳图，样品已标注。下图显示了相应反应的代表性Sanger测序峰图。橙色样品为假阳性示例（参见图 4，r38/34），蓝色样品为真阳性示例，测序峰图上方标注了DpnII酶切位点。请点击此处查看该图的放大版本。

位点	消化率（%）
r8	86.98
r3	88.44
r38	89.64
r34	87.55
r33	87.85
r14	86.97
r47	89.45

表1：计算的消化效率。

名称	序列			基因组位点
r3 FWD	ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC			chrX:11361475
r3 RVS	TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC			chrX:11361561
r38 FWD	TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC			chrX:5859700
r38 RVS	AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG			chrX:5859775
r34 FWD	ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG			chrX:5429702
r34 RVS	AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC			chrX:5429777
r33 FWD	AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC			chrX:6296704
r33 RVS	TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG			chrX:6296807
r14 FWD	AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG			chrX:8036367
r14 RVS	ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC			chrX:8036427
r47 FWD	ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC			chrX:9464939
r47 RVS	AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC			chrX:9465064
r8 FWD	GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG			chrX:11094257
r8 RVS	TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC			chrX:11094362
对照引物 FWD	CAATCGTCTCGCTCACTTGTC			chrX:7608049
对照引物 RVS	GATGTGAGCAACAAGGCACC			chrX:7608166

表2：代表性3C实验所用引物。

讨论

染色质构象捕获技术（3C）是一种建立在基础分子生物学技术之上的强大方法。正是这些基本工具的结合，使得3C技术成为本科生科研中极具吸引力的选择。近年来大量研究从广泛尺度上观察了染色质动态变化，利用这些成果设计针对单个基因或基因组区域的精细实验，有望在本科生科研中产生独特而具有影响力的研究项目。这类实验常被认为对本科生而言过于复杂，但通过周密规划，完全可以实现。需要注意的是，用于检测3C文库所捕获染色质连接的检测方法多种多样，可从半定量终点PCR到全基因组测序不等。事实上，首篇3C研究论文¹⁶中的数据即来源于qPCR。之所以存在如此广泛的检测手段，是因为所有3C技术均产生相同的产物——一个代表细胞核内三维空间连接关系的DNA片段文库。

本文介绍了一种更为灵活且适应性强的实验方案改良版本，更适合本科生研究人员使用。上述列出的暂停步骤通常意味着过夜暂停；然而，这些暂停也可以延长至周末，甚至在细胞和细胞核的情况下可延长至数周。最关键的考虑因素是实验工作的时间安排。通常在实验方案中会存在一些对时间敏感的步骤，这些步骤无法暂停。但除了少数几个时间点（第1天和第2天）外，本方案在多个环节均可暂停并冷冻样品。这一点在指导本科生开展实验时尤为关键，因为本科生的实验安排往往需要具备较高的灵活性。除了在方案中设计了这些可暂停的节点外，还鼓励本科生以两人一组，甚至三至四人小组的形式开展工作。小组合作模式非常适合本实验方案，学生之间可以相互支持，建立互助机制，确保每个人都能安全地进行实验。此外，多人协作也会使实验过程更加有趣。通过小组合作，学生还可以围绕染色质结构这一主题，探索多种不同的科学问题，同时仍采用相同的实验流程。因此，即使学生各自开展独立的研究项目，实验方案仍能将他们的工作联系在一起，从而实现相互支持与协作。

其他改进旨在解决某些专用工具和设备并非所有本科院校都具备的问题。这些设备包括但不限于qPCR扩增仪、凝胶成像系统和微量分光光度计。事实上，这些设备虽然使用方便，但并非必需。本文还介绍了经典3C方法在引物设计部分的应用：即首先确定一个感兴趣的基因组位点，然后基于该位点进一步评估其他较远距离的基因组位点是否存在染色质相互作用。如果使用已发表的数据集（例如Hi-C数据集），该技术同样适用，因为在这些数据集中已知存在阳性（相互连接）和阴性（无连接）的基因组位点。利用这些已发表的数据集设计实验是教学实验室的另一种良好改进方式，因为成功鉴定染色质相互作用的可能性通常更高。此外，相关研究论文可在课堂上进行讨论，并作为参考文献使用。

本方案采用改进的qPCR方法来检测3C产物的形成。对照对于3C技术的成功至关重要。每次实验均需设置样本对照和引物对照，以评估3C实验步骤是否完成。样本对照包括未消化对照（基因组DNA）和消化对照。未消化对照用于确定引物组的基线信号，并与交联后消化对照结合使用，以评估消化效率。对于跨越限制性酶切位点的任何引物，其扩增产物均预期出现下降。将该值与未消化对照进行比较，可反映样本消化的充分程度。

PCR所用的引物包括对照引物和检测引物。对照引物是一组位于待检测基因组区域附近、且不包含限制性酶切位点的引物，用于确定检测引物PCR产物丰度的基线水平。检测引物则是一对分别位于特定基因组位点两侧、跨越一个限制性酶切位点的正向与反向引物（图3）。通过比较使用这些引物组合的反应结果，可评估酶切效率：若限制性位点被成功切割，则PCR产物的丰度应有所下降。在分析染色质空间结构时，将来自一个基因组位点的检测引物与另一个不同基因组位点的检测引物配对使用，以判断这两个位点在三维空间中是否邻近。在此情况下，预期仅以3C样品作为模板时才能扩增出PCR产物。

需要注意的是，即使是经过验证的引物也有可能失败（图4：r14 引物组）。此外，在对照反应以及未预期存在染色质连接的反应中（例如消化对照，因其未进行连接），也常常会检测到 PCR 产物。这些产物经测序后，通常无法通过 Sanger 质控，或测序结果无明确序列（图5）。另外，传统的 3C 实验会生成一种"对照模板"，即未经交联、但经过消化和连接的 DNA 样品，用于代表在给定量的 DNA 中可能生成的所有连接片段。该"对照模板"在比较两个基因组位点之间的 qPCR 信号强度时起着重要作用，可用于判断信号代表的是真实相互作用还是随机关联。然而，构建"对照模板"可能存在困难，因为需要将大量待检测的染色质以人工染色体的形式捕获，并与 3C 样品一同处理。获取此类构建体可能不可行，且其制备可能超出一个学期项目的研究范围。鉴于这些困难，我们建议使用对照引物。该对照引物虽不能完全替代"对照模板"的全部功能，但仍可为数据分析提供依据，用于判断相互作用的"存在"或"不存在"。

进行qPCR时，使用等量的样品非常重要。即使使用NanoDrop等纳米分光光度计，也应通过已知浓度的基因组DNA生成标准曲线，并将3C样品的扩增结果拟合至该曲线上，以确定样品用量。这些用量应被记录下来，并用于后续的PCR反应中。PCR反应的质量同样关键。在qPCR运行过程中，通过荧光信号实时检测产物丰度并进行记录，该记录可在扩增曲线图中查看。程序运行结束后，必须检查扩增曲线图，确保所有反应（除无模板对照外）均呈现三个阶段：基线期、指数扩增期和平台期（饱和期）。尤其在设定阈值时（见下文），必须确认反应存在明显的指数扩增阶段。此外，对于系列稀释的样品，其Ct值应随样品稀释程度呈规律性偏移（浓度最高者Ct值最低，浓度最低者Ct值最高）。若样品在扩增曲线图中未表现出此种规律性变化，则需重新稀释，或提示3C样品制备过程中存在更严重的问题。最后，在生成标准曲线时，PCR软件会自动计算PCR扩增效率和R²值。PCR扩增效率应高于90%，R²值应大于0.99。若任一指标未达标，则可能表明样品或PCR引物存在问题。

qPCR 实验完成后，可通过每个反应的 qPCR Ct 值计算消化百分比以及 3C 相互作用的存在情况。为此，首先必须设定 PCR 反应的阈值，通常使用 qPCR 仪器配套的软件完成。设定阈值后，将确定用于比较各样本 Ct 值的 PCR 产物浓度。阈值应穿过 PCR 反应扩增曲线的指数扩增阶段。只有处于指数扩增阶段的 PCR 反应（在此情况下为对照引物和检测引物反应）才能进行比较，因为只有这样才能确保各反应以相同的速率扩增 DNA，从而实现可靠比较。在分析 3C 图谱时，条件性阳性反应被定义为相对于对照样本、基因组对照以及消化对照产生更多产物的反应（图 4B）。然而，这些样本还需在 PCR 产物经凝胶纯化后，通过 Sanger 测序进一步验证。

Sanger 测序完成后，通过质控的样本可使用 Blat 进行分析。该分析的目的是确定样本是否含有位于限制性酶切位点（本实验方案中为 DpnII）两侧的两个目标基因组位点的序列。如果检测到这两个序列，则可认为 3C 片段已得到验证。如果 Blat 分析结果未返回预期序列，可能表明一个或两个引物并非最优，从而导致 qPCR 出现假阳性结果。假阳性样本的测序迹线文件会出现未定义的碱基峰，且序列报告中将主要包含"n"碱基识别结果。

Sanger 验证至关重要，因为可能产生由人为假象 PCR 产物形成导致的假阳性结果。当测序产物不包含预期的目标序列或缺乏典型的 DpnII 位点（正确 3C 片段的特征）时，即可识别这些假阳性（图 5）。对 PCR 片段进行测序还能为实验提供另一个数据支持点，并使学生深刻理解 3C 技术能够识别在细胞核三维空间中相互靠近的远端基因组位点。

3C 技术为本科生提供了一套丰富且基础的分子生物学实验方法，其操作流程灵活而简便。该 3C 技术也是其他结合了下一代测序（NGS）技术的 3C 衍生技术的起点。此类实验可使本科生接触到生物信息学的重要内容，并建立在本文所述基本原理的基础之上。本科生的实践经验与积极参与对其成长为青年科学家至关重要。通过提供这些机会，本科生能够在加深对基本原理理解的同时，增强自信心，以应对前沿技术与科学问题的挑战。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
37% 甲醛	Millapore-Sigma	F8775
100% 乙醇	Millapore-Sigma	E7023
CaCl2	MP Biomedical	215350280
氯仿	Millapore-Sigma	C0549
cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合液	Millapore-Sigma	COEDTAF-RO	用蒸馏水配制成50倍浓缩液，使用前在蔗糖缓冲液和GB缓冲液中稀释至1倍浓度
二硫苏糖醇（DTT）	Millapore-Sigma	D0632	1 M 储存液使用前在蔗糖缓冲液和GB缓冲液中新鲜稀释至500 µM
DpnII	NEB	R0543M
甘油	Millapore-Sigma	G9012
甘氨酸	Millapore-Sigma	G8898
糖原	Millapore-Sigma	10901393001
HEPES	Millapore-Sigma	H3375
KCl	Millapore-Sigma	P3911
KH2PO4	Millapore-Sigma	P5655
甲基绿派洛宁	Millapore-Sigma	HT70116
MgAc2	Thermoscientific	1222530
Na2HPO4	Millapore-Sigma	S5136
NaCl	Millapore-Sigma	S9888
苯酚-氯仿	Millapore-Sigma	P3803
蛋白酶K	Millapore-Sigma	11459643001
蛋白酶K	IBI Scientific	IB05406
qPCR预混液（Phire Taq等）	Millapore-Sigma	KCQS07
RNase A	Millapore-Sigma	R6148
乙酸钠	Millapore-Sigma	S2889
十二烷基硫酸钠（SDS）	Millapore-Sigma	L3771
蔗糖	Millapore-Sigma	S0389
T4 DNA连接酶	Promega	M1804
Tris-HCl	Millapore-Sigma	108319
吐温X-100	Millapore-Sigma	T9284
胰蛋白酶-EDTA	Millapore-Sigma	T4049