Summary
هنا ، نقدم تكيفا لتقنية التقاط تشكل الكروموسوم (3C) بالتفصيل مع التركيز على المشاركة الجامعية والتعلم.
Abstract
التقاط تشكل الكروموسوم (3C) هو أداة قوية أنتجت عائلة من التقنيات المماثلة (على سبيل المثال ، Hi-C و 4C و 5C ، المشار إليها هنا باسم تقنيات 3C) التي توفر معلومات مفصلة عن التنظيم ثلاثي الأبعاد للكروماتين. تم استخدام تقنيات 3C في مجموعة واسعة من الدراسات ، من مراقبة التغيرات في تنظيم الكروماتين في الخلايا السرطانية إلى تحديد جهات الاتصال المحسنة التي تتم مع محفزات الجينات. في حين أن العديد من الدراسات التي تستخدم هذه التقنيات تطرح أسئلة كبيرة على مستوى الجينوم مع أنواع عينات معقدة (أي تحليل خلية واحدة) ، فإن ما يضيع غالبا هو أن تقنيات 3C ترتكز على طرق البيولوجيا الجزيئية الأساسية التي تنطبق على مجموعة واسعة من الدراسات. من خلال معالجة الأسئلة المركزة بإحكام حول تنظيم الكروماتين ، يمكن استخدام هذه التقنية المتطورة لتعزيز تجربة مختبر البحث والتدريس الجامعية. تقدم هذه الورقة بروتوكول 3C وتوفر تعديلات ونقاط تركيز للتنفيذ في المؤسسات الجامعية في المقام الأول في البحث الجامعي وخبرات التدريس.
Introduction
لا يحتوي جينوم الكائن الحي على جميع الجينات اللازمة للوظيفة فحسب ، بل يحتوي أيضا على جميع التعليمات حول كيفية ووقت استخدامها. هذا يجعل تنظيم الوصول إلى الجينوم أحد أهم وظائف الخلية. هناك العديد من الآليات للتحكم في وظيفة الجينات. ومع ذلك ، في مستواه الأساسي ، يعود تنظيم الجينات إلى قدرة عوامل النسخ التنظيمية (العوامل العابرة) على الارتباط بتسلسلات الحمض النووي المحددة (تسلسلات رابطة الدول المستقلة التنظيمية). هذه ليست قدرة فطرية. بدلا من ذلك ، يحكمها تنظيم / هيكل الجينوم في النواة ، والذي يتحكم في توافر / تعرض التسلسلات التنظيمية لرابطة الدول المستقلة للعواملالعابرة 1،2،3. إذا لم تتمكن العوامل العابرة من العثور على تسلسلاتها التنظيمية لرابطة الدول المستقلة ، فلن تتمكن العوامل العابرة من أداء مهامها التنظيمية. وقد جعل هذا فهم كيفية تنظيم الجينوم في النواة مصدرا مهما للبحث.
من المقبول على نطاق واسع أنه خلال الطور البيني ، تحتل الكروموسومات حقيقية النواة في النواة مجالها الخاص المرتبط بالصفيحة النووية والمصفوفة النووية (الشكل 1) ، مما يجعل الكروموسوم أشبه بشريحة من البيتزا ، بدلا من المعكرونة على طبق من السباغيتي. تتكثف الكروموسومات جزئيا عن طريق تفاعلات البروتين والحمض النووي (الكروماتين) التي تلتف وتدور أجزاء من الكروموسوم. من خلال المجهر الإلكتروني ، ومضان الحمض النووي ثلاثي الأبعاد في التهجين الموضعي (FISH) ، وتقنيات وضع علامات الحمض النووي (أي مثيلة الحمض النووي الفلورية والاصطناعية) ، تم العثور على مجالات غير نشطة من الكروماتين معبأة بإحكام على طول المحيط النووي4،5،6 ، بينما توجد أجزاء من الكروماتين النشط الأقل كثافة في داخل النواة7،8،9 ، 10. توفر هذه التجارب رؤية واسعة الزاوية لديناميكيات الكروموسومات ولكنها لا تفعل الكثير لالتقاط التغييرات التي تحدث محليا حول المحفزات الجينية التي لوحظت في دراسات DNase11,12 و nucleosome13,14,15.
كان المفتاح لفتح ديناميكيات الكروماتين عالية الدقة هو صياغة تقنية رسم خرائط الكروموسوم ثلاثي الأبعاد ، 3C. تتكون تقنية 3C نفسها من أربع خطوات رئيسية: تشابك الكروماتين ، وهضم الكروماتين عن طريق إنزيمات التقييد ، وربط الكروماتين ، وتنقية الحمض النووي (الشكل 2). يمكن بعد ذلك توصيف شظايا الحمض النووي الاصطناعي الجديدة الناتجة عن هذه العملية للكشف عن الارتباط الفيزيائي الوثيق بين القطع البعيدة خطيا من الحمض النووي16. أصبحت تقنية 3C الأساس لإنشاء تقنيات عرضية متعددة تستخدم الخطوات الأولية ل 3C لطرح أسئلة أوسع على مستوى الجينوم (على سبيل المثال ، Hi-C ، 4C ، ChIP-C). حددت هذه العائلة من تقنيات 3C أن الكروموسومات يتم تنظيمها في وحدات منفصلة متعددة تسمى المجالات المرتبطة طوبولوجيا (TADs). يتم ترميز TADs في الجينوم ويتم تعريفها بواسطة حلقات الكروماتين المحاطة بحدود غير حلقية16،17،18،19. يتم الحفاظ على حدود TAD من خلال عاملين محفوظين تطوريا ومنتشرين في كل مكان ، بما في ذلك عامل ربط CCCT (CTCF) والتماسك ، مما يمنع الحلقات داخل TADs المنفصلة من التفاعل16،20. يتم التوسط في الحلقات من خلال تفاعل العوامل العابرة مع تسلسلاتها التنظيمية ، وكذلك CTCF والتماسك21.
على الرغم من أن العديد من الدراسات التي تستخدم تقنيات 3C تطرح أسئلة واسعة على مستوى الجينوم وتستخدم تقنيات معقدة لجمع العينات ، فإن صياغة تقنية 3C تعتمد على تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأساسية. هذا يجعل 3C مثيرة للاهتمام للنشر في كل من مختبرات البحث والتدريس الجامعية. يمكن استخدام تقنية 3C للأسئلة الأصغر تركيزا وهي مرنة بطبيعتها للتوسع أو التقليل (الجينات المفردة22 والكروموسومات16 و / أو الجينوم18) اعتمادا على تركيز واتجاه الأسئلة المطروحة. تم تطبيق هذه التقنية أيضا على مجموعة واسعة من الأنظمة النموذجية7،16،19،23 وقد ثبت أنها متعددة الاستخدامات في استخدامها. هذا يجعل 3C تقنية ممتازة للطلاب الجامعيين حيث يمكن للطلاب اكتساب الخبرة في تقنيات البيولوجيا الجزيئية الشائعة مع اكتساب خبرة قيمة في الإجابة على الأسئلة الموجهة.
يظهر هنا بروتوكول مكيف لإعداد مكتبة 3C بناء على البروتوكولات المنشورة مسبقا24،25،26،27. تم تحسين هذا البروتوكول لحوالي 1 × 107 خلايا ، على الرغم من أنه أنشأ مكتبات 3C مع أقل من 1 × 105 خلايا. أثبت هذا البروتوكول أنه متعدد الاستخدامات وقد تم استخدامه لإنشاء مكتبات 3C من أجنة الزرد وخطوط خلايا الزرد والشباب البالغين (YA) Caenorhabditis elegans (الدودة المستديرة). يجب أن يكون البروتوكول مناسبا أيضا لخطوط خلايا الثدييات ، ومع مزيد من التكيف ، الخميرة.
الهدف من هذه التعديلات هو جعل 3C في متناول الطلاب الجامعيين. تم الحرص على استخدام تقنيات مشابهة لتلك التي يمكن تحقيقها في مختبر التدريس الجامعي. توفر تقنية 3C العديد من فرص التعلم للطلاب الجامعيين لتعلم تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأساسية التي ستفيد تطورهم على مقاعد البدلاء وفي الفصل الدراسي وفي مساعيهم بعد التخرج.
Protocol
1. تصميم التمهيدي
ملاحظة: تتوفر أدوات تصميم البادئات 3C عبر الإنترنت28. بدلا من ذلك ، يمكن تصميم مواد أولية مخصصة من قبل الطلاب (انظر أدناه).
- تحديد مواقع التمهيدي
- افتح متصفح UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/) ، وحدد الكائن الحي للدراسة ، وابحث في منطقة الجينوم المراد تقييمها باستخدام 3C.
- في النافذة التالية ، قم بتنشيط مسار الإنزيم في علامة التبويب رسم الخرائط والتسلسل أسفل المتصفح بالنقر فوق إنزيمات Restr.
- أدخل إنزيم (إنزيمات) التقييد المراد استخدامه ، واضبط وضع العرض على الحزمة. انقر فوق إرسال.
- في التباين، تأكد من ضبط RepeatMasker على كثيف.
- باستخدام مواقع التقييد كأدلة ، حدد المواقع ذات الأهمية التي ليست داخل مناطق التكرار المقنعة (الأشرطة السوداء). قم بتمييز 300 زوج أساسي (bp) تحيط بكل من تسلسل المنبع والمصب المحيط بموقع التقييد من خلال النقر على الموضع (المسار العلوي) والسحب إلى الطول المطلوب (~ 600 نقطة أساس).
- حرر الماوس ، وسيظهر مربع منبثق. قم بتدوين الموقع الجينومي ، وانقر فوق تكبير ، ودع المتصفح يعيد ضبط التحديد.
- مرر مؤشر الماوس فوق علامة التبويب عرض على شريط المستعرض العلوي، وفي القائمة المنسدلة، حدد DNA.
- اترك الخيار الافتراضي ، لاحظ تعيين التسلسلات المقنعة (هناك خيار لجعلها N's). انقر فوق الحصول على الحمض النووي.
- سيتم بعد ذلك عرض التسلسل المميز في النافذة. انسخ هذا التسلسل والصقه في Primer3 (https://primer3.ut.ee/).
- باستخدام الإعدادات الافتراضية Primer3 ، قم بإنشاء مواد أولية بالنقر فوق اختيار البرايمر.
- في النتائج ، لاحظ موقع إنزيم التقييد ، وحدد البادئات التي تنشئ منتج PCR 200-500 bp مع موقع التقييد الموجود في المنتصف.
- باتباع هذه الخطوات ، اختبار التصميم التمهيدي 1 كيلو قاعدة (كيلوبايت) ، 2 كيلو بايت ، 5 كيلو بايت ، 10 كيلو بايت ، و 20 كيلو بايت من الموقع (المواقع) ذات الأهمية.
- لتصميم بادئات التحكم في الإدخال ، كرر هذه الخطوات لموقع 1-2 كيلو بايت من موقع الاهتمام الذي يفتقر إلى موقع تقييد ، مما يعني أنه لا يتم قطعه أبدا.
- التحقق من صحة التمهيدي الوظيفي
- للتحقق من صحة وظيفة التمهيدي ، قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام تركيزات التمهيدي المعاير والحمض النووي الجينومي المنقى. إما من خلال الوسائل الكمية أو شبه الكمية ، حدد ما إذا كانت البادئات تخلق المنتج المتوقع.
- إعادة تصميم البادئات التي تفشل في التحقق من الصحة.
2. اليوم 1
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا (تجميده عند -20 درجة مئوية) بعد ربط الكروماتين وبعد تجميع النوى. تستغرق الخطوات ، في المتوسط ، 5-6 ساعات مع الطلاب الجامعيين.
- مجموعة نوى الشباب (YA) C. elegans (مقتبسة من Han et al.29)
- تشابك الكروماتين
- اجمع 5000 دودة YA في 30 مل من وسط M9 في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، وقم بتدويرها عند 400 × جم لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- اغسل حبيبات الدودة 3 مرات أخرى باستخدام M9 لإزالة البكتيريا.
- قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الدودة في 47.3 مل من M9 تحتوي على 2.7 مل من 37٪ فورمالديهايد (2٪ نهائي) ، واحتضانها مع التقليب (هزاز أو تغذية) لمدة 30 دقيقة في RT.
تنبيه: تعامل مع الفورمالديهايد بعناية ، واعمل تحت غطاء دخان باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف مختبر معدات الوقاية الشخصية ، والقفازات المناسبة ، وحماية العين). الفورمالديهايد هو مهيج يؤثر على العينين والأنف والحلق والرئتين. - تدور الديدان في 400 × غرام لمدة 2 دقيقة في RT.
- قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الدودة في 50 مل من 1 متر جليكاين. تدور الديدان في 400 × غرام لمدة 2 دقيقة في RT.
- جمع النوى
- أعد تعليق حبيبات الدودة في 6 مل من المخزن المؤقت NP المبرد (50 mM HEPES عند درجة الحموضة 7.5 ، 40 mM NaCl ، 90 mM KCl ، 2 mM EDTA ، 0.5mM EGTA ، 0.1٪ Tween 20 ، 0.2 mM DTT ، 0.5 mM spermidine ، 0.25 mM spermine ، 1x مثبط كامل للبروتياز البروتيني).
- انقل تعليق الدودة إلى 7 مل ترتد فضفاضة على الجليد. ارتد العينة 15x ، واستمر على الثلج لمدة 5 دقائق.
- انقل تعليق الدودة إلى 7 مل مرتد ضيق على الجليد. ارتد العينة 20 ضعفا ، واستمر على الثلج لمدة 5 دقائق.
- انقل تعليق الدودة إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 15 مل ، وأضف المخزن المؤقت NP إلى إجمالي 10 مل (حوالي 4 مل).
- دوامة تعليق الدودة على إعداد مرتفع لمدة 30 ثانية. احتضان العينة على الجليد لمدة 5 دقائق.
- كرر الخطوة السابقة.
- أدر معلق الدودة على حرارة 100 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.
- افحص العينة بحثا عن حطام الديدان. تصور 10 ميكرولتر من العينة باستخدام مجهر ضوئي. في حالة وجود حطام دودة ، قم بتدوير العينة عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل جديدة من المخزن المؤقت NP ، وقم بتدوير العينة مرة أخرى عند 100 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من الحبيبات ، وافحص المادة الطافية بحثا عن حطام الديدان ، وكرر ذلك حتى تصبح العينة خالية من حطام الديدان.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن أيضا إزالة حطام الدودة عن طريق إجهاد العينة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر (6x) متبوعة بمصفاة خلية 20 ميكرومتر (6x). - إذا كانت العينة خالية من حطام الدودة ، خذ 5 ميكرولتر من العينة ، وأضف 5 ميكرولتر من ميثيل البيرونين الأخضر (ستكون النوى زرقاء) ، وعد النوى باستخدام مقياس الدم.
- أدر العينة على حرارة 2000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية
- قم بإزالة المادة الطافية ، ضع العينات على الجليد ، وتابع ؛ بدلا من ذلك ، قم بتجميد النوى وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- تشابك الكروماتين
- هضم الكروماتين
- أعد تعليق النوى في 450 ميكرولتر من الماء النظيف. انقل النوى إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 1.5 مل.
- إلى العينة المتشابكة ، أضف 60 ميكرولتر من محلول إنزيم تقييد 10x DpnII ، واخلطه جيدا.
ملاحظة: يمكن استخدام إنزيمات التقييد الأخرى التي لا تزال تقطع الحمض النووي المتشابك. - أضف 15 ميكرولتر من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) لتخلل النوى ، واحتضانها مع التقليب (هزاز أو تغذية) عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
تنبيه: SDS مهيج وسام إذا تم تناوله أو امتصاصه من خلال الجلد. تعامل بحذر ، واستخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معطف المختبر ، والقفازات المناسبة ، وحماية العين). - إخماد SDS بإضافة 75 ميكرولتر من 20٪ Triton X-100 والحضانة مع التحريك عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- خذ 10 ميكرولتر من العينة كعنصر تحكم غير مهضوم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
- أضف 400 U من DpnII ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع التقليب.
3. اليوم 2
ملاحظة: في المتوسط ، يستغرق الطلاب الجامعيون 5 ساعات لإكمال هذه الخطوات.
- هضم الكروماتين
- أضف 200 وحدة إضافية من DpnII ، واحتضن العينات لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية مع التقليب لضمان الهضم الكامل للعينة المتشابكة.
- خذ حصة 10 ميكرولتر من العينات كعنصر تحكم في الهضم.
- قم بتعطيل إنزيم التقييد بالحرارة عن طريق احتضان العينة لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية (أو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة). تابع إلى الخطوة 2.1.3.
- إذا تعذر تعطيل الإنزيم بالحرارة ، أضف 80 ميكرولتر من 10٪ SDS ، واحتضن العينة لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية. ثم أضف 375 ميكرولتر من 20٪ Triton X-100 ، واخلطها بالدوامة. احتضن العينة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، واستمر في الخطوة 2.2.
- ربط الكروماتين
- انقل العينة إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل ، واضبط حجم العينة إلى 5.7 مل باستخدام H2O من الدرجة الجزيئية ، واخلطها عن طريق الدوامة.
- أضف 700 ميكرولتر من 10x T4 Ligase buffer ، واخلطها عن طريق الدوامة.
- أضف 60 U من T4 DNA Ligase ، واخلطها عن طريق الدوامة.
- احتضان بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
4. اليوم 3
ملاحظة: في المتوسط ، يستغرق الطلاب الجامعيين 15-30 دقيقة لإكمال هذه الخطوات. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، يمكن تجميد العينات.
- هضم البروتين والربط العكسي
- أضف 30 ميكرولتر من بروتيناز K (10 مجم / مل) إلى عينة 3C ، واحتضانها عند 65 درجة مئوية طوال الليل مع التقليب. أضف 5 ميكرولتر من بروتيناز K (10 مجم / مل) إلى التحكم غير المهضوم والهضم ، واحتضانه عند 65 درجة مئوية طوال الليل مع التقليب.
5. اليوم 4
ملاحظة: في المتوسط ، يستغرق الطلاب الجامعيون 4-5 ساعات لإكمال هذه الخطوات.
- تنقية مكتبة 3C
- أضف 30 ميكرولتر من RNase A (10 مجم / مل) إلى عينة 3C ، وقم بالدوران للخلط. احتضان العينة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- أضف 7 مل من الفينول كلوروفورم إلى العينة ، واخلطها عن طريق الرج.
تنبيه: الفينول كلوروفورم مهيج للجلد والعين ويمكن أن يسبب حروقا إذا لم يتم علاج الاتصال. يجب استخدام الفينول كلوروفورم في غطاء الدخان مع حماية مناسبة للعين والقفازات (النتريل). - أجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة عند 3270 × جم في RT. اجمع المرحلة المائية وانقلها إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل. أضف كميات متساوية من الكلوروفورم ، واخلط العينة عن طريق الهز.
- أجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة عند 3270 × جم في RT. اجمع المرحلة المائية وانقلها إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل. أضف 7.5 مل من الدرجة الجزيئية H2O ، و 35 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ ، و (اختياري) 7 ميكرولتر من الجليكوجين (1 مجم / مل). تخلط عن طريق الرج ، وتحتضن في -80 درجة مئوية حتى يتم تجميد العينة.
ملاحظة: قد يستغرق تجميد العينة 1 ساعة أو أكثر. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.- أثناء تجميد عينة 3C ، قم بتنقية عينات التحكم. إلى عينات التحكم ، اضبط مستوى الصوت على 500 ميكرولتر باستخدام الماء الجزيئي ، وأضف 2 ميكرولتر من مزيج RNase A (10 مجم / مل) عن طريق تحريك الأنبوب.
- قم بالدوران لفترة وجيزة لجمع العينة في قاع الأنبوب. احتضان العينات لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إلى عينات التحكم ، أضف 1 مل من الفينول كلوروفورم ، واخلطها عن طريق هز الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة عند 3270 × جم في RT. اجمع المرحلة المائية من أدوات التحكم ، وضعها في أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 1.5 مل.
- أضف كميات متساوية من الكلوروفورم ، واخلط العينة عن طريق الهز. جهاز طرد مركزي العينة لمدة 15 دقيقة عند 3270 × جم في RT. اجمع المرحلة المائية من أدوات التحكم ، وضعها في أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 1.5 مل.
- أضف 1 مل من الإيثانول 100٪ و 2 ميكرولتر من الجليكوجين (1 مجم / مل). تخلط عن طريق الرج وتحتضن على حرارة -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة عند 3270 × جم عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 750 ميكرولتر من الإيثانول المبرد بنسبة 70٪.
- أجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقائق عند 3270 × جم عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وجفف العينات بالهواء. أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من الدرجة الجزيئية H2O. تجميد ، أو تابع إلى الخطوة 6.
- أجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 60 دقيقة عند 3270 × جم عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 10 مل من الإيثانول المبرد بنسبة 70٪. قم بتعطيل وتفتيت حبيبات الحمض النووي عن طريق هز العينة لخلطها.
- الطرد المركزي العينة لمدة 30 دقيقة عند 3270 × جم عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، واترك العينة تجف جزئيا في الهواء عند RT. أعد تعليق الحبيبات في 150 ميكرولتر من 10 مللي متر Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. هذه هي "مكتبة 3C".
ملاحظة: قم بتجميد العينة، أو تابع التحليل.
6. اليوم 5
ملاحظة: في المتوسط ، يستغرق الطلاب الجامعيين 1-2 ساعة لإكمال هذه الخطوات.
- تحديد جودة العينة باستخدام المنحنى القياسي لبرايمر التحكم
- حدد تركيز الحمض النووي لعينة 3C بالإضافة إلى جميع عناصر التحكم ، واضبط العينات على 30 ميكروغرام / ميكرولتر (إذا سمحت التركيزات بذلك). تسلسليا العينات المخففة مرتين أربع مرات ، مما أدى إلى خمسة تخفيفات لكل عينة (1x ، 0.5x ، 0.25x ، 0.125x ، 0.0625x).
ملاحظة: إذا تعذر إجراء القياس الكمي بسهولة ، فقم بتخفيف العينات بشكل متسلسل كما هو موضح أعلاه ، ثم تابع. - قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ل 3C ، والتحكم الجينومي ، والتحكم المهضوم لكل عينة مخففة باستخدام بادئات التحكم: 1 ميكرولتر من الحمض النووي ، و 10 ميكرولتر من مخزن التفاعل 5x ، و 1 ميكرولتر من 10 mM dNTPs ، و 1 ميكرولتر من 10 mM التمهيدي للتحكم (مختلط أمامي وخلفي) ، و 1 ميكرولتر من Taq polymerase ، و 36 ميكرولتر من الماء.
- باتباع التعليمات الخاصة بالبرنامج الخاص بجهاز PCR ، قم بإعداد برنامج PCR المنحنى القياسي باستخدام ظروف ركوب الدراجات على النحو التالي: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ؛ 30 دورة من 5 ثوان عند 98 درجة مئوية ، و 5 ثوان عند 60 درجة مئوية ، و 10 ثوان عند 72 درجة مئوية ؛ 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية ؛ عقد 4 درجة مئوية.
- باستخدام البرنامج ، قم بإنشاء المنحنيات القياسية للعينات. بعد أن يولد البرنامج المنحنى ، لاحظ كفاءة PCR وقيمة R2 .
- حدد تركيز الحمض النووي لعينة 3C بالإضافة إلى جميع عناصر التحكم ، واضبط العينات على 30 ميكروغرام / ميكرولتر (إذا سمحت التركيزات بذلك). تسلسليا العينات المخففة مرتين أربع مرات ، مما أدى إلى خمسة تخفيفات لكل عينة (1x ، 0.5x ، 0.25x ، 0.125x ، 0.0625x).
- تحديد تركيز الحمض النووي
- لتحديد تركيز الحمض النووي لعينات 3C ، قارن العينات بعينة الحمض النووي الجينومي ذات التركيز المعروف. قم بتخفيف العينات إلى 30 نانوغرام / ميكرولتر ، وقم بتخفيف التحكم الجينومي بشكل متسلسل من 10 نانوغرام / ميكرولتر إلى 0.01 نانوغرام / ميكرولتر في خطوات ذات شقين لإنشاء منحنى قياسي.
ملاحظة: إذا تعذر إجراء القياس الكمي بسهولة ، فقم بتخفيف العينة 1:10 ، وتابع. - قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ل 3C ، والتحكم الجيني ، والتحكم المهضوم لكل عينة مخففة باستخدام بادئات التحكم: 1 ميكرولتر من الحمض النووي ، 10 ميكرولتر من مخزن التفاعل 5x ، 1 ميكرولتر من 10 mM dNTPs ، 1 ميكرولتر من 10 mM التمهيدي للتحكم (مختلط أمامي وخلفي) ، 1 ميكرولتر من Taq polymerase ، و 36 ميكرولتر من الماء.
- باتباع التعليمات الخاصة بالبرنامج الخاص بجهاز PCR ، قم بإعداد برنامج PCR المنحنى القياسي باستخدام ظروف ركوب الدراجات على النحو التالي: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ؛ 30 دورة من 5 ثوان عند 98 درجة مئوية ، و 5 ثوان عند 60 درجة مئوية ، و 10 ثوان عند 72 درجة مئوية ؛ 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية ؛ عقد 4 درجة مئوية.
- باستخدام البرنامج ، قم بإنشاء المنحنيات القياسية للعينات ، ورسم عينات 3C على المنحنى. قارن موضع وفرة عينة 3C بالمنحنى القياسي الناتج عن تفاعلات الحمض النووي الجينومي للتركيز المعروف ، واضبط عينات 3C على 30 نانوغرام / ميكرولتر.
- لتحديد تركيز الحمض النووي لعينات 3C ، قارن العينات بعينة الحمض النووي الجينومي ذات التركيز المعروف. قم بتخفيف العينات إلى 30 نانوغرام / ميكرولتر ، وقم بتخفيف التحكم الجينومي بشكل متسلسل من 10 نانوغرام / ميكرولتر إلى 0.01 نانوغرام / ميكرولتر في خطوات ذات شقين لإنشاء منحنى قياسي.
- تحديد وجود أو عدم وجود تفاعل الكروماتين
- قم بإعداد تفاعلات qPCR مع 30 نانوغرام من عينة 3C ، وعينة التحكم الجينومي ، وعينة التحكم المهضومة: 1 ميكرولتر من الحمض النووي ، و 10 ميكرولتر من مخزن التفاعل 5x ، و 1 ميكرولتر من 10 mM dNTPs ، و 1 ميكرولتر من 10 mM التمهيدي (مختلط أمامي وعكسي) ، و 1 ميكرولتر من Taq polymerase ، و 36 ميكرولتر من الماء.
ملاحظة: يجب إعداد التفاعلات باستخدام برايمر التحكم ، وبادئات الاختبار لمواقع الجينوم الفردية ، والتوليفات المرغوبة من بادئات الاختبار (الموقع "أ" للأمام والموقع "ب" للخلف) المستخدمة لتحديد تفاعل الكروماتين (الشكل 3). - باتباع التعليمات الخاصة ببرنامج جهاز PCR ، قم بإعداد برنامج PCR على النحو التالي: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ؛ 40 دورة من 5 ثوان عند 98 درجة مئوية ، و 5 ثوان عند 60 درجة مئوية ، و 10 ثوان عند 72 درجة مئوية ؛ 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية ؛ عقد 4 درجة مئوية.
- بعد تشغيل PCR ، افحص مخطط التضخيم. تأكد من أن تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل تعرض تضخيما أسيا ، يتضاعف كل دورة.
ملاحظة: لا يمكن تحليل التفاعلات التي لا تعرض التضخيم الأسي بشكل أكبر. - باتباع التعليمات الخاصة ببرنامج جهاز PCR ، حدد عتبة تجربة qPCR.
- تصدير قيم Ct لجميع العينات.
- تحديد كفاءة الهضم باستخدام قيم اختبار التمهيدي (TP) والتحكم التمهيدي (CP) Ct من عينات التحكم غير المهضومة (UC) والسيطرة المهضومة (DC) باستخدام المعادلة (1).
النسبة المئوية للهضم = 100 -
(1) - يجب أن تكون هذه القيم في حدود 80٪ -90٪ هضم. سجل هذه القيم (الشكل 4 أ).
- حدد تفاعل الكروماتين النسبي باستخدام تركيبة اختبار التمهيدي (TPC) وقيم التحكم التمهيدي (CP) Ct من عينات التحكم غير المهضومة (UC) و 3C (3C) باستخدام المعادلة (2).
تفاعل الكروماتين = 100 -
(2) - ارسم قيم كل عينة على رسم بياني شريطي لكل مجموعة اختبار تمهيدي.
- قارن إشارة عينات 3C بعينات التحكم لتحديد ما إذا كانت عينة 3C تحتوي على إثراء لتفاعل كروماتين معين على عينات التحكم. يمكن اعتبار عينات 3C التي تظهر التخصيب على التحكم إيجابية مشروطة وتتطلب التحقق من الصحة باستخدام تسلسل سانجر (الشكل 4 ب).
ملاحظة: عند تحليل بيانات الرسم البياني ، من المهم أن تتذكر أنه ما لم يتم استخدام "قالب تحكم" (انظر المناقشة) ، لا يمكن مقارنة الوفرة بين التفاعلات (أي من مجموعة من البادئات إلى المجموعة التالية).
- قم بإعداد تفاعلات qPCR مع 30 نانوغرام من عينة 3C ، وعينة التحكم الجينومي ، وعينة التحكم المهضومة: 1 ميكرولتر من الحمض النووي ، و 10 ميكرولتر من مخزن التفاعل 5x ، و 1 ميكرولتر من 10 mM dNTPs ، و 1 ميكرولتر من 10 mM التمهيدي (مختلط أمامي وعكسي) ، و 1 ميكرولتر من Taq polymerase ، و 36 ميكرولتر من الماء.
- تحديد منتجات 3C
- قم بتشغيل منتجات PCR على جل أغاروز 1.5٪.
- تصور الجل للحجم الصحيح لمنتجات PCR باستخدام صندوق ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو نظام توثيق الهلام.
ملاحظة: ستحتوي مكتبات 3C جيدة البناء على مجموعة متنوعة من شظايا الحمض النووي ، وعلى الرغم من التحقق السابق من البادئات للتأكد من خصوصيتها ، فإن تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل من مكتبات 3C لديها القدرة على احتواء العديد من النطاقات (الشكل 5A). هذا لا يمنع تحليل مكتبات 3C. - قم باستئصال نطاقات المنتج المقابلة لحجم الجزء المتوقع ، وقم بإجراء استخراج هلام لمنتجات PCR باتباع تعليمات مجموعة تجارية أو البروتوكول محلي الصنع الموضح أدناه.
تنبيه: ضوء الأشعة فوق البنفسجية مادة مسرطنة معروفة ، ويجب توخي الحذر الشديد للحد من الوقت الذي يتعرض فيه للأشعة فوق البنفسجية. يجب ارتداء حماية العين المقاومة للأشعة فوق البنفسجية ، ودرع العينة ، والقفازات ، ومعطف المختبر.- لإنشاء خرطوشة تنقية محلية الصنع ، قم بعمل ثقب في قاع أنبوب سعة 0.5 مل بإبرة.
- قم بتعبئة كمية صغيرة من القطن من كرة قطنية في قاع الأنبوب سعة 0.5 مل ، مع ملء ما لا يزيد عن نصف الأنبوب.
- ضع أنبوب 0.5 مل في أنبوب 1.5 مل ؛ تأكد من أن الأنبوب الأصغر يقع على شفة الأنبوب الأكبر ، وليس في الأنبوب.
- قطع بعناية جزء هلام إلى قطع أصغر ، ووضعها في أنبوب 0.5 مل من الخرطوشة.
- ضع المجموعة في فريزر -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أدر التجميع لمدة 3 دقائق عند 13000 × جم في RT.
- احتفظ بالأنبوب سعة 1.5 مل مع الحمض النووي المستخرج في المخزن المؤقت ، وتخلص من الأنبوب سعة 0.5 مل الذي يحتوي على حطام الأغاروز.
- يمكن إرسال الحمض النووي المنقى لتسلسل سانجر باستخدام الاشعال الأمامية والخلفية لجزء 3C.
- تحديد جهات اتصال الكروماتين باستخدام Blat
- عند الانتهاء من التسلسل ، حدد ما إذا كانت العينات تفي بمعايير مراقبة الجودة كما هو موضح في تقرير التسلسل.
- بالنسبة للتسلسلات التي تجتاز مراقبة الجودة ، افتح ملفات .seq و .ab1 (تتبع) في برنامج تحرير تسلسل مثل محرر بلازميد آخر (ApE) ، وافحص ملف .ab1 بحثا عن قمم استدعاء أساسية واضحة ، وقم بتحرير القمم التي تم استدعاؤها بشكل خاطئ في ملف .seq.
- باستخدام ملف .seq الذي تم تحريره ، ابحث عن موقع DpnII. اعتمادا على نتيجة التسلسل ، يجب أن يكون هذا في منتصف الطريق إلى التسلسل المبلغ عنه.
- لتحديد ما إذا كان التسلسل هو التسلسل المستهدف المتوقع ، قم بتمييز موقع DpnII و 30-50 نقطة أساس إضافية من تسلسل المنبع المقابل للتمهيد الأمامي للمواقع الجينومية التي تم اختبارها ل 3C. قم بإجراء بحث Blat لهذا التسلسل مقابل الأنواع المستهدفة. تأكد من تطابق المواضع الجينومية مع تلك الموجودة في التمهيدي.
- كرر الخطوة أعلاه لتسلسل التمهيدي العكسي ، مع التأكد من أن الموضع الجينومي الذي تم إرجاعه يطابق موضع التمهيدي العكسي.
(1)
(2)Representative Results
سينتج هذا الإجراء عينة تجريبية واحدة من 3C وعينتين ضابطتين (غير مهضومة ومهضومة). باستخدام هذه العينات الثلاث ، تم إجراء qPCR. من هذه النتائج ، تم حساب كفاءة الهضم (المعادلة 1) وتسجيلها (الجدول 1). من هذه الحسابات ، تم تحديد أن عينة 3C لديها كفاءة هضم تقارب 88٪ (متوسط الجدول 1) عبر المواقع الجينومية السبعة التي تم اختبارها.
بعد ذلك ، تم اختبار العينات لوجود اتصالات كروماتين طويلة المدى بين المواقع الجينومية المختلفة باستخدام مجموعات من البادئات الخاصة بالمواقع (الجدول 2) و qPCR. باستخدام هذه النتائج ، تم حساب وفرة المنتج بالنسبة لمجموعة التمهيدي للتحكم (المعادلة 2) ورسمها بيانيا للمقارنة (الشكل 4). أشارت هذه البيانات إلى أن 8 من 10 تفاعلات كانت إيجابية مشروطة للتفاعلات بعيدة المدى.
ثم تم تشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الأغاروز. تم تنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوقع للإيجابيات الشرطية الثمانية وتفاعل سلبي واحد بالهلام وإرساله لتسلسل سانجر. تظهر نتائج ردود الفعل التمثيلية الإيجابية (السهم الأزرق ، المربع الأزرق) والسالبة (السهم الأحمر ، المربع الأحمر) (الشكل 5).
الشكل 1: تركيب الكروموسوم في النواة. تنظيم كروموسوم افتراضي داخل النواة. (أ) غلاف نووي، خطوط سوداء؛ (ب) الصفيحة النووية، البرتقالية؛ (ج) خطوط متغاير اللون مضغوطة؛ د: إيوكروماتين، حلقات فضفاضة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي لبروتوكول 3C. يتم تقريب الأجزاء البعيدة من الكروموسومات الخطية (الأزرق والأصفر والوردي) من بعضها البعض داخل النواة من خلال الحلقات التنظيمية. (أ) تتوسط هياكل الحلقة بعوامل النسخ (الدائرة الرمادية والنجمة السوداء)؛ يتم الحفاظ على هذه التفاعلات من خلال التشابك الكيميائي. (ب) تتكسر الحلقات من خلال الهضم الأنزيمي (الخطوط السوداء). (ج) ترتبط قطع الكروماتين البعيدة معا من خلال الأطراف الشائكة الناتجة عن عملية الهضم. د: ينقى الحمض النووي (DNA) من البروتين. ه: يحدد التتابع داخل الأجزاء ويعود إلى الجينوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مخطط التمهيدي 3C. تم تصميم البادئات 3C حول مواقع التقييد على مسافات متفاوتة من الموقع الجينومي محل الاهتمام. تمثل الأسهم الوردية مجموعات التمهيدي التجريبية المحيطة بموقع DpnII. يمكن خلط البادئات التجريبية ومطابقتها لتقييم حلقات الكروماتين في المنطقة. تمثل البادئات البرتقالية تحكما سلبيا بدون موقع DpnII. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: بيانات qPCR التمثيلية لتجربة 3C. وفرة نسبية لمجموعات اختبار التمهيدي 3C. (أ) رسم بياني للتحكم يوضح الوفرة النسبية للمنتج في عنصر التحكم غير المهضوم (أزرق) ، وعنصر تحكم مهضوم (رمادي) ، وعينة 3C (برتقالي). (ب) تجربة 3C؛ الوفرة النسبية للمنتج من مجموعات من بادئات الاختبار في عنصر التحكم غير المهضوم (الأزرق) ، والتحكم المهضوم (الرمادي) ، وعينة 3C (برتقالي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصور منتجات 3C qPCR. أعلى ، هلام مع منتجات نقطة نهاية qPCR مع العينات المشار إليها. في القاع ، ملفات تتبع تسلسل سانجر التمثيلية لردود الفعل المشار إليها. العينة البرتقالية هي مثال على نتيجة إيجابية خاطئة (انظر الشكل 4 ، r38 / 34) ، والعينة الزرقاء هي مثال على إيجابية حقيقية مع موقع DpnII المشار إليه أعلاه التتبع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| موقع | ٪ الهضم |
| آر 8 | 86.98 |
| ر3 | 88.44 |
| آر 38 | 89.64 |
| آر 34 | 87.55 |
| آر 33 | 87.85 |
| آر 14 | 86.97 |
| آر 47 | 89.45 |
الجدول 1: كفاءة الهضم المحسوبة.
| اسم | تسلسل | المواقع الجينومية | ||
| r3 دفع أمامي | ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC | chrX:11361475 | ||
| r3 RVS | TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC | chrX:11361561 | ||
| r38 دفع أمامي | TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC | chrX: 5859700 | ||
| r38 RVS | AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG | chrX:5859775 | ||
| r34 دفع أمامي | ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG | chrX:5429702 | ||
| r34 RVS | AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC | chrX:5429777 | ||
| r33 دفع أمامي | AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC | chrX:6296704 | ||
| r33 RVS | TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG | chrX:6296807 | ||
| r14 دفع أمامي | AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG | chrX:8036367 | ||
| r14 RVS | ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCTCTC | chrX:8036427 | ||
| r47 دفع أمامي | ATCTAGACTTGATAATTTGTGTGTCCTC | chrX:9464939 | ||
| r47 RVS | AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC | chrX:9465064 | ||
| r8 دفع أمامي | GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG | chrX:11094257 | ||
| r8 RVS | TTACGAAATTTGGTAGTTGGACC | chrX:11094362 | ||
| برايمر التحكم FWD | CAATCGTCTCGCTCACTTGTC | chrX:7608049 | ||
| التحكم التمهيدي RVS | غاتغتغاكاك | chrX:7608166 | ||
الجدول 2: الاشعال لتجربة 3C التمثيلية.
Discussion
3C هي تقنية قوية متجذرة في التقنيات الجزيئية الأساسية. هذا هو أساس الأدوات الأساسية التي تجعل 3C تقنية مثيرة للاهتمام لاستخدامها مع الطلاب الجامعيين. مع وجود العديد من الدراسات الحديثة التي تراقب ديناميكيات الكروماتين على هذا النطاق الواسع ، فإن استخدام هذه النتائج لابتكار تجربة ضيقة التركيز على جين واحد أو منطقة جينومية واحدة لديه القدرة على إنشاء تجربة فريدة ومؤثرة في الأبحاث الجامعية. في كثير من الأحيان ، تعتبر مثل هذه التجارب متقدمة جدا بالنسبة للطلاب الجامعيين ، ولكن مع التخطيط الدقيق ، يمكن تحقيقها بسهولة. من المهم ملاحظة أن المقايسات المصممة لفحص اتصالات الكروماتين التي تم التقاطها بواسطة مكتبة 3C يمكن أن تختلف من تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي لنقطة النهاية إلى تسلسل الجينوم الكامل. في الواقع ، تم إنشاء بيانات من أول ورقة 3C16 من qPCR. يمكن استخدام هذه المجموعة الواسعة من المقايسات لأن جميع تقنيات 3C تنتج نفس المنتج - مكتبة من شظايا الحمض النووي التي تمثل اتصالات ثلاثية الأبعاد في النواة.
يظهر هنا تكييف لبروتوكول أكثر مرونة واستيعابا يناسب الباحثين الجامعيين بشكل أفضل. فترات التوقف المذكورة أعلاه تعني تأخيرات بين عشية وضحاها. ومع ذلك ، يمكن أن تمتد هذه التوقفات خلال عطلات نهاية الأسبوع ، وفي حالة الخلايا والنوى ، لأسابيع. الاعتبار الأكثر أهمية هو متى سيتم إنجاز العمل. في كثير من الأحيان في البروتوكولات ، هناك خطوات حساسة للوقت عندما لا يكون الإيقاف المؤقت خيارا. خارج بضع نقاط (اليوم 1 واليوم 2) ، هناك العديد من الأماكن لإيقاف العينة وتجميدها. هذه أمر بالغ الأهمية عند العمل مع الطلاب الجامعيين حيث يجب أن تكون جداول وتوقيت العمل المخبري مرنة. بالإضافة إلى هندسة هذه التوقفات في البروتوكول ، يتم تشجيع الطلاب الجامعيين على العمل في أزواج أو حتى مجموعات صغيرة من ثلاثة أو أربعة. تعمل المجموعات بشكل جيد لهذا البروتوكول ، حيث يمكن للطلاب دعم بعضهم البعض وإنشاء نظام أصدقاء حتى يعمل الجميع بأمان. العمل في المختبر هو أيضا أكثر متعة مع الآخرين المعنيين. مع المجموعات ، يمكن للطلاب أيضا العمل على مجموعة متنوعة من الأسئلة التي تركز على تنظيم الكروماتين مع الاستمرار في تنفيذ نفس البروتوكول. وبالتالي ، حتى أثناء عمل الطلاب في مشاريع منفصلة ، يربط البروتوكول جهودهم ، ولهذا السبب ، يمكنهم دعم بعضهم البعض.
تهدف التعديلات الأخرى إلى التغلب على حقيقة أن بعض الأدوات والمعدات المتخصصة لا توجد بالضرورة في جميع المؤسسات الجامعية. تشمل هذه القطع من المعدات على سبيل المثال لا الحصر أجهزة التدوير الحراري qPCR وأنظمة توثيق الهلام ومطياف حجم النانو. في الواقع ، هذه القطع من المعدات مريحة ولكنها ليست شرطا. هنا ، يتم وصف الطريقة الكلاسيكية ل 3C أيضا في جزء التصميم التمهيدي ؛ يتضمن ذلك تحديد موضع الاهتمام الجينومي ، ومن ثم تقييم المواقع الجينومية الأخرى لنقاط اتصال الكروماتين البعيدة. تعمل هذه التقنية أيضا بشكل جيد إذا تم استخدام مجموعة بيانات منشورة ، مثل مجموعة بيانات تستخدم Hi-C ، حيث يتم تحديد المواقع الإيجابية (المتصلة) والسالبة (غير المتصلة) المعروفة. يعد تصميم التجارب باستخدام مجموعات البيانات المنشورة هذه تكيفا رائعا آخر لمختبرات التدريس ، حيث أن فرصة التعرف الناجح على اتصالات الكروماتين عادة ما تكون أكبر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن مناقشة المقالة البحثية في الفصل واستخدامها كمرجع.
يستخدم هذا البروتوكول نهج qPCR المعدل لتصور تكوين منتج 3C. الضوابط ضرورية لنجاح تقنية 3C. تستخدم كل تجربة كلا من عناصر التحكم في العينة وعناصر التحكم التمهيدية لتحديد اكتمال إجراء 3C. تتضمن عناصر التحكم في العينة عنصر تحكم غير مهضوم (الحمض النووي الجينومي) والتحكم المهضوم. يحدد التحكم غير المهضوم إشارة خط الأساس لمجموعات التمهيدي ويستخدم مع التحكم في الهضم المتقاطع لتحديد كفاءة الهضم من المتوقع أن يكون هناك انخفاض في المنتج لأي بادئات موجهة عبر موقع التقييد. توفر مقارنة هذه القيمة بعنصر التحكم غير المهضوم مؤشرا على مدى جودة هضم العينة.
تشتمل البادئات الخاصة ب PCR على برايمر تحكم وبرايمر اختبار. التمهيدي للتحكم عبارة عن مجموعة أولية تقع بالقرب من المنطقة الجينومية التي يتم فحصها ولا تحتوي على موقع تقييد. يوفر هذا خط الأساس لتحديد وفرة منتجات اختبار PCR التمهيدي. بادئات الاختبار عبارة عن بادئات أمامية وخلفية تحيط بموقع تقييد لموضع اهتمام جينومي معين (الشكل 3). تتم مقارنة التفاعلات باستخدام مجموعات التمهيدي هذه لتحديد كفاءة الهضم ، حيث يجب أن تنخفض وفرة المنتج إذا تم قطع موقع التقييد. عند تحديد تنظيم الكروماتين ، يتم إقران اختبار تمهيدي واحد من موضع واحد مع اختبار تمهيدي آخر من موضع جينومي مختلف لتحديد ما إذا كان هذان الموقعان قريبان من بعضهما البعض في مساحة 3D. في هذه الحالة ، من المتوقع أن يتم العثور على منتج PCR فقط باستخدام عينة 3C كنموذج.
من المهم ملاحظة أنه حتى البادئات التي تم التحقق من صحتها تميل إلى الفشل (الشكل 4: مجموعة التمهيدي r14). بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحديد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل متكرر في تفاعلات التحكم وفي التفاعلات التي لا يتم فيها التنبؤ باتصال الكروماتين (مثل التحكم المهضوم ، لأنه غير مرتبط). يتم تسلسل هذه الحالات وإما تفشل Sanger QC أو تعود بدون تسلسل محدد (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك ، تولد تجارب 3C التقليدية "قالب تحكم" ، وهو عينة من الحمض النووي غير مترابطة ومهضومة ومربوطة ، والتي تمثل جميع الأجزاء المربوطة المحتملة التي يمكن إنتاجها بكمية معينة من الحمض النووي. يلعب "قالب التحكم" دورا مهما في مقارنة شدة إشارات qPCR بين موقعين جينوميين لتحديد ما إذا كانت الإشارة تمثل تفاعلا حقيقيا أم مجرد ارتباط عشوائي. قد يكون إنشاء "قالب تحكم" مشكلة ، حيث يجب التقاط جزء كبير من الكروماتين الذي يتم فحصه في شكل كروموسوم اصطناعي ومعالجته مع عينات 3C. قد لا يكون تأمين مثل هذا البناء ممكنا ، وقد يكون إنشاء واحد خارج نطاق مشروع الفصل الدراسي. بسبب هذه الصعوبات ، نقترح استخدام التمهيدي التحكم. لا يحل التمهيدي للتحكم محل جميع وظائف "قالب التحكم" ولكنه لا يزال يوفر الفرصة لتحليل البيانات لاتخاذ قرارات "الحضور" أو "الغياب".
عند إجراء qPCR ، من المهم استخدام كميات متساوية من العينة. يجب تحديد ذلك ، حتى لو كان يستخدم مقياس الطيف الضوئي النانوي مثل nanodrop ، عن طريق توليد منحنى قياسي من الحمض النووي الجينومي بتركيز معروف وتركيب عينات 3C على هذا الخط. يجب تسجيل هذه المبالغ واستخدامها في PCRs اللاحقة. جودة تفاعل PCR مهمة أيضا. نظرا لأن تفاعل البوليميراز المتسلسل يعمل في qPCR ، يتم قياس وفرة المنتج باستخدام مضان وتسجيله. يمكن الوصول إلى هذا التسجيل في مخطط التضخيم. بمجرد انتهاء البرنامج ، من المهم التحقق من مخطط التضخيم والتأكد من أن التفاعلات (باستثناء عناصر التحكم في عدم وجود قالب) لها ثلاث مراحل: خط الأساس ، والأسي ، ومرحلة الهضبة / التشبع. من المهم التحقق من أن ردود الفعل لها مرحلة أسية ، خاصة لتحديد العتبة (انظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للعينات المخففة بشكل متسلسل ، يجب أن يكون هناك تحول في قيم Ct بما يتفق مع تخفيف العينة (سيكون لأعلى تركيز أدنى قيم Ct ، بينما سيكون للتركيز الأدنى أعلى قيم Ct). تتطلب العينات التي لا تعكس هذا التغيير في مخطط التضخيم تخفيفا جديدا أو تشير إلى مشكلة أكبر في تكوين عينة 3C. أخيرا ، أثناء إنشاء المنحنى القياسي ، سيحسب برنامج PCR كفاءة PCR وقيمة R2 . يجب أن تكون كفاءة PCR أكبر من 90٪ ، ويجب أن تكون قيمة R2 أكبر من 0.99. إذا لم يتم استيفاء أي من هذه الشروط ، فمن المحتمل أن يكون هناك خطأ ما في العينة أو بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل.
بعد qPCR ، يمكن حساب النسبة المئوية للهضم ووجود تفاعلات 3C باستخدام qPCR Ct لكل تفاعل. لتحديد هذه ، أولا ، يجب تعيين عتبة تفاعل PCR. يتم ذلك عادة باستخدام البرنامج الذي يأتي مع جهاز qPCR. سيحدد تحديد العتبة تركيز منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي سيتم استخدامه لمقارنة قيم عينة Ct. يجب أن تقسم العتبة منحنيات التضخيم لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في المرحلة الأسية للتضخيم. يمكن مقارنة تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل فقط مع التضخيم الأسي (في هذه الحالة ، بادئات التحكم وتفاعلات الاختبار التمهيدي) ، لأن هذه هي الطريقة الوحيدة للتأكد من أن التفاعلات تضخم الحمض النووي بنفس المعدل ويمكن مقارنتها بأمانة. عند تحليل الرسوم البيانية 3C ، يتم تحديد التفاعلات الإيجابية المشروطة على أنها تلك التي تحتوي على المزيد من المنتج على عينات التحكم ، والتحكم الجيني ، والتحكم في الهضم (الشكل 4B). ومع ذلك ، يجب التحقق من صحة هذه العينات باستخدام تسلسل سانجر بعد تنقية الهلام لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.
بعد تسلسل سانجر ، يمكن تحليل العينات التي تجتاز مراقبة الجودة باستخدام Blat. الهدف من هذا التحليل هو تحديد ما إذا كانت العينة تحتوي على تسلسل كل من المواقع الجينومية المستهدفة المحيطة بموقع التقييد (DpnII في حالة هذا البروتوكول). إذا تم تحديد كلا التسلسلين ، فيمكن اعتبار جزء 3C مصدقا عليه. إذا لم ترجع نتائج Blat التسلسل المتوقع ، فقد يشير ذلك إلى أن أحد البادئات أو كليهما ليس هو الأمثل ، مما يؤدي إلى نتيجة qPCR إيجابية خاطئة. ستحتوي ملفات التتبع للعينات الإيجابية الخاطئة على قمم أساسية غير محددة ، وستحتوي تقارير Seq في الغالب على استدعاءات أساسية "n".
يعد التحقق من صحة سانجر أمرا ضروريا ، حيث يمكن الحصول على إيجابيات خاطئة من تكوين منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الأثري. يمكن تحديد هذه الإيجابيات الخاطئة عندما لا تحتوي منتجات التسلسل على التسلسل المستهدف المتوقع أو خاصية موقع DpnII لجزء 3C مناسب (الشكل 5). يوفر تسلسل شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل أيضا نقطة بيانات أخرى للتجربة ويدفع الطلاب إلى أن تقنية 3C تحدد المواقع الجينومية البعيدة التي تتجمع في الفضاء ثلاثي الأبعاد داخل النوى.
توفر تقنية 3C ثروة من التقنيات الجزيئية الأساسية للطلاب الجامعيين في إجراء مرن ومباشر. تعد تقنية 3C هذه أيضا نقطة انطلاق لتقنيات 3C الأخرى التي تتضمن تسلسل الجيل التالي (NGS). هذه الأنواع من التجارب يمكن أن تعرض الطلاب الجامعيين لجوانب مهمة من المعلوماتية الحيوية وهي متجذرة في المبادئ الأساسية الموضحة هنا. الخبرة الجامعية والمشاركة هي مفتاح نجاحهم وتطورهم كعلماء شباب. من خلال توفير هذه الفرص ، يمكن للطلاب الجامعيين تعزيز فهمهم للمبادئ الأساسية مع بناء ثقتهم في معالجة التقنيات والأسئلة المتطورة.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل شبكة جائزة رود آيلاند للتطوير المؤسسي (IDeA) للتميز في البحوث الطبية الحيوية من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب المنحة رقم P20GM103430 ومركز براينت للصحة والعلوم السلوكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Millapore-Sigma | F8775 | |
| 100% Ethanol | Millapore-Sigma | E7023 | |
| CaCl2 | MP Biomedical | 215350280 | |
| chloroform | Millapore-Sigma | C0549 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millapore-Sigma | COEDTAF-RO | mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| Dithiothreitol (DTT) | Millapore-Sigma | D0632 | 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| DpnII | NEB | R0543M | |
| Glycerol | Millapore-Sigma | G9012 | |
| glycine | Millapore-Sigma | G8898 | |
| glycogen | Millapore-Sigma | 10901393001 | |
| HEPES | Millapore-Sigma | H3375 | |
| KCl | Millapore-Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Millapore-Sigma | P5655 | |
| methyl green pyronin | Millapore-Sigma | HT70116 | |
| MgAc2 | Thermoscientific | 1222530 | |
| Na2HPO4 | Millapore-Sigma | S5136 | |
| NaCl | Millapore-Sigma | S9888 | |
| phenol-chloroform | Millapore-Sigma | P3803 | |
| Pronase | Millapore-Sigma | 11459643001 | |
| Proteinase K | IBI Scientific | IB05406 | |
| qPCR Ready mix (Phire Taq etc) | Millapore-Sigma | KCQS07 | |
| RNase A | Millapore-Sigma | R6148 | |
| Sodium Acetate | Millapore-Sigma | S2889 | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Millapore-Sigma | L3771 | |
| Sucrose | Millapore-Sigma | S0389 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1804 | |
| Tris-HCl | Millapore-Sigma | 108319 | |
| Triton X-100 | Millapore-Sigma | T9284 | |
| Trypsin-EDTA | Millapore-Sigma | T4049 |
References
- McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C.
- Nalabothula, N., et al. The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation. BMC Genomics. 15, 92 (2014).
- John, S., et al. Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns. Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).
- Fawcett, D. W. On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates. The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).
- Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina. Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).
- Finlan, L. E., et al. Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells. PLoS Genetics. 4 (3), e1000039 (2008).
- Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development. Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).
- Chambeyron, S., Bickmore, W. A. Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).
- Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).
- Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH. The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).
- Li, B., Carey, M., Workman, J. L.
- Chen, A., Chen, D., Chen, Y. Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals. Gene. 667, 83-94 (2018).
- Hughes, A. L., Rando, O. J. Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo. Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).
- Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging. Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).
- Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern. Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N.
- van Berkum, N. L., Dekker, J. Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology. Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).
- Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus. American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).
- Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. University of California, Berkeley. , PhD thesis (2012).
- Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98 (3), 387-396 (1999).
- Cuadrado, A., et al. Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).
- Sarro, R., et al. Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development. Development. 145 (7), (2018).
- Tolhuis, B., et al. Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture. PLoS Genetics. 7 (3), e1001343 (2011).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish. Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).
- Dekker, J. The three "C" s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).
- Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).
- Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies. Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).
- Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).
