我们描述了一种分离小鼠小肠隐窝并从隐窝培养肠道三维类器官的方案。此外，我们还介绍了一种在无上皮下细胞微环境的条件下，由单个肠干细胞生成类器官的方法。
本文内容
摘要
摘要
目前，类器官培养代表了一种重要的工具 体外 研究不同器官中的多种生物学方面及疾病。小鼠小肠隐窝在三维细胞外基质中培养时可形成模拟肠道上皮的类器官。这些类器官包含所有类型的细胞，执行多种肠道稳态功能，包括潘氏细胞、肠内分泌细胞、吸收细胞、杯状细胞和簇细胞。通过向培养基中添加已明确的分子，可富集表达富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（Lgr5）的肠干细胞（ISCs），并诱导其向特定谱系分化；这些分子包括表皮生长因子、Noggin（一种骨形态发生蛋白）和R-spondin 1。此外，本文还详细描述了一种从单个表达红细胞生成素产生肝细胞样受体B2（EphB2）阳性的肠干细胞生成类器官的方案。本方法学文章介绍了从小肠组织中分离小肠隐窝及单个肠干细胞的技术，并确保类器官高效建立。
引言
肠道类器官自2009年首次建立以来，已成为一种强大的 体外 研究肠道生物学的工具，因其在形态和功能上与成熟组织具有相似性。近年来，源自成体组织干细胞的类器官培养技术取得进展，使得具有自我更新和分化潜能的肠道干细胞（ISCs）能够进行长期培养。这些类器官已被广泛应用于胃肠道生理学及病理生理学的基础与转化研究。1,2,3,4,5,6Clevers 团队开发的三维类器官为研究肠道上皮提供了具有更高生理相关性的强大工具7由于肠道类器官来源于组织干细胞并由多种细胞类型组成，它们能够重现肠道上皮的功能特性。值得注意的是，单个分选的富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5阳性（Lgr5+干细胞也可以在没有任何潘氏细胞或肠干细胞微环境（如上皮微环境或间质微环境）的情况下生成三维类器官7然而，单细胞分选的 Lgr5 具有类器官形成能力+ 细胞的数量相较于隐窝细胞和ISC-潘氏细胞双细胞群体而言较低8.
越来越多的研究表明，乙二胺四乙酸（EDTA）孵育或胶原酶解离的方法会导致上皮层松动并释放隐窝。由于酶解离可能影响隐窝细胞的状态，通常采用机械分离法来解离组织。尽管机械消化是一种快速的技术，但该方法可能导致隐窝得率不一致或细胞活力较差9。因此，可将EDTA处理与机械解离相结合，以获得更高的隐窝得率。本文所示方法的一个特点是，在EDTA螯合后对组织碎片进行剧烈振荡10。剧烈振荡有助于从小肠的隐窝-绒毛复合体中高效分离隐窝。手动振荡的程度决定了分离效果。因此，从复合体中获取隐窝对该领域的研究人员而言至关重要。此外，适当的操作技巧可将绒毛污染降至最低，并提高隐窝数量。
因此，本实验方案采用小鼠来源的小肠类器官，在使用EDTA进行解离处理后，可通过物理力量更有效地分离隐窝。已知促红细胞生成素生成肝细胞受体B2（EphB2）的表达模式在一定程度上反映了隐窝微环境的特征。例如，EphB2阳性细胞从底部到顶部有序排列11。根据EphB2的表达水平进行荧光激活细胞分选（FACS），将获得的细胞分为四组：EphB2high、EphB2med、EphB2low和EphB2neg。随后，展示了野生型（WT）小鼠中单个分选的EphB2high细胞形成类器官的生长能力。
方案
所有小鼠实验均经三得利动物伦理委员会批准（批准号：APRV000561），所有动物的饲养和使用均遵循该委员会关于实验动物护理和使用的指南。实验采用标准的野生型Mus musculus品系（C57BL6/J）。使用年龄在10至20周之间的雄性和雌性小鼠。小鼠通过CO2窒息法实施安乐死。
1. 小肠的分离
- 使用手术剪切除小肠，包括十二指肠和空肠近端的一半。
- 将组织转移至培养皿中，并用5 mL注射器吸取5 mL冰冷的含抗生素PBS缓冲液（PBS + 青霉素-链霉素[1%] + 庆大霉素[0.5%]）冲洗小肠，以清除管腔内容物。
- 沿长轴方向用手术剪将组织剪开，并在振荡条件下用冰冷的含抗生素PBS缓冲液手动清洗。
注意：通过载玻片刮除绒毛可减少绒毛污染12。 - 使用手术剪取约5 mm × 5 mm大小的小肠节段组织块。用镊子将组织碎片转移至50 mL离心管中，并加入25 mL冰冷的含抗生素PBS缓冲液。
- 在50 mL离心管中，用25 mL冰冷的含抗生素PBS缓冲液来回振荡10次，洗涤组织碎片以去除肠道内容物。
2. 隐窝分离
- 将组织块置于含 2 mM EDTA 的 PBS-ABx 中，冰上孵育 30 分钟，期间不进行震荡。
- 为便于细胞外基质（ECM）凝固，提前将 24 孔板放入 37 °C 组织培养孵箱中预热。
- 用真空泵吸除细胞培养体系中的 EDTA 溶液，加入 25 mL 新鲜且预冷的 PBS-ABx，然后用手剧烈上下震荡 30–40 次，以释放隐窝-绒毛复合体。
注意：可通过显微镜在 4 倍放大下观察 25 µL 悬液液滴，检查分离出的隐窝和绒毛。 - 随后，将悬液通过 70 µm 细胞筛过滤一次。
- 在 4 °C 条件下，以 390 × g 离心 3 分钟。
- 用移液器将隐窝沉淀重悬于 20 mL 山梨醇 DMEM（高级 DMEM/F12 + 青霉素-链霉素 [1%] + 庆大霉素 [0.5%] + 胎牛血清 [1%] + 山梨醇 [2%]）中，然后将隐窝悬液转移至两个新的 15 mL 离心管中，分为两份 10 mL 溶液，进行低速离心。
注意：可通过低速离心分离大细胞团块与细胞/碎片；大细胞团块位于沉淀中，细胞/碎片则位于上清液中。 - 将两份隐窝悬液在 4 °C 条件下以 80 × g 离心 3 分钟，然后轻轻吸除上清液。
注意：由于沉淀形成较弱，吸液时不可过度，每管保留 2 mL 上清液。 - 再次向每管中加入 10 mL 山梨醇 DMEM，在 4 °C 条件下以 80 × g 离心 3 分钟。
- 吸除上清液后，每管保留 2 mL 上清液，再加入 10 mL 山梨醇 DMEM 重悬沉淀，最后在 4 °C 条件下以 80 × g 离心 3 分钟。
- 吸除上清液后，每管保留 2 mL 上清液，加入 10 mL 完全 DMEM（高级 DMEM/F12 + 青霉素-链霉素 [1%] + 庆大霉素 [0.5%] + 胎牛血清 [1%]），通过上下吹打重悬沉淀，并静置 1 分钟。
注意：静置 1 分钟有助于高效获得漂浮的隐窝。 - 1 分钟后，分别收集每管 10 mL 悬液，共 20 mL，用 70 µm 细胞筛过滤一次，以纯化隐窝。
- 在接种基本纯净的隐窝前，计数过滤后完全 DMEM 中的隐窝数量，然后在 4 °C 条件下以 290 × g 离心 3 分钟。
- 在 6 cm 培养皿中三个不同位置各滴加 25 µL 液滴，在显微镜下以 4 倍放大观察并计数隐窝数量，计算每 25 µL 液滴中的隐窝浓度。
- 每孔用 40 µL ECM 悬浮 100 个隐窝，上下吹打 5–10 次，使隐窝在 ECM 中形成均匀悬液，随后接种于已预热至 37 °C 的 24 孔板中。
注意：始终将 ECM 置于冰上以防止聚合；移液时需小心，避免在 ECM 中产生气泡。 - 将 24 孔板置于 37 °C、5% CO2 孵箱中孵育 15 分钟，使 ECM 完成聚合。
- 最后，在 ECM 上覆盖 500 µL 含小鼠表皮生长因子（EGF）、重组小鼠 R-spondin 1 和重组小鼠 Noggin 的培养基（室温），每孔终浓度如下：青霉素-链霉素（1%），50 U/mL；庆大霉素（0.5%），25 µg/mL；EGF，20 ng/mL；Noggin，100 ng/mL；R-spondin 1，500 ng/mL；L-谷氨酰胺，2 mM。
- 在 37 °C、5% CO2 孵箱中开始隐窝培养。
注意：有关 24 孔板类器官培养基的配制，请参见 表 1。 - 使用配备 20 倍物镜的延时成像显微镜，每 3 小时进行一次长时间活细胞成像，持续最多 7 天，获取 z 轴堆栈图像，z 轴步进为 1 µm（1 µm × 五步）。
- 每隔一天更换一次培养基。
3. 荧光激活细胞分选（FACS）
- 从小鼠中分离隐窝（参见第2节）。
- 用2 mL胰蛋白酶在37 °C下处理分离的隐窝30分钟。
- 用10 mL PBS终止反应，然后通过20 µm细胞滤筛过滤。
- 将溶液在 390 × g 4 °C下孵育3分钟，用100 µL完全DMEM重悬。
- 加入抗 EphB2 APC 偶联抗体（1/50），冰上孵育 30 分钟。
- 用 PBS 洗涤细胞 3 次，最后加入 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）（1/100）。
- 分选染色后的细胞 通过 FACS
- 调整面积缩放因子，并根据细胞大小（前向散射，FSC-A）与颗粒度（侧向散射，SSC-A）进行分选。
- 使用波长为488 nm、功率为50 mV的激光，根据7-AAD阴性和阳性细胞分选活细胞。
- 划定分选门以分选EphB2高表达（EphB2-high）细胞高），EphB2-中等（EphB2医学），EphB2低表达（EphB2-low）低）以及EphB2阴性（EphB2阴性) 细胞，激光设置为波长640 nm，功率100 mV。
- 启动 EphB2高 37 °C、5% CO₂ 条件下的细胞培养2 培养箱
4. 单细胞培养类器官
- 根据EphB2表面水平梯度进行细胞分离方法11，然后获得四个不同的细胞群（高表达、中表达、低表达和阴性）。
- 收集细胞，在4 °C条件下以390 × g 离心3分钟形成沉淀，通过移液将单个分选的EphB2high细胞悬浮于细胞外基质（ECM）中，随后接种至24孔板（每孔100个单细胞/40 µL ECM）。
- 同步骤2.14，使ECM发生聚合，并在ECM上覆盖含有Rho相关激酶（ROCK）抑制剂（10 µM）的培养基，前2天使用以维持EphB2high细胞的存活。
注意：ROCK抑制剂可有效防止失巢凋亡（anoikis）。 - 使用倒置显微镜在40倍放大倍数下人工检查细胞，观察具有球形结构和隐窝样突起的存活类器官。
结果
为生成小鼠小肠类器官，可结合EDTA处理与机械分离法，以高效分离隐窝10,13。本研究结果显示，几乎所有分离得到的隐窝在从上皮细胞生态位中挤出后立即闭合，并呈现圆锥形（图1A）。为最大限度减少绒毛污染，将所得悬液通过70 µm细胞筛过滤，随后对滤液进行离心。由于部分隐窝在过滤和悬液过程中可能受损，因此这些步骤应谨慎操作。结果表明，最终组分中的几乎所有隐窝均保持完整，适合用于培养（图1B）。为单独观察每个接种的隐窝，每孔接种100个隐窝（图1C）。加入特定的隐窝培养基后（图1D），每日通过显微镜监测类器官的发育情况。此外，通过延时成像观察隐窝来源的类器官生长，以监测其发育过程（图1E 和 补充视频S1）。培养的隐窝表现出典型的发育模式。类器官的内腔充满大量凋亡细胞。肠干细胞（ISC）在出芽区域的隐窝部位发生活跃增殖与分化（图1E 和 补充视频S1）。出芽过程伴随ISC的迁移与增殖以及潘氏细胞的分化。分化后的潘氏细胞始终定位于出芽部位（补充图S1）。由于在10倍放大倍率的倒置显微镜下确认类器官在培养中保持稳定，该技术可用于研究发育中小肠中隐窝的形成，以及评估组织再生能力与肠干细胞长期存活能力，从而支持新肠上皮细胞的生成14,15,16。
Lgr5 被定义为一种肠干细胞（ISC）标志物，小鼠 Lgr5+ 细胞形成三维类器官7然而，由于LGR5蛋白在细胞表面的表达量较低，且缺乏高亲和力的抗LGR5抗体，通过FACS高效分离小鼠肠干细胞（ISCs）仍具挑战性。EphB2此前已被鉴定为从小鼠和人类肠道组织中分离纯化肠干细胞的表面标志物。17,18EphB2的表达模式增加了肠干细胞标记物的复杂性。EphB2阳性细胞分布于整个增殖区，在隐窝底部最为密集，并沿隐窝向上呈梯度递减。11潘氏细胞和前体细胞也定位于隐窝。潘氏细胞主要表达EphB3，该分子对其定位至关重要，而隐窝中位于其上方的前体细胞则主要表达EphB2。因此，在使用抗EphB2抗体进行肠干细胞纯化过程中，可能同时污染这两种细胞类型。因此，应评估通过流式细胞术利用EphB2分离的细胞的标志基因表达及其类器官形成能力。
基于这些事实，可通过FACS分析从野生型隐窝中分离出EphB2表面标记的细胞19。已有研究探讨EphB2的表达是否能够区分四类细胞群体，这些群体具有特定标记物的表达特征，例如肠干细胞特异性标记基因（Lgr5、Ascl2 和 Olfm4）以及祖细胞特异性标记基因（Ki67、Myc 和 FoxM1）。该实验表明，EphB2high细胞主要为肠干细胞，而EphB2med细胞则不然20,21。最后，根据细胞分离方法，所获得的细胞被分为四组（EphB2high、EphB2med、EphB2low 和 EphB2neg 细胞）（图2）。随后，通过FACS分选获得的单个高表达EphB2的细胞被用于类器官培养。单个EphB2high细胞可独立用于局部处理，并重建出类似于正常小肠的自我组织化的隐窝-绒毛结构（图3）。然而，来自其他组（EphB2med、EphB2low 和 EphB2neg）的细胞则无法形成类器官20。
在之前的一项研究中，约6%的单细胞分选Lgr5-GFPhi细胞能够启动隐窝-绒毛类器官的形成7。然而，其余细胞无法生成类器官，并在前12小时内死亡7。作者推测，这可能是由于分离过程本身所固有的物理和/或生物学应激所致7。在野生型小鼠中，单细胞分选的EphB2high细胞也获得了低于6%的类器官生长率。培养至第5天时，形成类球状结构（图3）。从第7天到第9天，这些斑点向外突出，形成隐窝结构（图3）。重要的是，对单细胞分选的EphB2high细胞应用特定的ROCK抑制剂，可减轻解离诱导的细胞凋亡，并提高类器官生长的效率。
图1：小鼠小肠类器官的生成。（A）通过EDTA螯合与机械解离联合方法制备的隐窝。（B）最终获得的纯化隐窝。（C）包埋于细胞外基质中的隐窝。（A-C）黑色箭头指示隐窝。（D）隐窝与类器官的三维培养。（E）由隐窝发育而成的类器官的代表性图像。白色箭头指示隐窝出芽。比例尺 = （A-C）100 µm 和（E）50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：在野生型小鼠中获取EphB2阳性（EphB2+）细胞群体的流式细胞术设门策略。（A）利用前向散射和侧向散射散点图分别根据细胞大小和颗粒度对细胞进行区分。（B）利用荧光散射根据细胞的7-AAD（PerCP）荧光强度区分活细胞，并选择7-AAD阴性细胞群体的设门。（C）设定EphB2高表达（EphB2high）、EphB2中等表达（EphB2med）、EphB2低表达（EphB2low）和EphB2阴性（EphB2neg）细胞群体的设门。缩写：FSC-A = 前向散射峰面积；SSC-A = 侧向散射峰面积；7-AAD = 7-氨基放线菌素D。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：野生型小鼠中单细胞分选的EphB2high细胞类器官生长的时间过程。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：24孔板的培养基。 请点击此处下载该表格。
补充视频 S1：类器官生长的延时图像。比例尺 = 50 µm。请点击此处下载该文件。
补充图 S1：类器官中抗溶菌酶抗体染色的代表性图像。 白色箭头指示潘氏细胞。缩写：DIC = 差示干涉对比显微镜。比例尺 = 10 µm。 请点击此处下载该文件。
讨论
本方案描述了一种稳定分离小肠隐窝并随后进行三维类器官培养的方法。为了提高隐窝释放率，建立了一种机械分离方法，即在EDTA处理后进行剧烈振荡。本方案所用培养基成分与Sato等人7的原始方案不同。原始培养基相对昂贵，因此本文在表1中列出了适用于小鼠小肠类器官的培养基配方，以及含有药理学抑制剂、重组生长因子和/或条件培养基的定制化培养基。本方案的培养基中不包含Wnt3A和N-乙酰半胱氨酸。由于潘氏细胞表达Wnt3，这些细胞可自行产生Wnt3并支持肠干细胞（ISC）的维持。此外，在隐窝分离过程中不使用条件培养基。类器官模型具有动态性，并表现出细胞和结构上的异质性（包括潘氏细胞、肠上皮细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞、簇细胞和肠干细胞）。因此，这些类器官可用于大规模研究类器官生物学中的基本问题。
EphB2 梯度在成年小肠隐窝-绒毛轴向上维持肠干细胞（ISC）的干性和增殖能力18。相较于分离完整的隐窝，使用单个 EphB2 阳性细胞培养类器官的优势在于有助于深入理解小鼠肠干细胞的生物学特性，因为肠干细胞在多种人类肠道疾病中发挥关键作用。单个高表达 EphB2 的肠干细胞（EphB2high）可像单个表达 Lgr5 的肠干细胞一样被培养形成类器官。其中最关键的步骤是利用流式细胞分选技术（FACS），根据隐窝中 EphB2 的表达水平，将细胞精确分为四组：EphB2high、EphB2med、EphB2low 和 EphB2neg。前向散射光与侧向散射光（FSC 与 SSC）图谱通常用于根据细胞大小和颗粒度来识别目标细胞。在 P0 门控中，FSC 反映细胞大小，SSC 反映细胞的复杂性或颗粒度（图 2A）。在本研究中，位于设定门控（P0）内的细胞随后进行活力分析。接着，根据 7-AAD 荧光信号的阴性和阳性群体来判断其活力。7-AAD 阴性与阳性细胞之间的分界被严格设定，以确保获得尽可能不含阳性细胞污染的阴性细胞群体。EphB2 的门控设置大致依据 EphB2 表达的梯度模式进行划分。
为确认四个组别是否被精确划分，分析了所选基因的 mRNA 表达水平。ISC 标记物的 mRNA 水平在 EphB2high 细胞中较高20。此外，祖细胞特异性标记物的 mRNA 水平在 EphB2med 细胞中相对较高20。然而，与 EphB2high 和 EphB2med 细胞相比，EphB2low 和 EphB2neg 细胞中的 EphB2 表达较低或呈阴性20。在接种前应采取上述措施，以确保 EphB2high 细胞群体的有效富集。然而，EphB2high 细胞形成类器官的效率低于 6% 可能是由于干细胞在培养过程中死亡所致，而非隐窝分离时剧烈震荡引起。已有研究表明，向人胚胎干细胞中添加选择性 Rho 相关激酶（ROCK）抑制剂可显著减少解离诱导的细胞凋亡22。因此，作为一种技术改进，值得尝试提高 ROCK 抑制剂的浓度并延长孵育时间，以改善细胞存活率。
位于肠干细胞（ISCs）旁的分泌Wnt3A的潘氏细胞为肠干细胞提供必要的支持8事实上，与单个肠干细胞相比，肠干细胞-潘氏细胞双细胞组合表现出显著增强的类器官形成能力8此外，在培养的前3天添加浓度为100 ng/mL的Wnt3A已被证明可提高类器官形成能力8因此，作为另一项技术改进，添加外源性 Wnt3A 可提高单个 EphB2 细胞的类器官形成能力高表达 ISCs。
与体内（in vivo）方法相比，类器官更易于进行遗传操作、恶性表型分析以及药物筛选20,23。结合EDTA螯合与机械分离法从隐窝制备小肠类器官具有高效、可重复且省时的优点，且实验人员无需具备高级经验即可轻松操作。因此，在EDTA处理后通过剧烈振荡进行机械分离，可高效地在体外（ex vivo）建立小鼠小肠类器官，为类器官培养及其他成年上皮组织的疾病建模提供了潜在工具。
肠上皮细胞具有极性，其顶面朝向管腔。然而，在三维类器官中，朝向管腔的顶面位于类器官内部。这种结构限制了对顶面的接触，因而在研究管腔成分（如营养物质、微生物和代谢物）对上皮细胞的影响时会带来困难。为克服这一缺点，已开发出将类器官细胞培养为二维单层细胞的方法24。在未来的应用中，类器官细胞单层培养将被广泛采用，因其代表了最高效且易于操作的体系。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了T.T.（资助号JP17K07495和JP20K06751）的科学研究费补助金（C）的支持。我们感谢研头峰子教授提供用于长期延时成像的设备（LCV100；Olympus）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Eppendorf 管 | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| 5 mL 注射器 | TERUMO | SS-05SZ | |
| 15 mL Falcon 管 | Iwaki | 2325-015 | |
| 20 μm 细胞筛 | Sysmex | 04-004-2325 | |
| 24 孔板 | Iwaki | 3820-024 | |
| 50 mL Falcon 管 | Iwaki | 2345-050 | |
| 60 mm 组织培养皿 | FALCON | 353002 | |
| 70 μm 细胞筛 | Falcon | 352350 | |
| 100 mm 培养皿 | Iwaki | 3020-100 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
| Anti-EphB2 APC 标记抗体 | BD Biosciences | 564699 | |
| C57BL6/J 小鼠 | Japan SLC, Inc. | ||
| 超净工作台 | HITACHI | CCV-1306E | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | FV3000 | |
| EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
| FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
| 胎牛血清 | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
| Fiji (软件) | https://fiji.sc/ | ||
| 庆大霉素 (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
| Hammacher 实验室剪刀 | SANSYO | 91-1538 | |
| 培养箱 | Panasonic | MCO-170-PJ | |
| 实验室镊子 | AS-ONE | 7-164-04 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | 用于 3D 类器官的细胞外基质 |
| 小鼠抗人溶菌酶抗体 | LSBio | LS-B8704-100 | |
| 重组小鼠 EGF (20 μg/mL 储存液) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
| PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
| 青霉素-链霉素 (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
| Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL 和 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, 和 -16 | |
| 重组小鼠 Noggin (20 μg/mL 储存液) | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
| 重组小鼠 R-Spondin 1 (250 μg/mL 储存液) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
| 山梨醇 | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
| TE2000-S (倒置显微镜) | Nikon | 24131 | |
| 延时成像显微镜 | Olympus | LCV100 | |
| TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
| ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
| Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |
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