甲醇可作为视网膜铺片制备和长期保存的辅助固定介质，有助于视网膜神经节细胞的研究。
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本文内容
摘要
摘要
视网膜神经节细胞（RGCs）是视网膜的投射神经元，负责将外界视觉信息传递至大脑。RGCs的病理变化与多种视网膜变性疾病密切相关。在RGCs的实验研究中，视网膜全层免疫染色常用于评估视网膜的发育和病理状态。在某些情况下，一些珍贵的视网膜样本（如来自转基因小鼠的样本）需要长期保存，同时不改变RGCs的形态或数量。为了获得可信且可重复的实验结果，使用有效的保存介质至关重要。本文介绍了甲醇作为视网膜全层制备及长期保存的辅助固定介质的效果。简言之，在分离过程中，将冷甲醇（−20 °C）滴加至视网膜表面，以帮助固定组织并增强其通透性，随后视网膜可在冷甲醇（−20 °C）中保存，待后续进行免疫染色。本方案描述了视网膜分离的操作流程及组织样本保存方法，对RGCs的研究具有实用价值。
引言
视网膜神经节细胞（RGCs）是视网膜中唯一的投射神经元，负责整合视觉信息并将其传递至大脑1。许多神经退行性疾病，如青光眼和外伤性视神经病变，其特征均为RGCs的不可逆性损伤和丢失2,3。分析RGCs的形态学和定量变化，是明确神经退行性疾病发生与发展机制的关键步骤4,5。
间接免疫荧光法是一种广泛接受的方法，用于监测蛋白质分布和细胞计数。在实验室中，视网膜全层免疫染色常用于视网膜神经节细胞（RGCs）的实验研究，以评估视网膜的生理和病理状态6。在全视网膜中用于RGC定量的最常见标志物包括Brn3a、具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）等7,8。要准确表征RGC的数量和分布，需要高质量的视网膜全层免疫染色。通常，在免疫染色方案中，视网膜需先浸入化学固定剂中固定，然后再与抗体孵育。理想的固定剂不应改变细胞形态、抗原表位对抗体的可及性或亲和力，也不应改变组织的线性尺寸9,10。
由于视网膜结构复杂，在制作全层视网膜组织片时，容易出现视网膜脆弱、折叠，以及细胞收缩、细胞核不清晰等常见问题，从而对实验研究产生不利影响。此外，并非所有视网膜都能立即进行免疫染色，尤其是价格昂贵、来源珍贵的转基因小鼠视网膜，因此有必要保存多余的视网膜样本以供后续使用。
合适的固定液能够快速固定组织，防止组织自溶，保持组织细胞的正常形态和结构，并保留蛋白质及其他物质的抗原性10。目前，基于甲醛的固定方法已广泛应用于各种组织，包括分离的视网膜、半切的眼杯以及完整的眼球10。组织收缩和细胞形态改变是甲醛浸泡后面临的两个关键挑战11。此外，越来越多的改良固定配方被开发出来，以最大程度地保留视网膜及靶细胞的原始特性9,10。不同的视网膜固定处理可能对视网膜结构、蛋白质免疫原性、荧光激发以及衰减淬灭循环产生不同影响12,13。与福尔马林固定的视网膜相比，经Davidson's溶液固定的视网膜在形态上更为完整，但Davidson's溶液与某些抗体的兼容性较差，例如小胶质细胞标志物——钙离子结合接头分子1（ionized calcium binding adaptor molecule 1）12。考虑到视网膜的脆弱性，研究人员自然会关注长期储存后视网膜完整性以及靶细胞的性质和形态是否会发生变化。然而，关于固定液在数月储存后对视网膜及视网膜神经节细胞（RGC）形态可能产生的影响，相关报道极为少见。优化视网膜固定对于RGC的评估与保存至关重要。
我们提供了一种可靠且技术上简便的方法的详细描述，用于小鼠视网膜整体染色。本方法强调了视网膜的正确制备与保存，以用于视网膜神经节细胞（RGC）的研究，同时考虑了视网膜组织长期保存的需求，以及荧光团形成或降解过程中的特定因素。
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方案
所有步骤均在室温下进行，除非另有说明。所使用的所有C57BL/6J小鼠均购自武汉大学实验动物中心，相关实验均经武汉大学实验动物伦理委员会批准。所有操作均尽可能减少小鼠的痛苦。
1. 眼球摘除与固定
- 使用二氧化碳窒息法处死小鼠，并用无齿镊子轻轻摘除眼球。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗眼球一次。
- 在显微镜下（目镜WF：10x/22；连续变倍物镜：0.67x-4.5x）用注射器针头在角膜处刺穿眼球，以加快固定液进入眼球，提高固定效率。
- 将眼球转移至含有4%多聚甲醛（PFA）的24孔板中。
- 在4% PFA中固定眼球45分钟，随后立即转移至1x PBS中以去除多余的PFA（每次5分钟，共洗涤三次）。
2. 视网膜分离与展平
- 将眼球转移至载玻片上，置于解剖显微镜下（目镜WF：10x/22；连续变倍物镜：0.67x-4.5x）。
- 一手持镊子，夹住角膜边缘以固定眼球；另一手持解剖剪，在角巩膜缘处围绕角膜剪开，深度约为1 mm。随后取出晶状体和玻璃体。
- 以镊子固定视盘中央位置，使用解剖剪沿视网膜四个象限呈放射状剪开，剪至视网膜半径约2/3处。
- 用有齿镊夹住一侧巩膜边缘，另一手用无齿镊夹住巩膜边缘，从有齿镊固定的部位向巩膜基底部方向缓慢移动，小心剥离视网膜。
- 用移液器（200 µL）吸取PBS冲洗并润湿视网膜，然后用一小块吸水纸吸去多余PBS。如有需要，可用小毛刷轻轻展平视网膜。
- 缓慢地将预冷的甲醇（预先在−20°C冰箱中冷却）逐滴加至视网膜内表面（甲醇用量不固定，以完全覆盖视网膜为宜）。视网膜会变白并增强韧性。
- 轻轻展平视网膜，并用小毛刷去除残留的色素膜和玻璃体等杂质。用小毛刷将视网膜翻面，重复上述处理步骤。
- 将经甲醇处理的视网膜转移至24孔板的一个孔中，保持其完全浸没在甲醇中。
- 若用于立即进行免疫染色，可在−20°C下保存1-2小时；若需长期保存，可将视网膜保留在甲醇中，并于−20°C储存。
- 从24孔板中移除甲醇，用1x PBS冲洗视网膜。
3. 视网膜神经节细胞的免疫荧光染色
- 用塑料巴斯德吸管将视网膜小心转移至24孔血凝板中，在室温下用5% PBS-TX-BSA（将5 g牛血清白蛋白粉末溶于100 mL 1× PBST溶液中；PBST由10 mL Triton X-100加入2,000 mL 1× PBS中配制而成）封闭4小时，或在4 °C下过夜。操作时保持节细胞层朝上。
- 去除PBS-TX-BSA，加入100 µL选定的一抗（豚鼠抗RBPMS抗体），按1:400稀释，于4 °C孵育48–96小时。
- 移除一抗，用1× PBS在室温下振荡清洗视网膜三次，每次20分钟。
- 加入100 µL相应的二抗（见材料表），即Cy3标记的驴抗豚鼠IgG (H+L)（cyanine Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)），按1:400稀释，于4 °C轻柔振荡孵育过夜。
- 用1× PBS清洗视网膜三次，每次20分钟。
- 将视网膜平铺于载玻片上，使节细胞层朝上，用移液器在视网膜周围滴加适量抗荧光淬灭剂，然后加盖盖玻片（注意避免产生气泡）。
注意：确定抗荧光淬灭剂用量时，应确保其完全覆盖视网膜。加盖玻片时需防止视网膜漂浮或移动。 - 用封片剂将盖玻片四周完全密封，防止样品移动。将样本于−20 °C避光保存。
- 使用荧光/共聚焦显微镜对视网膜进行成像。
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结果
解剖后，视网膜应呈现为平坦的四叶草状。在本研究中，按照上述方案操作，加入甲醇后视网膜变为白色（图1）。同时，视网膜的质地由柔软变为柔韧且平坦。随后，使用抗RBPMS抗体对视网膜神经节细胞（RGCs）进行标记8。采用共聚焦显微镜（目镜：10x；物镜：40x）对整体视网膜样本（n = 3）拍摄四个成像视野。在甲醇处理前以及经甲醇长期保存12个月后的视网膜中，RGCs的代表性荧光图像如图2所示。荧光强度未见显著变化，表明甲醇保存对RGC的免疫荧光染色无影响。
图1：甲醇处理后视网膜的变化。
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讨论
固定是保存视网膜的关键步骤，可能影响后续基于形态学的视网膜神经节细胞（RGC）研究。成功的固定能够迅速捕捉视网膜在接触固定液瞬间的结构与状态，这对于后续分析至关重要。尽管甲醛被公认为组织和细胞固定与保存中最常用的固定剂之一，但单独使用甲醛并不总是某些研究中最理想的化学固定剂10,14。不同类型的固定剂在沉淀氨基酸和核苷酸、稳定蛋白质以及维持细胞形态方面具有不同的能力15。通过联合使用两类固定剂，可充分结合各自的优势16,17。甲醇常用于组织新鲜冷冻或包埋于理想切片材料前的多种固定程序中16,18。在全层制备实验中，使用100%冷甲醇（−20 °C）进行视网膜样本固定，有助于样本通透化，从而利于后续基于荧光的成像
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披露
作者们未意识到存在任何可能影响本研究客观性的附属关系、会员资格、资金支持或财务持有情况。
致谢
本工作由湖北省重点实验室开放项目（资助号：2021KFY055）、湖北省自然科学基金（资助号：2020CFB240）和中央高校基本科研业务费专项资金（资助号：2042020kf0065）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔细胞培养板 | Costar | 眼球固定 | |
| 24孔血凝板 | Labedit Company | 孵育抗体 | |
| 黏附显微镜载玻片 | Citotest | 或类似产品 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Servicebio | G1401 | 减缓荧光淬灭 |
| BSA（牛血清白蛋白） | Servicebio | GC305010 | 封闭试剂 |
| 共聚焦显微镜 | OLYMPUS | 使用40倍物镜 | |
| 弯剪 | 江苏康华医疗器械有限公司 | 解剖工具 | |
| 解剖显微镜 | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | 解剖工具 |
| 镊子 | 江苏康华医疗器械有限公司 | 解剖工具 | |
| 甲醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 20210624 | GC≥99.5% |
| 指甲油 | SecheVite | 封固剂 | |
| 针头 | 上海金达企业发展集团有限公司 | 加速固定 | |
| 多聚甲醛溶液 | Servicebio | G1101 | 眼球固定 |
| PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.4） | Servicebio | G0002 | 冲洗眼球 |
| 一抗：豚鼠抗RNA结合蛋白多剪接体（RBPMS） | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | 用于免疫荧光，使用稀释比为1:400 |
| 二抗：Cy3标记驴抗豚鼠IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | 用于免疫荧光，使用稀释比为1:400 |
| 直剪 | 江苏康华医疗器械有限公司 | 解剖工具 |
参考文献
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