甲醇可作为视网膜铺片制备和长期保存的辅助固定介质，有助于视网膜神经节细胞的研究。
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本文内容
摘要
摘要
视网膜神经节细胞（RGCs）是视网膜的投射神经元，负责将外界视觉信息传递至大脑。RGCs的病理变化与多种视网膜变性疾病密切相关。在RGCs的实验研究中，视网膜全层免疫染色常用于评估视网膜的发育和病理状态。在某些情况下，一些珍贵的视网膜样本（如来自转基因小鼠的样本）需要长期保存，同时不改变RGCs的形态或数量。为了获得可信且可重复的实验结果，使用有效的保存介质至关重要。本文介绍了甲醇作为视网膜全层制备及长期保存的辅助固定介质的效果。简言之，在分离过程中，将冷甲醇（−20 °C）滴加至视网膜表面，以帮助固定组织并增强其通透性，随后视网膜可在冷甲醇（−20 °C）中保存，待后续进行免疫染色。本方案描述了视网膜分离的操作流程及组织样本保存方法，对RGCs的研究具有实用价值。
引言
视网膜神经节细胞（RGCs）是视网膜中唯一的投射神经元，负责整合视觉信息并将其传递至大脑1。许多神经退行性疾病，如青光眼和外伤性视神经病变，其特征均为RGCs的不可逆性损伤和丢失2,3。分析RGCs的形态学和定量变化，是明确神经退行性疾病发生与发展机制的关键步骤4,5。
间接免疫荧光法是一种广泛接受的方法，用于监测蛋白质分布和细胞计数。在实验室中，视网膜全层免疫染色常用于视网膜神经节细胞（RGCs）的实验研究，以评估视网膜的生理和病理状态6。在全视网膜中用于RGC定量的最常见标志物包括Brn3a、具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）等7,8。要准确表征RGC的数量和分布，需要高质量的视网膜全层免疫染色。通常，在免疫染色方案中，视网膜需先浸入化学固定剂中固定，然后再与抗体孵育。理想的固定剂不应改变细胞形态、抗原表位对抗体的可及性或亲和力，也不应改变组织的线性尺寸9,
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方案
所有步骤均在室温下进行，除非另有说明。所使用的所有C57BL/6J小鼠均购自武汉大学实验动物中心，相关实验均经武汉大学实验动物伦理委员会批准。所有操作均尽可能减少小鼠的痛苦。
1. 眼球摘除与固定
- 使用二氧化碳窒息法处死小鼠，并用无齿镊子轻轻摘除眼球。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗眼球一次。
- 在显微镜下（目镜WF：10x/22；连续变倍物镜：0.67x-4.5x）用注射器针头在角膜处刺穿眼球，以加快固定液进入眼球，提高固定效率。
- 将眼球转移至含有4%多聚甲醛（PFA）的24孔板中。
- 在4% PFA中固定眼球45分钟，随后立即转移至1x PBS中以去除多余的PFA（每次5分钟，共洗涤三次）。
2. 视网膜分离与展平
- 将眼球转移至载玻片上，置于解剖显微镜下（目镜WF：10x/22；连续变倍物镜：0.67x-4.5x）。
- 一手持镊子，夹住角膜边缘以固定眼球；另一手持解剖剪，在角巩膜缘处围绕角膜剪开，深度约为1 mm。随后取出晶状体和玻璃体。
- 以镊子固定视盘中央位置，使用解剖剪沿视网膜四个象限呈放射状剪开，剪至视网膜半径约2/3处。
- 用有齿镊夹住一侧巩膜边缘，另一....
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结果
解剖后，视网膜应呈平坦的四叶草状。在本研究中，按照上述方案操作，加入甲醇后视网膜变为白色（图1）。同时，视网膜由柔软状态转变为柔韧且平坦的状态。接下来，使用抗RBPMS抗体对RGCs进行标记8。采用共聚焦显微镜（目镜：10x；物镜：40x）对整体视网膜样本（n = 3）拍摄四个成像视野。在甲醇处理前以及经甲醇长期保存12个月后的视网膜RGCs可视化代表性图像如图2所示。荧光强度未见显著变化。甲醇保存对RGC的免疫染色无影响。
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讨论
固定是保存视网膜的关键步骤，可能影响后续基于形态学的视网膜神经节细胞（RGC）研究。成功的固定能够迅速捕捉视网膜在接触固定液瞬间的结构与状态，这对于后续分析至关重要。尽管甲醛被公认为组织和细胞固定与保存中最常用的固定剂之一，但单独使用甲醛并不总是某些研究中最理想的化学固定剂10,14。不同类型的固定剂在沉淀氨基酸和核苷酸、稳定蛋白质以及维持细胞形态方面具有不同的能力15。通过联合使用两类固定剂，可充分结合各自的优势16,17。甲醇常用于组织新鲜冷冻或包埋于理想切片材料前的多种固定程序中16,18。在全层制备实验中，使用100%冷甲醇（−20 °C）进行视网膜样本固定，有助于样本通透化，从而利于后续基于荧光的成像
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披露
作者们未意识到存在任何可能影响本研究客观性的附属关系、会员资格、资金支持或财务持有情况。
致谢
本工作由湖北省重点实验室开放项目（资助号：2021KFY055）、湖北省自然科学基金（资助号：2020CFB240）和中央高校基本科研业务费专项资金（资助号：2042020kf0065）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔细胞培养板 | Costar | 眼球固定 | |
| 24孔血凝板 | Labedit Company | 孵育抗体 | |
| 黏附显微镜载玻片 | Citotest | 或类似产品 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Servicebio | G1401 | 减缓荧光淬灭 |
| BSA（牛血清白蛋白） | Servicebio | GC305010 | 封闭试剂 |
| 共聚焦显微镜 | OLYMPUS | 使用40倍物镜 | |
| 弯剪 | 江苏康华医疗器械有限公司 | 解剖工具 | |
| 解剖显微镜 | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | 解剖工具 |
| 镊子 | 江苏康华医疗器械有限公司 | 解剖工具 | |
| 甲醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 20210624 | GC≥99.5% |
| 指甲油 | SecheVite | 封固剂 | |
| 针头 | 上海金达企业发展集团有限公司 | 加速固定 | |
| 多聚甲醛溶液 | Servicebio | G1101 | 眼球固定 |
| PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.4） | Servicebio | G0002 | 冲洗眼球 |
| 一抗：豚鼠抗RNA结合蛋白多剪接体（RBPMS） | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | 用于免疫荧光，使用稀释比为1:400 |
| 二抗：Cy3标记驴抗豚鼠IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | 用于免疫荧光，使用稀释比为1:400 |
| 直剪 | 江苏康华医疗器械有限公司 | 解剖工具 |
参考文献
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A.
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重印与许可
