牙髓干细胞的原代培养

摘要

本文提供了利用组织块培养法建立牙髓干细胞原代培养的逐步操作指南，并依据ICSCRT指南对这些细胞进行表征。通过本方案分离获得的细胞可被视为间充质干细胞，用于后续应用。

摘要

人牙髓是一种具有优异再生能力的多能干细胞资源库，可从拔除的牙齿中获取。牙髓干细胞（DPSCs）起源于神经嵴来源的外间充质组织，具有高度可塑性，这使其在组织修复与再生中具备多重优势。目前，研究人员正在探索多种获取、维持和扩增成体干细胞的实用方法，以用于再生医学领域。本研究中，我们展示了通过组织块培养法从牙源组织建立原代间充质干细胞培养体系的过程。所分离的细胞呈纺锤形，并贴附于培养板的塑料表面。对这些干细胞的表型鉴定显示，其高表达国际细胞治疗学会（ISCT）推荐的间充质干细胞表面标志物，如CD90、CD73和CD105。此外，造血细胞标志物（CD45）和内皮细胞标志物（CD34）几乎不表达，HLA-DR标志物的表达低于2%，证实了DPSC培养物的均一性与纯度。我们进一步通过诱导其向成脂、成骨和成软骨方向分化，验证了其多向分化潜能。同时，通过添加相应的诱导刺激培养基，我们还成功诱导这些细胞分化为类肝细胞和类神经元细胞。该优化后的实验方案有助于在实验室中培养出可高度扩增的间充质干细胞群体，可用于基础研究或临床前研究。类似的方案也可整合至临床操作体系中，用于开展基于DPSC的治疗实践。

引言

成体干细胞因其可塑性、旁分泌机制和免疫调节特性，已成为细胞定向治疗和疗法中一种强大的治疗工具^1,2,3干细胞相关临床前研究取得的鼓舞人心的数据，激励着研究人员致力于将研究成果从实验室推向临床应用。用于干细胞治疗的干细胞类型在治疗效果中起着至关重要的作用。在临床前和临床研究中，间充质干细胞（MSCs）最主要的来源仍是骨髓^4,5。然而，主要缺点在于 使用骨髓来源的干细胞（BMSCs）存在一些局限性，包括其细胞数量稀少、分离过程具有高度侵入性以及扩增能力有限。因此，研究人员正在探索间充质干细胞（MSCs）的其他替代来源。在此背景下，牙源性组织因其易于获取、具有极强的可塑性、较高的再生潜能和强大的增殖能力，现已被认为是干细胞的一种丰富且具有潜力的替代来源。^6,7,8,9,10.

方案

本研究中所述所有操作均经昌迪加尔PGIMER机构伦理委员会（IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72）批准。所有与细胞培养相关的实验均需在II级生物安全柜（BSC）中按照无菌技术进行。牙髓组织来自三名因正畸需要拔除第三磨牙的健康患者（女性/14岁、男性/14岁和男性/20岁）。在样本采集前，已根据昌迪加尔PGIMER伦理委员会提供的指南，获得患者/监护人签署的书面知情同意书。

1. 从人牙组织建立牙髓干细胞（DPSCs）的原代培养

注意：任何龋坏的牙齿均不应使用。

1. 牙髓样本的采集及运输至组织培养实验室
   1. 在无创且无菌的条件下进行牙齿拔除手术。用无菌生理盐水彻底冲洗拔除的牙齿，以去除残留血液。
   2. 使用碳化钨裂钻在持续无菌生理盐水冲洗条件下，将拔除的牙齿纵向切割为两部分，以暴露牙髓组织。
   3. 将带有完整牙髓的拔牙样本置于冰上保存的无菌α-最低必需培养基（α-MEM）中，运送至细胞与组织培养实验室。
      ​注意：理想情况下，所有样本应在2小时内进行细胞培养处理。然而，最近有报道称，即使在24小时后处理牙齿样本，也不会影响牙髓干细胞（DPSCs）的存活率和增殖能力，但会降低其功能活性²⁹。
....

结果

在此，我们介绍研究人员如何建立牙髓干细胞（DPSCs）的纯培养体系 通过 外植体法^6,7,8,9,10 并诱导其向多个谱系分化，以确定培养物的纯度，用于后续应用。

我们建立了源自患者第三磨牙牙髓小块组织的牙髓干细胞（DPSCs）原代培养，如图所示 图1A最初，在组织块接种后的第四和第五天，仅在组织块或组织周围观察到极少数的圆形细胞。然而，到第12天^th 天，从组织块中迁移出的细胞数量增加，至第二周末（14^th-16^th 第几天时，大部分外植块周围已出现大量具有纺锤形形态的贴壁细胞。此时可将外植块从培养板中移除，继续在完.......

讨论

干细胞因其可塑性、强健性、免疫调节特性、旁分泌机制和归巢效率，被寄予治愈多种疾病的厚望。牙髓组织被认为是干细胞最有效且最有价值的来源，具有显著的可塑性和再生能力。本文中，我们展示了利用广泛采用的组织块培养法分离牙髓干细胞（DPSCs）的方法，其中细胞从牙髓组织碎片或组织块中迁移出来，生长为形态上类似纺锤形成纤维细胞样细胞的均一细胞培养物。组织块法能够获得更均一的DPSCs培养物，避免了内皮细胞和周细胞等其他细胞类型的残留，而这些细胞在酶消化法建立DPSCs培养过程中仍会存在³⁴。我们证明，通过组织块法获得的DPSCs表达国际细胞治疗学会（ISCT）推荐的间充质细胞表面CD标志物，如CD90、CD73和CD105；同时不表达CD45、CD34和HLA-DR标志物，表明DPSCs培养物具有较高的均一性和纯度。HLA-DR的缺失也使其适用于移植用途，排斥反应的可能性极低。本实验方案中有若干关键步骤，以确保DPSCs培养的效率和纯度：组织块在放入培养板前应至少用PBS洗涤四次，以避免任何可能的污染；组织块必须牢固贴附于培养孔表面，因为脱落的组织块不会产生细胞。因此.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 孔细胞培养板	Costar	3516	用于细胞培养
阿利新蓝染色液	EZstain 软骨细胞染色试剂盒，HiMedia	CCK029
茜素红 S 染色液	Sigma-Aldrich	TMS-008	成骨染色
抗生素混合液	Himedia	A002-5X50ML	防止培养污染
抗坏血酸	Himedia	TC094-25G	软骨诱导
B27 添加剂	Gibco	17504044	用于神经诱导
bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）	Gibco	PHG0024	用于神经诱导
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	表征分析
十六烷基吡啶氯化物（CPC）	Sigma-Aldrich	1104006	用于茜素红提取
地塞米松 21-磷酸二钠	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
杜氏磷酸盐缓冲液	Himedia	TS1006-5L	用于洗涤
EGF（表皮生长因子）	Gibco	PHG0311	用于肝细胞和神经 诱导
EVOS LED 显微镜	Invitrogen		用于 荧光成像
EZ stain 软骨细胞染色试剂盒	Himedia	CCK029-1KT	软骨染色试剂盒
FACS Canto 流式细胞仪	BD Biosciences		用于细胞表征
胎牛血清	Gibco	16000044	用于原代培养
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F2442	用于细胞培养
G5 添加剂	Gibco	17503012	用于神经诱导
HGF（肝细胞生长因子）	Sigma-Aldrich	H1404	用于肝细胞诱导
HLA-DR	Biolegend	307605
人 TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸预混液	Sigma-Aldrich	I3146	用于肝细胞诱导
ITS 预混液	Corning	354350
LDL 摄取检测试剂盒	Abcam	ab133127	用于肝细胞表征
低糖 DMEM	Gibco	11885-084	用于肝细胞诱导
MAP2 抗体	Sigma-Aldrich	M4403	用于神经表征
N2 添加剂	Gibco	17502048	用于神经诱导
神经基础培养基	Gibco	21103049	用于神经诱导
NFM 抗体	Sigma-Aldrich	N4142	用于神经表征
Nikon Elipse TS100 显微镜	Nikon		用于 荧光成像
油红 O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	脂肪染色
抑癌素 M	R&D Systems	295-OM-010/CF	用于肝细胞诱导
培养皿	Tarson	460090-90MM	用于组织切割
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	15655-100G	成骨诱导
异丙醇	Thermo Fisher	Q13827	用于油红 O 提取
丙酮酸钠溶液	Sigma life sciences	S8636-100ML
胰蛋白酶-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	用于细胞传代
Whatman 滤纸	merck	WHA1001325	滤纸
α-最低必需培养基（α-MEM）	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	原代培养用培养基
β-甘油磷酸二钠盐水合物	Sigma-Aldrich	G9422-50G