需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

牙髓干细胞的原代培养

4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65223

⸱

2023年5月5日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biophysics, PGIMER, 2Unit of Oral and Maxillofacial Surgery, Department of Oral Health Sciences, PGIMER

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文提供了利用组织块培养法建立牙髓干细胞原代培养的逐步操作指南，并依据ICSCRT指南对这些细胞进行表征。通过本方案分离获得的细胞可被视为间充质干细胞，用于后续应用。

摘要

人牙髓是一种具有优异再生能力的多能干细胞资源库，可从拔除的牙齿中获取。牙髓干细胞（DPSCs）起源于神经嵴来源的外间充质组织，具有高度可塑性，这使其在组织修复与再生中具备多重优势。目前，研究人员正在探索多种获取、维持和扩增成体干细胞的实用方法，以用于再生医学领域。本研究中，我们展示了通过组织块培养法从牙源组织建立原代间充质干细胞培养体系的过程。所分离的细胞呈纺锤形，并贴附于培养板的塑料表面。对这些干细胞的表型鉴定显示，其高表达国际细胞治疗学会（ISCT）推荐的间充质干细胞表面标志物，如CD90、CD73和CD105。此外，造血细胞标志物（CD45）和内皮细胞标志物（CD34）几乎不表达，HLA-DR标志物的表达低于2%，证实了DPSC培养物的均一性与纯度。我们进一步通过诱导其向成脂、成骨和成软骨方向分化，验证了其多向分化潜能。同时，通过添加相应的诱导刺激培养基，我们还成功诱导这些细胞分化为类肝细胞和类神经元细胞。该优化后的实验方案有助于在实验室中培养出可高度扩增的间充质干细胞群体，可用于基础研究或临床前研究。类似的方案也可整合至临床操作体系中，用于开展基于DPSC的治疗实践。

引言

成体干细胞因其可塑性、旁分泌机制和免疫调节特性，已成为细胞定向治疗和疗法中一种强大的治疗工具1,2,3干细胞相关临床前研究取得的鼓舞人心的数据，激励着研究人员致力于将研究成果从实验室推向临床应用。用于干细胞治疗的干细胞类型在治疗效果中起着至关重要的作用。在临床前和临床研究中，间充质干细胞（MSCs）最主要的来源仍是骨髓4,5。然而，主要缺点在于 使用骨髓来源的干细胞（BMSCs）存在一些局限性，包括其细胞数量稀少、分离过程具有高度侵入性以及扩增能力有限。因此，研究人员正在探索间充质干细胞（MSCs）的其他替代来源。在此背景下，牙源性组织因其易于获取、具有极强的可塑性、较高的再生潜能和强大的增殖能力，现已被认为是干细胞的一种丰富且具有潜力的替代来源。6,7,8,9,10.

牙髓干细胞（DPSCs）是 Gronthos 于 2000 年首次分离并鉴定的一类牙源性干细胞11牙髓干细胞因其高增殖率、显著的分化潜能、易于获取和培养，以及最重要的是可从废弃牙齿中获取而无需担忧伦理问题，已引起组织工程应用领域的广泛关注。12. 牙髓干细胞（DPSCs）克服了其他干细胞来源（如骨髓间充质干细胞和脂肪来源干细胞）在分离过程及自我更新能力方面的局限性13人类DPSCs可来源于人类的乳牙、恒牙、智齿、脱落的乳牙（SHEDs）以及根尖乳头。此外，DPSCs也可从通常被丢弃的额外牙中分离获得14DPSCs 表达神经嵴相关标志物，并具有分化为神经元细胞的潜能 体外 和 体内15除了具有神经源性潜能外，在特定诱导条件下，牙髓干细胞（DPSCs）还可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞和肌细胞等其他细胞谱系。13因此，这些多能细胞在细胞治疗领域具有广阔的应用前景，可用于多种组织的再生。研究还报道了牙髓干细胞（DPSCs）在角膜重建中的潜在作用。16心肌梗死的修复17及其在肢体缺血等疾病中的潜在治疗作用18，阿尔茨海默病 19帕金森病 20，以及衰老21因此，牙源性干细胞不仅可用于牙齿再生，还可用于眼睛等非牙源性器官的修复与再生16心脏17肝脏22，骨骼23 等等。

从牙髓组织中分离MSC群体有两种特定方法—— 酶消化法和组织块培养法24,25。已有报道称，这两种方法均能成功建立原代培养，且在DPSC的数量和特性方面无显著差异26。本研究重点采用组织块法分离DPSCs27，因为与酶消化法相比，该方法获得的DPSCs不会受到造血细胞和内皮细胞的污染，而酶消化法可能导致成纤维细胞污染28。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究中所述所有操作均经昌迪加尔PGIMER机构伦理委员会（IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72）批准。所有与细胞培养相关的实验均需在II级生物安全柜（BSC）中按照无菌技术进行。牙髓组织来自三名因正畸需要拔除第三磨牙的健康患者（女性/14岁、男性/14岁和男性/20岁）。在样本采集前，已根据昌迪加尔PGIMER伦理委员会提供的指南，获得患者/监护人签署的书面知情同意书。

1. 从人牙组织建立牙髓干细胞（DPSCs）的原代培养

注意：任何龋坏的牙齿均不应使用。

  1. 牙髓样本的采集及运输至组织培养实验室
    1. 在无创且无菌的条件下进行牙齿拔除手术。用无菌生理盐水彻底冲洗拔除的牙齿，以去除残留血液。
    2. 使用碳化钨裂钻在持续无菌生理盐水冲洗条件下，将拔除的牙齿纵向切割为两部分，以暴露牙髓组织。
    3. 将带有完整牙髓的拔牙样本置于冰上保存的无菌α-最低必需培养基（α-MEM）中，运送至细胞与组织培养实验室。
      ​注意：理想情况下，所有样本应在2小时内进行细胞培养处理。然而，最近有报道称，即使在24小时后处理牙齿样本，也不会影响牙髓干细胞（DPSCs）的存活率和增殖能力，但会降低其功能活性29。

2. 牙齿牙髓组织的去除及牙髓干细胞（DPSCs）的细胞培养（耗时：60–120 分钟）

注意：牙齿转运后的所有步骤均在生物安全二级柜内的细胞与组织培养实验室中进行。

  1. 将牙样本置于无菌培养皿中，用1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）充分冲洗（三至四次）。
  2. 使用锐利的挖匙和镊子小心地将牙髓腔内的牙髓组织去除。
  3. 去除牙髓后，用无菌 PBS 彻底清洗，以去除任何残留的血液。
  4. 用手术刀在培养皿中将牙髓组织切成约2-3 mm的小块。
    1. 将培养皿的表面积用无菌 PBS 分成四个区域，每个区域加入 1–2 mL 无菌 PBS。将牙髓组织样本放入其中一个含 PBS 的区域，并用手术刀将其切割成尽可能小的组织块（组织块越小，干细胞越容易从组织中迁移出来）。随后，将组织块逐块转移至下一个含 PBS 的区域，依次转移直至第四区，以充分洗涤组织块，去除任何污染物。
  5. 同时，向6孔板的各孔中加入约0.8–1 mL含有非必需氨基酸、10%胎牛血清（FBS）以及抗生素混合物（如青霉素和链霉素）的α-MEM培养基。通过轻轻晃动培养板使培养基均匀分布，覆盖孔底表面。
  6. 用镊子将小块果肉组织或外植体接种至6孔板的单个孔中（每孔4至6块），并在生物安全柜中静置5分钟，期间避免移动培养板。
    注意：此步骤有助于组织/外植体黏附于经处理的培养板表面。
  7. 在37 °C、5% CO₂的湿润环境中培养培养板2 水平.
  8. 第二天，小心吸去孔中的培养基，注意不要扰动组织块，然后加入新鲜培养基。此阶段每隔一天更换一次培养基，以防止干燥。确保培养箱托盘中有足够的水，以免过度蒸发导致孔板中的培养基干涸。
    ​注意：此步骤极为关键，任何扰动都可能导致外植块从原位置脱落。若在换液过程中外植块发生移位，可尝试完全移除培养基，使外植块重新贴附于孔板表面。添加培养基时应沿孔壁缓慢加入，避免直接冲击外植块，否则可能导致其再次脱落。定期在倒置显微镜下（4x 或 10x 放大倍数）观察细胞培养板。通过细胞对塑料表面的贴壁能力及其梭形形态来鉴定牙髓干细胞（DPSCs）。
  9. 一旦有足够数量的细胞从组织块迁移出来，移除组织块，并让细胞增殖，直至达到最佳的70%-75%汇合度，然后进行传代。此步骤中，可将含10% FBS的α-MEM体积增加至2 mL，以促进细胞更快分裂。在此阶段，每三天更换一次培养基。

3. DPSC 扩增

  1. 用 PBS（10 mL）清洗一次汇合度为 70%–80% 的 DPSCs T75 培养瓶，重复洗涤两次。
  2. 沿 T75 培养瓶壁加入 2.5 mL 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），轻轻旋转培养瓶，确保胰蛋白酶-EDTA 完全覆盖 DPSCs 的细胞层或单层细胞。
  3. 将培养瓶置于 37 °C 培养箱内的超净台中孵育 3–5 分钟。3 分钟后，轻敲培养瓶以促进细胞解离。
  4. 加入 5 mL 完全培养基（含 10% FBS 的 α-MEM）或 250 µL FBS（相当于所用胰蛋白酶体积的 10%）作为中和剂，以终止胰蛋白酶活性。将解离后的全部细胞悬液转移至一个新的 15 mL 圆锥形离心管中。
  5. 在室温下以 500 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。
  6. 用移液器吸除所有上清液，向培养瓶中加入 5–10 mL PBS 收集残留细胞，通过轻柔吹打将细胞重悬于 PBS 中，再次以 500 × g 离心 2 分钟。必要时可重复此步骤。
  7. 小心吸除上清液后，用 1 mL 完全培养基（含 10% FBS 的 α-MEM）重悬细胞沉淀，并通过轻柔吹打获得单细胞悬液。
  8. 将细胞按等体积分种至两个 T75 培养瓶中，每个培养瓶加入 10 mL 完全培养基。将培养瓶置于 37 °C 超净台内培养。
  9. 次日，吸除旧培养基，更换为新鲜完全培养基。
    注意：胰蛋白酶消化时间过长可能通过切割细胞表面蛋白和细胞外基质蛋白，影响细胞完整性、活力及功能。

4. 干细胞表型标志物的鉴定（时间：90 - 120 分钟）

注意：对从牙髓组织中收获的细胞进行表征时，应使用第3至第5代之间的细胞。

  1. 取两瓶70%-80%融合度的牙髓干细胞（DPSCs）培养瓶（每瓶约含3-4 × 106个细胞；使用基于图像的细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数），每瓶用10 mL PBS洗涤细胞两次。
  2. 每瓶加入2.5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养瓶置于37 °C培养箱中孵育3-5分钟。随后加入5 mL完全培养基或250 µL胎牛血清（FBS，体积为所用胰蛋白酶体积的10%）以中和胰蛋白酶活性。
  3. 用移液器将细胞收集至15 mL锥形离心管中，在室温下以500 × g离心2分钟，使细胞沉淀。
  4. 用移液器吸除全部上清液，向原培养瓶中加入5 mL PBS以收集残留细胞，轻轻吹打使细胞重悬于PBS中，再次以500 × g离心2分钟。
  5. 小心吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中，并通过轻柔吹打获得单细胞悬液。
  6. 根据设备可用情况，使用基于图像的细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数，将细胞分装至微量离心管中，每管1 × 104个细胞。用0.5%-1%牛血清白蛋白（BSA）溶液在37 °C孵育0.5-1小时。
  7. 向每管中加入1-2 µL异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）标记的分化簇（CD）表面标志物抗体（即CD90 [0.4 µg]、CD73 [0.8 µg]、CD105 [0.4 µg]、CD34 [0.8 µg]、CD45 [0.4 µg]和HLA-DR [0.08 µg]）6,7,8,9，避光、室温孵育0.5小时。
  8. 孵育0.5小时后，在500 × g条件下离心5分钟使细胞沉淀。吸除上清液，用PBS重悬细胞沉淀并洗涤，再次离心。
  9. 离心后，将细胞沉淀重悬于PBS中（每管200 µL），转移至流式细胞仪专用管中，使用流式细胞仪进行检测。可采用任何商业软件进一步分析各抗体阳性细胞的百分比。
    ​注意：步骤4.7至4.9需在避光、室温条件下操作。应设置适当的同型对照和未染色样本，以排除细胞自身荧光背景干扰。

5. DPSC向多谱系分化

注意：用于多向分化潜能鉴定的牙髓干细胞（DPSCs）应选用第3至第5代、融合度为75%-80%的细胞培养物。所有下述类型的诱导分化实验均应设置含α-MEM的对照细胞组。

  1. 牙髓干细胞成骨分化、茜素红染色及定量分析
    1. 使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 制备单细胞悬液，方法如上文步骤 4.2 所述，并将细胞沉淀重悬于完全 α-MEM 培养基中。
    2. 计数细胞，并以 2 × 104 个细胞/孔的密度将细胞接种至 24 孔组织培养板中，每孔加入 0.4–0.5 mL 完全培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下培养 48 小时。
    3. 48 小时后，吸除各孔中的培养基，每孔加入 0.4–0.5 mL 成骨诱导培养基（即含成骨诱导因子的 α-MEM，如 β-甘油磷酸钠 [5 mM]、磷酸二氢钾 [1.8 mM] 和地塞米松磷酸钠 [0.01 mM]）8。设置对照孔（未诱导细胞），仅含完全 α-MEM，不含任何成骨诱导因子（对照培养基）。
      注意：已有报道添加 50 µM 抗坏血酸可增强成骨分化能力30,31。每隔三天更换一次诱导培养基和对照培养基，持续培养 21 天（3 周）。诱导期结束后，吸除培养板中的培养基，加入 0.5 mL PBS，洗涤两次。
    4. PBS 洗涤后，在室温下用 0.5 mL 10% 中性缓冲甲醛（NBF）溶液固定细胞 20–30 分钟。固定操作需在通风橱或化学安全柜中进行。
  2. 茜素红染色
    1. 通过将 1 g 茜素红 S 溶于 50 mL 双蒸水（ddH2O）中配制 2% 茜素红 S 染液，并用盐酸（HCl）或氨水（NH4OH）调节 pH 至 4.0–4.2。用滤纸过滤染液，并避光保存于 4 °C。
    2. 用双蒸水（ddH2O）洗涤细胞两次，加入茜素红 S 染液，在室温下孵育 30–45 分钟。
    3. 吸除各孔中的染液，用 ddH2O 洗涤细胞四至五次，以去除未结合的染料。使用明场显微镜拍摄图像。
  3. 茜素红染色提取用于定量分析
    1. 向染色后的孔中加入十六烷基吡啶氯化物（CPC）缓冲液（pH 7.0），每孔 0.4 mL，在 37 °C 下孵育 2 小时。此外，也可使用 10% 乙酸孵育细胞，以充分溶解茜素红结晶32。将培养板置于板式摇床或振荡器上震荡。
    2. 孵育结束后，收集上清液（提取的染料），转移至 96 孔板中，在 405 nm 波长下读取吸光度。为获得空白值，仅加入相同体积的 CPC 缓冲液并测定读数32,33。

6. DPSCs 的成脂分化、油红 O 染色及定量分析

注意：铺板的初始步骤与上述相同（即成骨分化步骤 5.1）。

  1. 48 小时后，吸出孔中的培养基，加入 0.4–0.5 mL 脂肪诱导培养基（例如含脂肪诱导因子的 α-MEM，如异丁基甲基黄嘌呤 [IBMX；0.5 mM]、地塞米松 [1 µM]、吲哚美辛 [200 µM] 和胰岛素 [10 µM]）8。设置对照孔，培养未诱导细胞（即仅在不含诱导因子的 α-MEM 中培养 [对照培养基]）。
  2. 每隔三天更换一次培养基，继续培养细胞 3 周。3 周后，吸出培养板中的培养基，加入 0.5 mL PBS 洗涤细胞两次。
  3. PBS 洗涤后，在室温下用 10% 中性缓冲福尔马林溶液（NBF）固定细胞 20–30 分钟。
  4. 用双蒸水（ddH2O）洗涤细胞两次，加入油红 O 染液，在室温下孵育 30–40 分钟。
  5. 吸出各孔中的染液，用 ddH2O 反复冲洗细胞孔，直至冲洗液澄清（2 至 4 次）。在显微镜下观察并采集图像。
  6. 油红 O 染色定量分析提取步骤
    1. 向染色后的孔中加入 0.4 mL 100% 异丙醇，盖好培养板，在室温下孵育 30 分钟。将培养板置于摇床或振荡器上轻轻振荡。
    2. 孵育结束后，收集上清液，转移至 96 孔板中，在 510 nm 波长处读取吸光度。以 100% 异丙醇作为空白对照。

7. DPSCs 的软骨向分化、阿利新蓝染色及定量分析

注意：在 DPSCs 的单层培养中诱导软骨形成分化。接种的初始步骤与上述相同（即成骨分化步骤 5.1）。

  1. 48 小时后，吸出孔板中的培养基，加入 0.4–0.5 mL 软骨诱导培养基（例如含软骨分化特异性诱导因子的 α-MEM，抗坏血酸 [0.2 M]、丙酮酸钠 [1 mM]、转化生长因子-β3 [TGF-β3；10 µM]、地塞米松 [1 mM] 和 1× ITS 预混液 [胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸]）10。设置未诱导细胞的对照孔（即仅在不含诱导因子的 α-MEM 中培养 [对照培养基]）。
  2. 每隔三天更换一次培养基，持续培养细胞 3 周。诱导期结束后，吸去培养板中的培养基，加入 0.5 mL PBS 洗涤细胞两次。
  3. PBS 洗涤后，在室温下用 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）溶液固定细胞 15–20 分钟。用双蒸水（ddH2O）洗涤细胞两至三次，加入阿利新蓝染液，室温孵育 45 分钟。
  4. 从所有孔中移除染液，随后用 0.1 N HCl 漂洗两至三次，再用 ddH2O 洗涤四至五次。
  5. 在显微镜下观察细胞中蛋白聚糖的沉积情况（呈蓝色），并采集图像。
  6. 进行阿利新蓝染色定量时，使用 6 M 盐酸胍提取染料，并在 595 nm 处测定样品的光密度（OD）。本研究使用的阿利新蓝试剂盒可对软骨组织中的酸性蛋白聚糖染色，特别结合存在于软骨细胞基质中的硫酸化糖胺聚糖（GAGs）10。

8. 牙髓干细胞向肝样细胞谱系的分化及鉴定

  1. 按照上述方法通过胰蛋白酶处理制备单细胞悬液，并将细胞沉淀重悬于完全α-MEM培养基中。
  2. 计数细胞后，以每孔2 × 104个细胞的密度接种于24孔细胞培养板中，每孔加入0.4–0.5 mL完全培养基，培养48小时。
  3. 48小时后，吸除孔内培养基，加入肝向诱导培养基，继续培养14天。诱导培养基为低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），其中含有地塞米松（0.5 µM）、表皮生长因子（EGF；2 ng/mL）、ITS+预混液（50 mg/mL）以及肝细胞生长因子（HGF；20 ng/mL）6。
  4. 14天后，更换为成熟培养基继续培养14天（α-MEM培养基中添加Oncostatin M [OSM；20 ng/mL]、ITS预混液 [50 mg/mL] 和地塞米松 [0.5 µM]）6。每隔三天更换一次新鲜培养基。
  5. 进行免疫组织化学分析和低密度脂蛋白（LDL）摄取实验，以确认肝样细胞的分化。
    1. LDL摄取及低密度脂蛋白受体免疫荧光染色
      注：分化后的肝样细胞使用LDL摄取检测试剂盒进行表征，具体操作按照试剂盒说明书进行。使用LDL-550荧光染料在活细胞状态下检测分化细胞的LDL摄取能力，使用LDL受体抗体检测固定后分化细胞中的LDL受体表达。
      1. 细胞分化完成后，用LDL-550（1:100稀释）对活细胞染色3–4小时。染色结束后，更换为培养基，使用能够激发和发射碘化丙啶（PI）波长（分别为537 nm和617 nm）的荧光显微镜观察LDL摄取情况。
      2. 用固定液固定细胞10分钟。固定后，用封闭液封闭细胞30分钟。
      3. 加入一抗（LDL受体抗体）孵育1小时，用1× PBS洗涤三次，然后避光加入二抗（488标记，1:100稀释）孵育1小时。
      4. 用PBS洗涤细胞三次，以去除未结合的二抗。加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色。
      5. 在荧光显微镜下观察细胞，并使用可检测DAPI、PI和FITC激发/发射波长范围的荧光显微镜采集图像。
        ​注：可通过记录单个细胞的荧光强度参数来定量分析LDL受体抗体表达水平和LDL摄取能力。免疫荧光染色实验中应设置适当的二抗对照，以排除仅由二抗引起的背景荧光。

9. 牙髓干细胞向神经元样谱系的神经分化及鉴定

  1. 按照上述方法接种细胞后，在 α-MEM 培养基中培养细胞 48 小时。
  2. 吸除培养基，更换为含有生长因子的神经基础培养基（neurobasal media），生长因子包括 0.5% G5 补充剂、0.2% N2 补充剂、20 ng/mL 表皮生长因子（epidermal growth factor）、20 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor）以及 1% B27 补充剂。将细胞在此培养基中继续培养 25–41 天7。
  3. 根据细胞对培养基的代谢情况，每隔两天或三天更换一次培养基。为获得高效的神经元成熟及更多微管相关蛋白-2（MAP-2+）神经元，在神经元诱导阶段（14 天）后去除表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子 2（FGF2）。
    注意：随着时间推移及多次换液，分化后的神经元可能因贴壁能力较弱而从培养板孔中脱落，导致长期培养过程中神经元丢失。为避免此现象，可选择用层粘连蛋白（laminin）或纤维连接蛋白（fibronectin）包被培养板孔（可选）。
  4. 进行免疫组织化学分析以确认神经元样分化。
    1. 分化后 DPSCs 的免疫染色
      注意：为确认 DPSCs 的神经元样分化，对分化后的细胞使用微管相关蛋白-2（MAP-2）和神经丝中分子（neurofilament, NFM）抗体进行免疫细胞化学染色，这两种蛋白为神经源性谱系特异性蛋白7。
      1. 分化完成后，移除培养基，加入 PBS，轻轻晃动培养板，然后用移液器吸除 PBS。重复该步骤一次。
      2. 使用 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）或 4% 多聚甲醛在室温下固定细胞 20–30 分钟。
      3. 移除固定液，用 1× PBS 洗涤细胞两到三次。加入通透液（0.1% Triton-X-100），室温孵育 5 分钟。
      4. 用 PBS 洗涤两到三次，然后加入 0.5%–1% 封闭剂（BSA）在 37 °C 封闭 1 小时，或在 4 °C 过夜。移除封闭剂后，用 1× PBS 洗涤细胞。
      5. 加入用 0.1% BSA 配制的一抗溶液（NFM 抗体稀释比为 1:50，MAP-2 抗体稀释比为 1:200），4°C 孵育过夜。
      6. 移除一抗，用 1× PBS 洗涤三到四次，以去除未结合的一抗。
      7. 加入二抗（兔抗小鼠，1:2,000），室温避光孵育 1.5–2 小时。用 PBS 洗涤两到三次。
      8. 加入 DAPI 染色 10 分钟，再次用 PBS 洗涤。保留少量液体以防止样品干燥。在荧光显微镜下观察。
        注意：此外，还可进行核型稳定性10和衰老特征分析，以更全面地评估细胞的纯度和功能状态。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在此，我们介绍研究人员如何建立牙髓干细胞（DPSCs）的纯培养体系 通过 外植体法6,7,8,9,10 并诱导其向多个谱系分化，以确定培养物的纯度，用于后续应用。

我们建立了源自患者第三磨牙牙髓小块组织的牙髓干细胞（DPSCs）原代培养，如图所示 图1A最初，在组织块接种后的第四和第五天，仅在组织块或组织周围观察到极少数的圆形细胞。然而，到第12天th 天，从组织块中迁移出的细胞数量增加，至第二周末（14th-16th 第几天时，大部分外植块周围已出现大量具有纺锤形形态的贴壁细胞。此时可将外植块从培养板中移除，继续在完...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

干细胞因其可塑性、强健性、免疫调节特性、旁分泌机制和归巢效率，被寄予治愈多种疾病的厚望。牙髓组织被认为是干细胞最有效且最有价值的来源，具有显著的可塑性和再生能力。本文中，我们展示了利用广泛采用的组织块培养法分离牙髓干细胞（DPSCs）的方法，其中细胞从牙髓组织碎片或组织块中迁移出来，生长为形态上类似纺锤形成纤维细胞样细胞的均一细胞培养物。组织块法能够获得更均一的DPSCs培养物，避免了内皮细胞和周细胞等其他细胞类型的残留，而这些细胞在酶消化法建立DPSCs培养过程中仍会存在34。我们证明，通过组织块法获得的DPSCs表达国际细胞治疗学会（ISCT）推荐的间充质细胞表面CD标志物，如CD90、CD73和CD105；同时不表达CD45、CD34和HLA-DR标志物，表明DPSCs培养物具有较高的均一性和纯度。HLA-DR的缺失也使其适用于移植用途，排斥反应的可能性极低。本实验方案中有若干关键步骤，以确保DPSCs培养的效率和纯度：组织块在放入培养板前应至少用PBS洗涤四次，以避免任何可能的污染；组织块必须牢固贴附于培养孔表面，因为脱落的组织块不会产生细胞。因此...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何财务或非财务利益冲突。

致谢

我们感谢印度政府卫生研究部（DHR）、印度医学研究理事会（ICMR）对AK的资助支持（DHR-NRI项目编号：R.12015/01/2022-HR）。SR获得了印度政府ICMR的资助（项目编号：2020-7593/SCR-BMS），PS获得了印度政府科学与工业研究理事会（CSIR）的奖学金资助。我们还感谢Sandhya Tokhi女士和Bhupinder Kaur女士在流式细胞术方面的协助，以及中央高级仪器中心（CSIC）和昌迪加尔PGIMER提供的基础设施支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6 孔细胞培养板Costar3516用于细胞培养
阿利新蓝染色液EZstain 软骨细胞染色试剂盒，HiMediaCCK029
茜素红 S 染色液Sigma-AldrichTMS-008成骨染色
抗生素混合液HimediaA002-5X50ML防止培养污染
抗坏血酸HimediaTC094-25G软骨诱导
B27 添加剂Gibco17504044用于神经诱导
bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）GibcoPHG0024用于神经诱导
CD 105BD-Pharmingen560839
CD 35Biolegend343604
CD 45Biolegend304006
CD 73Biolegend344016
CD 90Biolegend328107表征分析
十六烷基吡啶氯化物（CPC）Sigma-Aldrich1104006用于茜素红提取
地塞米松 21-磷酸二钠Sigma-AldrichD1159-100MG
杜氏磷酸盐缓冲液HimediaTS1006-5L用于洗涤
EGF（表皮生长因子）GibcoPHG0311用于肝细胞和神经 诱导
EVOS LED 显微镜Invitrogen用于 荧光成像
EZ stain 软骨细胞染色试剂盒HimediaCCK029-1KT软骨染色试剂盒
FACS Canto 流式细胞仪BD Biosciences用于细胞表征
胎牛血清Gibco16000044用于原代培养
胎牛血清Sigma-AldrichF2442用于细胞培养
G5 添加剂Gibco17503012用于神经诱导
HGF（肝细胞生长因子）Sigma-AldrichH1404用于肝细胞诱导
HLA-DRBiolegend307605
 人 TGF-β3Peprotech#100-36E-10U
胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸预混液Sigma-AldrichI3146用于肝细胞诱导
ITS 预混液Corning354350
LDL 摄取检测试剂盒Abcamab133127用于肝细胞表征
低糖 DMEMGibco11885-084用于肝细胞诱导
MAP2 抗体Sigma-AldrichM4403用于神经表征
N2 添加剂Gibco17502048用于神经诱导
神经基础培养基Gibco21103049用于神经诱导
NFM 抗体Sigma-AldrichN4142用于神经表征
Nikon Elipse TS100 显微镜Nikon用于 荧光成像
油红 OSigma-Aldrich01391-250Ml脂肪染色
抑癌素 MR&D Systems295-OM-010/CF用于肝细胞诱导
培养皿Tarson460090-90MM用于组织切割
磷酸二氢钾Sigma-Aldrich15655-100G成骨诱导
异丙醇Thermo FisherQ13827用于油红 O 提取
丙酮酸钠溶液Sigma life sciencesS8636-100ML
胰蛋白酶-EDTASigma-AldrichT4049用于细胞传代
Whatman 滤纸merckWHA1001325滤纸
α-最低必需培养基（α-MEM）Sigma-AldrichM0643-10X 1L原代培养用培养基
β-甘油磷酸二钠盐水合物Sigma-AldrichG9422-50G

参考文献

  1. Bhattacharyya, S., Kumar, A., Lal Khanduja, K. The voyage of stem cell toward terminal differentiation: a brief overview. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 44 (6), 463-475 (2012).
  2. Prentice, D. A. Adult stem cells. Circulation Research. 124 (6), 837-839 (2019).
  3. Raik, S., Kumar, A., Bhattacharyya, S. Insights into cell-free therapeutic approach: Role of stem cell "soup-ernatant". Biotechnology and Applied Biochemistry. 65 (2), 104-118 (2018).
  4. Rodriguez-Fuentes, D. E., et al. Mesenchymal stem cells current clinical applications: a systematic review. Archives of Medical Research. 52 (1), 93-101 (2021).
  5. Yamazaki, K., Kawabori, M., Seki, T., Houkin, K. Clinical trials of stem cell treatment for spinal cord injury. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3994(2020).
  6. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific Reports. 7 (1), 15015(2017).
  7. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
  8. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome proteins regulate comparative osteogenic and adipogenic potential in bone marrow and dental stem cells. Biochimie. 155, 129-139 (2018).
  9. Kumar, A., Bhattacharyya, S., Rattan, V. Effect of uncontrolled freezing on biological characteristics of human dental pulp stem cells. Cell Tissue Bank. 16 (4), 513-522 (2015).
  10. Raik, S., et al. Assessment of post-thaw quality of dental mesenchymal stromal cells after long-term cryopreservation by uncontrolled freezing. Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (2), 728-743 (2020).
  11. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  12. Tsutsui, T. W. Dental pulp stem cells: advances to applications. Stem Cells and Cloning. 13, 33-42 (2020).
  13. Huang, G. T. -J., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  14. La Noce, M., et al. Dental pulp stem cells: state of the art and suggestions for a true translation of research into therapy. Journal of Dentistry. 42 (7), 761-768 (2014).
  15. Xiao, L., Tsutsui, T. Characterization of human dental pulp cells-derived spheroids in serum-free medium: stem cells in the core. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2624-2636 (2013).
  16. Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).
  17. Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26 (3), 638-645 (2008).
  18. Yong, Z., et al. Comparison of the angiogenic ability between SHED and DPSC in a mice model with critical limb ischemic. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (4), 861-870 (2022).
  19. Zhang, X. M., et al. Therapeutic potential of dental pulp stem cell transplantation in a rat model of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 16 (5), 893-898 (2021).
  20. Kabir, R., et al. Imperative role of dental pulp stem cells in regenerative therapies: a systematic review. Nigerian Journal of Surgery. 20 (1), 1-8 (2014).
  21. Kumar, A., et al. Dental pulp stem cell secretome ameliorates d-galactose induced accelerated aging in rat model. Cell Biochemistry and Function. 40 (5), 535-545 (2022).
  22. Hirata, M., et al. Multifaceted therapeutic benefits of factors derived from dental pulp stem cells for mouse liver fibrosis. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1416-1424 (2016).
  23. Fujii, Y., et al. regeneration by human dental pulp stem cells using a helioxanthin derivative and cell-sheet technology. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 24(2018).
  24. Ferrua, C. P., et al. How has dental pulp stem cells isolation been conducted? A scoping review. Brazilian Oral Research. 31, e87(2017).
  25. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica. 65 (3), 124-133 (2019).
  26. Tatullo, M., Marrelli, M., Shakesheff, K. M., White, L. J. Dental pulp stem cells: function, isolation and applications in regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 1205-1216 (2015).
  27. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  28. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Proliferation. 50 (2), e12334(2017).
  29. Aryal Ac, S., Islam, M. S., Samsudin, A. R. Investigation of the effect of a time delay on the characteristics and survival of dental pulp stem cells from extracted teeth. Archives of Oral Biology. 119, 104896(2020).
  30. Langenbach, F., Handschel, J. Effects of dexamethasone, ascorbic acid and β-glycerophosphate on the osteogenic differentiation of stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 117(2013).
  31. Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 64 (2), 295-312 (1997).
  32. Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. Optimization of the alizarin red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts. International Journal of Molecular Sciences. 24 (1), 723(2022).
  33. Coe, C. L., Lubach, G. R., Schneider, M. L., Dierschke, D. J., Ershler, W. B. Early rearing conditions alter immune responses in the developing infant primate. Pediatrics. 90, 505-509 (1992).
  34. Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcified Tissue International. 88 (2), 130-141 (2011).
  35. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 26 (7), 1787-1795 (2008).
  36. Kim, B. C., et al. Osteoblastic/cementoblastic and neural differentiation of dental stem cells and their applications to tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 235-244 (2012).
  37. Ge, J., et al. Distal C terminus of CaV1.2 channels plays a crucial role in the neural differentiation of dental pulp stem cells. PLoS One. 8 (11), e81332(2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

原代细胞培养组织块培养法间充质干细胞干细胞分化组织再生细胞表面标志物三维培养技术下一代测序颅面重建
牙髓干细胞的原代培养
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。