在本研究中，我们详细描述了脱细胞化、物理表征、成像以及 体内 植物源性生物材料的植入，以及细胞在支架上的接种与分化方法。所述方法可用于评估植物源性生物材料在骨组织工程中的应用。
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摘要
摘要
植物来源的 纤维素生物材料已被应用于多种组织工程领域。体内研究表明，来源于天然材料的纤维素支架具有显著的生物相容性。此外，这些支架具有适用于多种组织的结构特征，并能促进哺乳动物细胞的侵入和增殖。最近利用脱细胞化苹果花托组织的研究表明，其孔径大小与松质骨相似， 并能有效支持成骨分化。本研究进一步 探讨了苹果来源纤维素支架在骨组织工程（BTE）应用中的潜力，并评估了其体外和体内的力学性能。将MC3T3-E1前成骨细胞接种于苹果来源的纤维素支架中，随后 评估其成骨潜能及力学性能。碱性磷酸酶和茜素红S染色证实，在成骨诱导培养基中培养的支架中发生了成骨分化。组织学检查显示细胞广泛侵入并出现支架内的矿化现象。扫描电子显微镜（SEM）观察到支架表面存在矿物聚集体， 能量色散X射线光谱（EDS） 进一步确认了磷酸根和钙元素的存在。然而，尽管细胞分化后杨氏模量显著增加，但仍低于健康骨组织的水平。体内研究显示，在大鼠颅骨植入8周后，脱细胞化的苹果来源 支架中出现了细胞浸润及细胞外基质的沉积。此外，将支架从骨缺损处移除所需的力与先前报道的天然颅骨骨折载荷相近。总体而言，本研究证实苹果来源的纤维素是骨组织工程应用中一种具有前景的候选材料。然而，其力学性能与健康骨组织之间的差异可能限制其仅适用于低负荷承载场景。为进一步提升苹果来源纤维素支架在承重应用中的力学性能，可能需要进行额外的结构再设计与优化。
引言
由损伤或疾病引起的大型骨缺损通常需要生物材料移植来实现完全再生1。目前旨在改善骨组织再生的技术通常采用自体、同种异体、异种或合成移植材料2。自体骨移植被认为是修复大型骨缺损的 "金标准"移植方法，其骨组织来源于患者自身。然而，这种移植手术存在多种局限性，包括骨块尺寸与形状受限、组织来源有限以及取骨部位的并发症3。此外，自体移植手术易发生手术部位感染、继发性骨折、取骨或重建部位血肿形成以及术后疼痛4。 骨组织工程 （BTE）为传统骨移植方法提供了一种潜在的替代方案5。该技术结合结构化生物材料与细胞，以构建新的功能性骨组织。在设计用于骨组织工程的生物材料时，关键在于整合大孔结构、促进细胞黏附的表面化学特性以及与天然骨组织相近的力学性能6。以往研究表明，用于骨组织工程的生物材料其理想孔径和弹性模量分别约为100–200 µm7和0.1–20 GPa，具体数值取决于移植部位8。此外，支架的孔隙率及孔间连通性是影响细胞迁移、营养物质扩散和血管生成的关键因素8。
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方案
实验方案已通过渥太华大学动物护理委员会的审查和批准。
1. 支架制备
- 使用切片机将麦克金托什苹果（Canada Fancy）切成8 mm厚的片状，并将苹果片的花托组织切成5 mm × 5 mm的方块。
- 将方形样品置于0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）中处理2天。
- 用去离子水清洗脱细胞样品，并在100 mM CaCl2 中室温（RT）孵育过夜，以去除残留的表面活性剂。
- 将样品（即支架）在70%乙醇中灭菌30分钟，用去离子水洗涤后，置于24孔细胞培养板中，待接种细胞。
2. 细胞培养与支架接种
- 在细胞培养条件（37°C，95% 空气和 5% CO2 的湿润环境）下，将 MC3T3-E1 Subclone 4 细胞培养于直径为 10 cm 的细胞培养处理培养皿中。
- 制备细胞培养基，成分为添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的 Eagle 最低必需培养基-α 改良型 （α-MEM）。
- 当细胞融合度达到 80% 时，使用胰蛋白酶消化法（0.05% 胰蛋白酶-EDTA）将细胞从培养皿上解离。
- 将细胞悬液在....
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结果
孔径测量、细胞分布和 体外 矿化图1 和 图2)
经SDS和CaCl处理后，实现了苹果组织支架中天然细胞成分的完全去除2 (图1A）。支架呈现出高度多孔的结构，经共聚焦显微镜确认。图像定量分析显示平均孔径为 154 µm ± 40 µm孔径分布范围在 73 µm 和 288 µm然而，大多数孔径范围在 100 µm 和 200 µm (图1C).
在分化培养基中培养4周后，接种细胞的支架显示出广泛的白色矿物质沉积（图1A）。含有细胞的支架呈现不透明的白色，提示发生了矿化，而空白支架（未接种细胞的支架）则未观察到此现象。此外，共聚焦激光扫描显微镜分析显示，细胞在支架内呈均匀分布（
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讨论
若干 体外 和 体内 研究表明，植物来源的纤维素具有良好的生物相容性，并在组织工程中具有应用潜力14,15,16,18,19,20，更具体地说，用于支持成骨分化20,21本研究的目的是进一步探讨苹果来源的纤维素支架在骨组织工程（BTE）中的潜力，并评估这些支架的力学性能 体外 和 体内.
对于 体外 研究中，在去除苹果组织中的天然细胞后，将前成骨细胞（MC3T3-E1）接种于支.......
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披露
利益冲突声明：M.L.L、M.T、R.J.H.、C.M.C.、I.C. 和 A.P. 是由渥太华大学和 Spiderwort 公司提交的专利申请的发明人，这些专利申请涉及植物来源的纤维素在骨组织工程（BTE）中的应用。 M.L.L.、R.J.H.、C.M.C. 和 A.P. 在 Spiderwort 公司拥有经济利益。
致谢
本项目获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）（发现基金）和李嘉诚基金会的资助。M.L.L. 获得了安大略省卓越中心TalentEdge项目的支持，R.J.H. 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会研究生奖学金和安大略省研究生奖学金（OGS）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 | ThermoFisher | D1306 | DAPI |
| 茜素红 S | Sigma-Aldrich | A5533 | ARS |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4403 | 细胞培养 |
| 氯化钙 | ThermoFisher | AA12316 | CaCl2 |
| 卡乐氟白 | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| 牙科钻头 | 手术工具 | ||
| 乙醇 | ThermoFisher | 615095000 | |
| 胎牛血清 | Hyclone Laboratories | SH30396 | FBS |
| 福尔马林 | Sigma-Aldrich | HT501128 | 10% 福尔马林 |
| 戈德纳三色染色液 | Sigma-Aldrich | 1.00485 | GTC |
| 苏木精-伊红染色液 | Fisher Scientific | NC1470670 | H&E |
| 高速共振共聚焦激光扫描显微镜 | Nikon | Nikon Ti-E A1-R | |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | ||
| 灌洗用生理盐水 | Baxter | JF7123 | 0.9% NaCl |
| MC3T3-E1 Subclone 4 细胞 | ATCC | CRL-2593 | 前成骨细胞 |
| 麦克金托什苹果 | 加拿大特级品 | ||
| 甲基丙烯酸甲酯 | Sigma-Aldrich | M55909 | 组织学包埋 |
| 最低必需培养基 | ThermoFisher | M0894 | α-MEM |
| 多聚甲醛 | Fisher Scientific | O4042 | 4%；PFA |
| 青霉素/链霉素 | Hyclone Laboratories | SV30010 | 细胞培养 |
| 过碘酸 | Sigma-Aldrich | 375810 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Hyclone Laboratories | 2810305 | PBS；不含 Ca2+ 和 Mg2+ |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | p3566 | |
| 扫描电子显微镜 | JEOL | JSM-7500F FESEM | SEM 和 EDS |
| 切片扫描显微镜 | Zeiss | AXIOVERT 40 CFL | |
| 十二烷基硫酸钠 | Fisher Scientific | BP166 | SDS |
| 亚硫酸氢钠 | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| 磷酸钠 | ThermoFisher | BP329 | |
| Sprague-Dawley 大鼠 | Charles-River Laboratories | 400 | 雄性 |
| 缝合线 | Ethicon | J494G | 4-0 |
| 环钻 | ACE Surgical Supply Co | 583-0182 | 5 mm 直径 |
| 曲拉通 X-100 | ThermoFisher | 807423 | |
| 胰蛋白酶 | Hyclone Laboratories | SH30236.02 | 细胞培养 |
| 吐温 | Fisher Scientific | BP337 | |
| 通用压缩装置 | CellScale | UniVert | |
| 冯科萨染色 | Sigma-Aldrich | 1.00362 | 组织学 |
参考文献
- Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
- Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Bioma....
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