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用于幼年小鼠慢性多通道电极记录的轻量化驱动植入装置

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DOI：

10.3791/65228

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2023年6月2日

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, UT Southwestern Medical Center, 2Neuroscience Graduate Program, UT Southwestern Medical Center, 3O’Donnell Brain Institute, UT Southwestern Medical Center, 4Department of Psychiatry, UT Southwestern Medical Center

本文内容

摘要

本文介绍了一种微型驱动装置的设计、外科植入手术步骤以及术后恢复策略，可在出生后20天（p20）至出生后60天（p60）及更长时间的关键发育窗口期内，对幼年和青少年小鼠多个脑区同时进行长期的场电位和单细胞单位放电记录。

摘要

体内电生理学为完整大脑在亚秒级水平的神经环路动态提供了无与伦比的洞察力，是研究人类神经精神疾病小鼠模型的一种尤为重要的方法。然而，这类方法通常需要较大的颅内植入装置，因而无法应用于早期发育阶段的小鼠。因此，尽管深入理解这一关键发育窗口期的神经系统发育过程，可能为自闭症或精神分裂症等具有年龄依赖性的发育障碍提供独特见解，但迄今为止，几乎尚未开展针对自由活动的婴儿期或青少年期小鼠的体内生理学研究。本文介绍了一种微型驱动装置设计、外科植入手术流程以及术后恢复策略，可在小鼠从出生后第20天（p20）至出生后第60天（p60）及更晚阶段的发育过程中，实现多个脑区的长期局部场电位和单细胞单位放电的同步记录，该时间窗口大致对应于人类从2岁至成年的发育阶段。记录电极的数量及最终的记录位点可轻松修改和扩展，从而在发育过程中灵活地对与行为或疾病相关的脑区进行实验性控制与体内监测。

引言

大脑在儿童期和青春期这一关键发育阶段会发生大规模的变化1,2,3。许多神经和精神疾病，包括自闭症和精神分裂症，其行为学和生物学表现最初均出现在这一青少年大脑发育时期4,5,6。尽管目前对早期发育过程中发生的细胞、突触和遗传层面的变化已有较多了解，但关于回路或网络水平上的过程在此期间如何变化，相关研究仍相对较少。尤为重要的是，大脑的回路水平功能最终决定了复杂行为、记忆和认知能力，而这种功能是细胞和突触活动所涌现出的不可预测的特性7,8,9,10。因此，要全面理解大脑网络水平的功能，必须在完整神经回路的层面上直接研究神经活动。此外，为了明确神经精神疾病发展过程中脑活动如何发生改变，关键在于利用可靠的疾病模型，在疾病行为表型出现的特定时间窗口内检测网络活动，并追踪这些变化如何持续至成年期。

小鼠是最常用且功能强大的科学模式生物之一，拥有大量独特的遗传品系，可用于模拟具有年龄依赖性行为和/或记忆表型发作的神经发育障碍11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21。尽管在人类与小鼠大脑之间精确对应特定发育时间点具有挑战性，但形态学和行为学比较表明，出生后20至21天（p20-p21）的小鼠相当于人类2至3岁的年龄阶段，出生后25至35天（p25-p35）的小鼠相当于人类11至14岁的年龄阶段，而小鼠可能在出生后60天（p60）左右达到相当于人类20岁成人的发育水平3,22。因此，为了更好地理解青少年大脑的发育过程，并揭示自闭症或精神分裂症等疾病中脑神经网络如何发生功能障碍，理想的方法是在出生后20天至60天的小鼠中，直接在活体（in vivo）条件下监测其脑部活动。

然而，在小鼠早期发育过程中监测其脑部活动面临一个基本挑战，即幼鼠体型微小且体质相对较弱。为了对脑发育进行纵向研究，需要长期植入电极，而这一过程通常需要较大且笨重的外壳来保护精细的电极导线和接口电路板。23,24，且植入物必须牢固地固定在小鼠颅骨上，而幼鼠颅骨因骨化程度较低而更薄且刚性更差。因此，几乎所有关于 体内 由于啮齿类动物的相对体型、力量和颅骨厚度，相关生理学研究大多在成年个体中进行。迄今为止，大多数探索性研究 体内 野生型幼年大鼠的幼年啮齿类动物脑生理学研究必然限制了在自由活动的人类疾病模型中实验性监测幼年脑功能的能力25,26,27,28,29,30.

本文描述了一种新型的植入物外壳、外科植入手术以及术后恢复策略，可用于在发育关键期（出生后20天至60天及更晚）长期（长达4周或更久）持续研究幼年小鼠的体内脑功能。该植入手术可实现电极在幼年小鼠颅骨上的可靠且永久性固定。此外，微型驱动装置设计轻便，完全组装后重量约为4–6 g，由于所需用于平衡植入物重量的反向配重极小，因此在典型的动物行为范式中不会影响幼年小鼠的行为表现。

方案

本研究经德克萨斯大学西南医学中心机构动物照护与使用委员会批准（方案编号 2015-100867），并严格遵循机构及美国国立卫生研究院的指导原则进行。本研究中使用的 C57/Bl6 雄性和雌性小鼠于出生后 20 天（植入时体重为 8.3–11.1 g）进行植入手术。

1. 微驱动装置的设计与构建

  1. 数字化设计与打印微型驱动装置图1)
    1. 下载微型驱动器模型模板（https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive）。
    2. 在合适的立体定位图谱中确定目标脑区的立体定位坐标。
    3. 使用三维计算机辅助设计（3D CAD）软件，加载模板化微型驱动套管（图1B).
    4. 如有必要，可调整微型驱动导管模型上的输出套管位置，以靶向目标脑区。
      注意：每个套管孔的挤出长度应至少为2 mm，以确保四极记录电极能从套管孔中笔直伸出并指向目标区域。微型驱动套管模板设计为双侧定位前扣带皮层（每半球一个四极记录电极）、海马CA1区（每半球四个四极记录电极）和海马CA3区（每半球两个四极记录电极），每半球另设一个参考四极记录电极，置于海马CA1区上方的白质中。
    5. 如有必要，调整微型驱动装置的主体（图1A）以容纳电子接口板（EIB）的安装。
    6. 使用3D打印机以高分辨率（理想情况下分辨率优于25 µm）打印微型驱动体、套管、锥形件和盖子，并根据制造商的说明对打印材料进行后处理。应选用高刚性打印树脂。
  2. 组装定制螺钉和附件（图2A，B)
    1. 使用 3D CAD 软件，加载螺钉连接件模型（图1E).
    2. 使用3D打印机以高分辨率（理想分辨率为至少25 µm）打印螺钉附件，并根据制造商的说明对打印材料进行后处理。选用高刚性树脂材料进行打印。
    3. 将螺丝附件固定到每个四极推进螺丝上图1F（四极推进螺钉需在微驱动装置构建前于机加工车间定制生产）。
      1. 在每个螺钉上安装两个螺钉附件，一个位于脊上方，一个位于脊下方。确保每个螺钉附件的底部与脊接触。使用凝胶型氰基丙烯酸酯将螺钉附件粘合固定。
      2. 固定后，应确保螺钉附件在螺钉的纵轴方向上不发生移动，但可自由旋转且阻力最小。
  3. 组装微型驱动装置主体（图 2C，D)
    1. 使用精细的锋利剪刀将大段聚酰亚胺管（外径：0.2921 mm，内径：0.1803 mm）切成约6 cm长的节段。
    2. 将较大的聚酰亚胺片穿过微驱动套管上的输出孔，使每根管子从套管底部向下延伸几毫米。
    3. 使用洁净的30 G针头，将少量液体氰基丙烯酸酯涂抹于聚酰亚胺管与套管连接处，以固定聚酰亚胺管。注意避免氰基丙烯酸酯进入聚酰亚胺管内部。
      注意：通过驱动体顶部将液态氰基丙烯酸酯滴入套管内可加快此过程，但后续需使用细尖钻头重新清理导孔。
    4. 将大号聚酰亚胺管从微型驱动套管的顶端穿过微型驱动体上相应的大号聚酰亚胺孔。
    5. 缓慢推动微驱动导管和微驱动主体，直至两者紧密相邻且导管/主体连接卡扣相互锁紧。操作过程中需小心，避免压折或损坏聚酰亚胺管。
      注意：每根聚酰亚胺管应从套管底部平滑穿过，自微型驱动体顶部穿出。轻微弯曲属正常现象，但聚酰亚胺管过度弯曲可能导致螺纹电极变形，从而阻碍其笔直进入脑组织。
    6. 使用氰基丙烯酸酯将微型驱动体和微型驱动套管粘合在一起。
    7. 使用新的锋利剃须刀片，切断从套管输出孔底部伸出的大型聚酰亚胺管端。确保切割位置恰好在套管基部，使管子与套管底部齐平。
    8. 使用锋利的剪刀，在驱动体内缘边缘上方约45°角处，斜切大尺寸聚酰亚胺管。
  4. 装载组装好的定制螺钉（图2E)
    1. 将每个组装好的定制螺丝拧入微驱动体的外侧孔中。确保螺丝导柱穿过螺丝附件上的大孔。将每颗螺丝完全旋入，直至无法继续推进。建议使用矿物油或轴用润滑脂预先润滑螺丝。
    2. 使用极为锋利的剪刀，将聚酰亚胺管（外径：0.1397 mm，内径：0.1016 mm）剪成约 4 cm 长的小段。
    3. 将小段聚酰亚胺管穿过已安装在微驱动装置中的大段聚酰亚胺管。确保每根大段聚酰亚胺管的顶部和底部均露出多余的小段聚酰亚胺管。
    4. 将小型聚酰亚胺管固定在螺丝连接件上 通过 氰基丙烯酸酯，注意避免任何氰基丙烯酸酯进入大或小的聚酰亚胺管中。
    5. 使用新的锋利剃须刀片，切断从套管孔底部伸出的微小聚酰亚胺管端。确保切割位置恰好在套管基部，切口整齐，且聚酰亚胺管孔无任何堵塞物。
    6. 使用锋利的剪刀，在螺钉连接处顶端上方几毫米处，沿约45°角斜向剪去小型聚酰亚胺管的顶端。确保切口整齐，聚酰亚胺管孔内无任何阻塞物。
  5. 加载四极电极
    1. 使用先前所述方法制备四极电极（长度约6 cm）31.
    2. 使用陶瓷尖或橡胶尖镊子，小心地将一根四极电极穿过其中一根小型聚酰亚胺管，使电极顶端约有 2 cm 从聚酰亚胺管上方伸出。
    3. 将四极电极固定在小型聚酰亚胺管的顶端 通过 液态氰基丙烯酸酯，注意在此过程中不要将小的和大的聚酰亚胺管粘连在一起。
    4. 将螺丝旋出，直至接近驱动器顶部。
    5. 抓住从驱动器底部伸出的四极导线，在其从套管中穿出的位置轻轻弯折。
    6. 将螺钉完全旋回到驱动器中。
    7. 使用非常锋利的剪刀，在绞合处上方剪断四极导线。在显微镜下确认切口整齐，并确保四根电极的金属部分均完全暴露。
    8. 将螺钉回撤，直至八通道电极刚好固定在套管内。
    9. 对所有螺钉重复步骤 1.5.2–1.5.8。
    10. 将EIB连接到EIB支撑平台 通过 小型珠宝螺丝
    11. 将每个tetrode的每个电极连接到EIB上相应的端口。
  6. 为手术准备微驱动装置
    1. 使用先前所述方法对tetrodes进行电镀以降低电学阻抗31.
    2. 植入后，确保每个tetrode均置于套管内，使tetrode尖端与每个套管孔底部齐平。
    3. 将微型驱动锥套滑至组装完成的微型驱动器上。通过将锥形套附接杆插入盖子端口，将微型驱动器盖固定到微型驱动锥套上。
    4. 将锥形件调整至适当方向，确保当盖子闭合时，EIB 连接器能够顺利穿过 EIB 连接器通孔。用氰基丙烯酸酯胶水沿锥形件底部将其固定到位，注意避免胶水进入任何套管输出孔中。取下盖子。
    5. 用无菌矿物油仔细回填每个套管针孔，以防止手术植入后体液进入聚酰亚胺孔中。
    6. 用无菌凡士林仔细涂抹套管底部，以形成屏障，防止手术过程中化学试剂（如牙科水泥）进入暴露的脑组织。
    7. 称量完全组装好的微型驱动装置、盖子和四枚骨螺钉，以制备等重的配重。
    8. 必要时，在手术前将tetrodes推出一段适当距离，以确保在驱动装置与颅骨齐平时能够到达目标脑区。
      注意： 手术植入前，通过环氧乙烷气体灭菌法对植入物进行灭菌（500–1200 mg/L，2–4 小时）。  所有骨螺钉和外科器械应通过高压灭菌器进行灭菌（121°C，30分钟）。

2. 外科植入手术

  1. 麻醉小鼠并将其固定于立体定位仪中
    1. 将小鼠放入一个具有足够活动空间的小盒中，使用 3%-4% 异氟烷对小鼠进行麻醉。
      注意：可使用其他麻醉剂，但由于幼鼠的年龄、体型和体重因素，使用时应谨慎。
    2. 当小鼠失去反应（对尾部夹捏无反应，呼吸频率约为每分钟60次）时，将其从箱中取出，并迅速固定于立体定位仪上。
    3. 迅速将立体定位仪面罩覆盖在小鼠的吻部，并维持麻醉状态 1-3% 异氟烷。在初次手术切口前，给予任何兽医批准的镇痛药物，例如缓释型丁丙诺啡（0.05-0.5 mg/kg 皮下注射），或非甾体抗炎药，如卡洛芬（5-10 mg/kg 皮下注射）。
    4. 使用耳杆将小鼠头部牢固固定于立体定位仪中。确保颅骨水平且无移动，同时避免对小鼠耳道施加不必要的压力。由于幼年小鼠颅骨骨化程度较低，在头部固定过程中可能造成永久性损伤。
  2. 准备小鼠手术并暴露颅骨
    1. 通过在每只眼睛上放置少量人工泪液凝胶，并用灭菌的铝箔片覆盖双眼，以保护小鼠的眼睛。
      ​注意：人工泪液可保持眼睛湿润，而锡箔可防止任何光源对眼睛造成永久性损伤。建议使用较浓稠的人工泪液，因其还可作为屏障，避免其他可能具有毒性的手术溶液（如乙醇、牙科丙烯酸树脂等）意外进入眼睛。
    2. 使用无菌棉签将脱毛膏涂抹于手术区域，以去除头皮上的毛发。 注意避免将药膏涂抹到眼睛附近。 去除毛发后，放置一个 用无菌手术巾覆盖头皮，以固定手术区域。
    3. 使用无菌棉签清洁头皮 通过 连续三次使用聚维酮碘（10%）溶液清洗，随后使用异丙醇（100%）。
    4. 使用无菌手术刀或精细剪刀去除头皮。
    5. 使用无菌棉签以及无菌生理盐水（0.9% NaCl）和过氧化氢溶液，彻底清洁颅骨。
    6. 确定前囟位置，并使用立体定位仪用永久性记号笔在颅骨上仔细标记目标记录位点。
  3. 打开套管孔并安装骨锚
    1. 移除覆盖在记录位点上的颅骨。# 由于此年龄段小鼠的颅骨较薄，可使用手术刀片切割颅骨，从而避免使用可能损伤下方硬脑膜的钻头。暴露的硬脑膜需持续用无菌生理盐水（0.9% NaCl）或无菌矿物油保持湿润。此阶段切勿移除或穿刺硬脑膜，因为在幼年小鼠中，硬脑膜足够薄，后续步骤中簇状电极（tetrodes）可顺利穿过。
    2. 仔细钻出四个骨螺钉的导引孔。
      1. 将骨螺钉置于颅骨最外侧以及最前侧或后侧的区域，这些部位的颅骨最厚，且骨螺钉与微驱动装置植入位置保持足够距离。骨螺钉应选用无菌的精细珠宝螺钉（例如， UNM 120螺纹，1.5 mm头部。
      2. 用一根细的高导电性金属丝紧密缠绕一颗骨螺钉，该螺钉将作为接地电极，并在步骤2.4.6中连接至EIB。
    3. 使用手术刀片或小心地使用钻头，在颅骨骨螺钉孔位置附近划痕。划痕的目的是在步骤 2.3.5 中为液体氰基丙烯酸酯的结合提供足够粗糙的表面。
    4. 使用无菌螺丝刀和无菌螺丝钳，将每颗无菌骨螺钉旋入预定位置，注意避免刺破下方的硬脑膜.
    5. 使用无菌的30 G针头，将液体氰基丙烯酸酯涂抹于每根骨螺钉周围。这能有效增加骨螺钉附着处颅骨的厚度。注意避免任何氰基丙烯酸酯进入记录位点上方暴露的硬脑膜。
  4. 降低并安装微型驱动装置（图 2G)
    1. 将组装好的微型驱动装置安装到立体定位仪上，小心地将其降至小鼠颅骨位置。确保微型驱动装置的套管在下降至目标位置时处于适当的坐标点。
    2. 缓慢降低微驱动装置，仅沿背腹方向移动。在降低微驱动装置时，应使四极电极已从套管孔中伸出（步骤1.6.6），以便观察其进入脑组织的过程；当四极电极接触小鼠时，任何内侧/外侧或头端/尾端方向的移动均可能导致电极弯曲，从而无法到达预定目标位置。
    3. 当微型驱动装置完全下降后，确保套管底部刚好接触颅骨/硬脑膜。石油 jelly 和/或矿物油层将作为屏障覆盖暴露的硬脑膜。如有必要，可添加无菌石油 jelly 或无菌骨蜡以覆盖过多暴露的硬脑膜。
    4. 用立体定位仪固定微驱动装置的位置，同时将颅骨涂上牙科水泥，以将微驱动基座固定在已植入的颅骨螺钉上。
      注意：牙科水泥应完全包埋所有骨螺钉，并覆盖微驱动套管上的牙科水泥锚定台肩。
    5. 在牙科水泥凝固过程中，需仔细塑形，避免产生可能伤害小鼠或损坏微型驱动装置的尖锐角或边缘。确保使用足量的牙科水泥以固定微型驱动装置，但应去除多余的水泥，以免增加不必要的重量。
    6. 小心地将接地线穿过微驱动装置，并将其连接到EIB的相应插槽上。
    7. 待牙科水泥完全凝固后，小心地将微型驱动装置从立体定位仪上取下。将微型驱动装置的盖子盖好。
    8. 使用无菌棉签和无菌生理盐水清洁小鼠。
    9. 使用无菌棉签，将抗生素软膏薄薄地涂抹于植入部位附近任何暴露的头皮区域。
    10. 移除小鼠眼睛上的锡箔。
    11. 将小鼠从立体定位仪上取下时，需小心支撑微驱动装置增加的重量，并在将其转移至清洁笼具时保持稳定。

3. 术后恢复

  1. 即刻恢复
    1. 手术前，通过连接一根直径为0.75英寸的PVC管来准备配重系统，如图2G所示。该系统的其中一个臂穿过笼盖上钻出的孔，第二个臂放置在笼盖顶部，第三个臂则延伸至笼子上方之外。最顶端的臂应加盖封闭。
    2. 小心地将微驱动装置连接到配重系统（图2G-I），并使用一个与微驱动装置及颅骨螺钉总重量相等的配重块。从EIB上的连接器引出一根结实的线或钓鱼线，绕过配重系统的三个臂，最终连接至悬挂在最顶端臂上的配重块。
    3. 确保配重系统牢固连接至微驱动装置的EIB，并留有足够的线长，使小鼠能够自由活动并完全接触笼内各个区域。
    4. 在笼内提供富含营养的凝胶，并搭配湿润的常规啮齿类动物饲料，以确保小鼠充分补水并顺利恢复。
    5. 持续监测小鼠，直至其完全从手术麻醉中恢复。
  2. 长期恢复
    1. 在实验期间，只要未连接记录设备，必须始终通过配重系统支撑微驱动装置。可随时间逐步减轻配重，但切勿完全移除，以免对小鼠造成意外应力或对颅骨螺钉产生扭矩。
    2. 为防止植入物和配重系统受损，在整个实验过程中应将小鼠单独饲养，避免其与其他小鼠直接接触。
    3. 术后至少提供富含营养的凝胶食物3天，此后单独提供固体饲料即可满足需求。
      1. 由于配重系统占据笼顶空间，切勿使用顶部金属网放置食物和水；应将食物置于笼底地面，并通过笼壁侧面提供饮水。为防止食物变质，需每日彻底更换食物。
    4. 每天检查，确保小鼠能够自由活动至笼内任何区域，并确认配重系统牢固可靠地连接至微驱动装置。

结果

上述方案用于在小鼠多个脑区同时记录局部场电位信号和单个神经元活动，并在同一批小鼠中从出生后20天（p20）至60天（p60）期间每日进行记录。本文展示了两只小鼠的代表性电生理记录结果，以及实验后组织学分析，用以确认最终的记录位点。

将微型驱动装置手术植入 p20 小鼠
按照上述方法构建微型驱动装置（图 1）并手术植入 p20 小鼠体内（图 2）。手术完成后，立即 将小鼠连接至平衡系统（图 2G-I）并使其恢复。待小鼠完全恢复活动能力后，将微型驱动装置接入 体内 电生理记录系统。连接微型驱动装置与记录设备的电缆悬挂在小鼠上方。在小鼠于其饲养笼内自然行为状态下，持续 1 小时对所有通道进行电生理记录（32 kHz）。记录结束后，将小鼠从记录系统断开，重新连接至平衡系统，并送回动物饲养室，自由饮水并进食饲料。

每日神经活动记录
连续数周每日进行电生理记录，以实现对同一脑区在发育关键期（p20-p60）的长期监测。图中展示了长期记录中获得的部分原始局部场电位（LFP）数据。 图 3A,C通过多个四极电极同时获取分离的单个神经元信号（图3B）。在多个日期中识别出具有相似波形的单位（图3B，中图和右图），但由于记录电极可能存在漂移，无法明确断定连续数日所记录的是同一神经元。在另一只小鼠中，于出生后20天植入电极并连续数周每日记录，针对背侧CA1区的某一绞合电极进行神经活动分析。在记录的每一天均检测到大振幅的涟波活动以及分离良好的单个神经元放电单元（图4。这些数据表明，稳定且高质量的 体内 跨早期发育阶段，电生理记录可来自同一只小鼠。

记录位点的组织学验证及慢性植入对发育的影响
在最后一次记录结束后，对小鼠进行深度麻醉 通过 异氟烷麻醉后注射戊巴比妥钠处死，并通过电极尖端通电在记录位点产生微小损伤。实验结束后对小鼠脑组织进行组织学切片，以观察最终的记录位点（图 5A,B）。在另一组队列中，三只雄性与三只雌性小鼠于出生后第20天（p20）按上述方法进行手术植入。相同数量的同窝小鼠未接受植入手术，并在相同的饲养条件下维持。小鼠于出生后第62天（p62，即植入组术后6周）处死。小心清理颅骨，并测量前囟点至人字点的距离（图5C，左上）和人字缝处的颅骨最大外宽（图5C，右上）。沿颅骨中线做切口，移除一半颅骨以取出脑组织进行质量测量（图5C，右下）。从完整的颅骨半侧测量bregma处颅腔的高度（图5C（左下）。植入组与未植入组之间各项测量值均无显著差异（Wilcoxon 秩和检验），表明从出生后第20天开始的长期植入对颅骨或脑体积的自然发育无明显影响。

微型驱动装置组装示意图；各部件结构、螺钉孔位、EIB连接方式，用于神经记录装置。
图1：微型驱动装置的组成部件。 各部件的三维渲染图，分别为（A）微型驱动主体、（B）套管、（C）锥形件、（D）顶盖、（E）螺钉连接件，以及（F）用于推进电极的螺钉。图中已标示出每个部件的关键结构特征。详细的尺寸信息可从以下网址获取的模型文件中提取：https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/。请点击此处查看该图的高清版本。

微尺度3D打印技术；用于微流控的透明模具结构和精密针头插入。
图2：微型驱动装置的构建。（A）四极推进螺钉的侧视图，以及（B）顶部视图，显示顶部和底部螺钉附件已连接。（C）微型驱动装置的侧视图（D）和顶部视图，显示主体和套管已安装，且大直径聚酰亚胺管穿过每个套管孔，并修剪至套管底部。（E）微型驱动装置的侧视图，显示螺钉和小直径聚酰亚胺管已就位。小直径聚酰亚胺管的顶端在加载四极记录电极前立即修剪。（F）已安装至立体定位仪的完整微型驱动装置。为便于观察，通常包围微型驱动装置的保护锥已被移除。请注意，该微型驱动装置的部分螺钉附件采用黑色树脂打印。（G）配重支撑系统。（H）安装了配重支撑系统的鼠笼侧视图，以及（I）顶部视图。请点击此处查看该图的放大版本。

电生理数据、LFP波形、CA1、CA3区域、时间序列、神经元活动分析。
图3：典型的电生理记录。 一只p20小鼠按照上述方法植入微型驱动装置。从p21开始，此后每天连接记录设备，持续记录至少1小时神经活动，共持续2周。(A) 来自双侧（L = 左侧；R = 右侧）前扣带皮层（ACC）、海马CA3区（CA3）和海马CA1区（CA1）的原始局部场电位（LFP）记录。数据每日采集；为清晰起见，仅显示奇数天的数据。所有迹线均在小鼠于家笼中静止期间采集。标尺：1 mV，2 s。(B) 从海马CA3区（左）和CA1区（右）分离出的典型单个神经元单位，对应于图A中的记录。每根电极上的所有原始波形以黑色显示，平均波形以红色显示。标尺：50 µV，0.2 ms。(C) 另一只于p20植入装置的小鼠，每隔10天一次直至p60最终记录日的代表性原始LFP迹线。数据每日采集；为清晰起见，仅显示每第10天的数据。所有迹线均在小鼠于家笼中静止期间采集。标尺：1 mV，2 s。 请点击此处查看该图的放大版本。

神经信号分析；脑电图、波形模式、年龄 p21-p40、自相关图。
图 4．慢性记录的稳定性。 一只 p20 小鼠按照上述方法植入了微型驱动装置。从 p21 开始，持续 4 周，每天将小鼠连接至记录设备，记录至少 1 小时的神经活动。图中显示的是针对背侧海马 CA1 区的四极电极所获取的数据。（A）在 p21、p30 和 p40 时识别出的涟波事件的原始局部场电位（LFP，上图）和涟波频段滤波后的 LFP（下图）。为识别涟波事件，将原始 LFP 在 125 Hz 至 300 Hz 范围内进行带通滤波，并将涟波事件定义为涟波频段功率瞬时升高超过平均值 3 个标准差的情况。每个涟波的起始和结束时间定义为涟波频段功率恢复至平均值的时间点。识别出的涟波以红色标示。标尺：100 ms；从上到下：1,000 µV、140 µV、1,800 µV、180 µV、9,000 µV、1,200 µV、10,000 µV、1,000 µV。（B）来自图 A 记录中靶向 CA1 区的四极电极每日代表性单个神经元放电单元。每个电极上的所有原始波形以黑色显示，平均波形以红色显示。标尺：0.2 ms；从上到下：50 µV、100 µV、100 µV。（C）图 B 中单个神经元放电单元所有动作电位的自相关图。这些数据表明，在数周时间内，电极在海马锥体层内的位置保持稳定。请点击此处查看该图的放大版本。

脑形态学组织学图像与统计柱状图；评估植入物对颅骨测量指标的影响。
图 5：代表性组织学图像及对颅骨发育的影响。一只 p20 小鼠按照上述方法植入微型驱动装置。在 p60 完成最后一次记录后，在记录位点产生电解损伤，并用 4% 多聚甲醛灌注大脑。为确定记录位点，制备了 50 µm 的切片。(A) 海马 CA1 和 CA3 区的损伤。箭头表示 CA3 记录位点；双箭头表示 CA1 记录位点。比例尺：0.5 mm。(B) 双侧 ACC 区的损伤。箭头表示 ACC 记录位点。比例尺：0.5 mm。(C) 在 p20 植入微型驱动装置（灰色）和未植入同窝小鼠（白色）的 p62 小鼠颅骨尺寸和脑质量测量结果。每次测量均报告 Wilcoxon 秩和检验的 p 值。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

现代实验探究 体内 啮齿类动物神经环路功能研究常采用细胞外电生理技术 通过 永久植入的电极用于监测单个神经元（即单细胞）的活动 局部种群通过 局部场电位（local field potentials, LFP），但由于技术难题，这些方法很少应用于幼年小鼠。本文描述了一种获取 体内 在小鼠发育关键期（p20至p60及以后）进行电生理记录。该方法包括微驱动装置的打印与构建制造流程、手术植入程序以及术后恢复策略，所有步骤均专门针对幼年小鼠优化设计。在本方案的开发过程中，多个因素起到了关键影响作用，包括幼年小鼠体型较小、体质较弱，与成年小鼠相比存在明显差异，以及幼年小鼠颅骨骨化程度较低，而微驱动装置需牢固固定于颅骨之上。

两种常用的主要方法用于执行 体内 电生理学是电极阵列（例如.、四极电极）和硅探针。硅探针重量轻，单位重量内可提供大量记录位点，此前已在幼年大鼠中使用25然而，硅探针的单个成本相对较高。相比之下，本文所述的微型驱动装置可用不到50美元的原材料制成，是一种经济高效的替代方案 体内 记录。此外，硅探针通常必须沿固定线路植入，这限制了对空间上多样化脑区的同时记录。相比之下，本文所述的微型驱动装置采用可独立调节的四极电极，能够同时在最多16个不同位置进行记录，且对这些位置之间的空间关系几乎无限制。通过调整导管孔的突出位置至任意所需的前后和内外方向，可轻松修改该微型驱动装置，以实现对不同于本文所述位置的靶向记录。在靶向其他脑区时需注意，尽管四极电极通常沿直线行进，但在离开微型驱动装置导管时，这些细小导线可能发生轻微偏转。因此，目标脑区越小或位置越靠腹侧，使用四极电极成功靶向该区域的难度就越大。

本文所描述的微型驱动器植入装置在基本设计上与先前多种基于四极 Recording 电极（tetrode）的微型驱动器设计相似23,32,33,34,35，即各个四极 Recording 电极固定于螺钉上，从而实现对每个四极 Recording 电极记录深度的精细调控。尽管当前微型驱动器设计包含若干独特特征，例如可便捷地靶向空间分布不同的脑区，但本论文最主要的新颖之处在于详细描述了手术植入及术后恢复策略，这些方法使得对尚处于发育阶段的幼年小鼠进行长期神经网络活动研究成为可能。事实上，本文所述的手术与恢复方法亦可被调整用于支持在幼年小鼠中植入其他类型的装置。

为了在多天内保持稳定的记录，导线或探针必须牢固地固定在颅骨上。虽然小鼠颅骨的整体结构在出生后第20天（p20）之后仅发生轻微变化，但其厚度在p20至p45期间显著增加36。事实上，p20时的颅骨刚性不足，无法在不损伤的情况下支撑植入物。为克服这一生物学限制，本方案在植入手术期间通过使用氰基丙烯酸酯人为增厚颅骨。via 采用此策略，可能可在小于p20的小鼠中进行植入，但小鼠颅骨在发育至约p20之前会经历显著的大小和形态变化36。因此，不建议在小于p20的小鼠中进行长期植入，因为在仍在发育的颅骨中使用氰基丙烯酸酯和固定骨螺钉可能会显著影响颅骨及下方脑组织的正常发育。重要的是，在本研究中，从p20开始进行慢性植入后，未观察到颅骨或脑大小的大体测量值受到影响（图5C）。

本文所述方法中的一个关键步骤是术后恢复策略；根据该策略，在小鼠成长并经历肌肉及肌肉骨骼系统发育的过程中，应持续对植入物的重量进行配重平衡。植入初期，若无配重平衡，小鼠无法承受植入物的重量，导致其难以充分接触到笼内食物和水源，从而引发营养不良和脱水。配重平衡系统构造简单、成本低廉，实施便捷，可使任何年龄植入的小鼠自由探索其整个饲养笼，从而确保充足的营养摄入和水分补充。随着小鼠年龄增长，配重可逐步减少，直至成年小鼠阶段可完全移除；然而，建议在整个实验期间持续使用配重系统，并始终至少保留一个名义上的配重物。尽管成年小鼠可能随时间推移能够承受微型驱动装置的尺寸与重量，但在自由行为过程中若缺乏缓解性的配重，持续的自然运动会对接骨螺钉产生扭矩和剪切力，而这些螺钉用于将微型驱动装置固定在颅骨上，从而增加装置脱落的风险，尤其在长期慢性实验中更为明显。

当前研究存在两个重要的局限性。第一，为了评估在 p20 植入对颅骨和脑发育的影响，多组小鼠在长期植入后被处死（图 5C）。尽管这些分析结果显示植入物对颅腔大小或脑组织质量均无显著影响（图5C），本研究未在 p20 至 p60 早期发育阶段的多个时间点检测颅骨大小或脑质量。尽管先前的研究表明，脑腔的发育在 p20 时已基本完成36，有可能在此早期时间窗内进行移植会产生一些意想不到的变化，而这些变化可能在本研究所评估的成年阶段已被纠正或代偿。其次，产生本研究所示电生理数据的实验 图3 和 图4 并未设计用于最大化细胞产量。因此，尽管本文展示的数据证明了该设备能够实现稳定的长期记录和清晰分离的单个神经元信号，但这些结果不应被视为代表该设备所能达到的最大产量潜力。

许多人类神经和精神疾病在早期发育阶段或青春期期间表现出来，包括自闭症和精神分裂症。然而，尽管已有大量小鼠模型可用，关于可能构成这些疾病基础的神经环路水平功能障碍仍知之甚少。识别这些初始的网络变化对于建立早期检测策略和治疗范式至关重要。然而，由于技术上的挑战，神经精神疾病小鼠模型中脑网络功能在发育过程中如何被破坏仍不明确。本文所述的微型驱动装置与回收策略旨在支持对小鼠脑内多区域脑网络发育的研究，从而让研究人员能够测量正常脑发育过程，并识别疾病小鼠模型中脑发育的异常改变。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院R01 NS104829（B.E.P.）、R01 MH117149（L.J.V.）和F99NS12053（L.D.Q.）以及德克萨斯大学西南医学中心GSO捐赠奖（R.J.P.和L.D.Q.）资助。作者感谢德克萨斯理工大学健康科学中心药学院Jenny Scaria提供的技术协助，以及密歇根大学Brendon Watson博士在方法学上的建议。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 V 视频追踪 LED 灯NeuralynxHS-LED-Red/Green-omni-10V用于带有 LED 插座的前置放大器头级，以实现运动追踪功能
16TT EIB 板NeuralynxEIB-36-16TT电子接口板，配备 Omnetics 连接器
16TT 前置放大器头级NeuralynxHS-36-LED用于记录应用的 Omnetics 44 针插座信号放大器，连接 EIB 板与拖线电缆；包含用于运动追踪的头级 LED 连接器
婴儿型 Mixter 止血钳FST13013-14精细弯型止血钳
骨锚螺钉Stoelting51457用于将 EIB 板固定至主驱动体上
布托啡诺ZooPharm批号 #BERLAB0.5-221207布托啡诺（0.5 mg/mL），5 mL 规格
拖线电缆NeuralynxHS-36 Litz Tether轻质屏蔽线拖线，适用于 Omnetics 头级；长度可选 1 m、2 m、3 m 或 5 m
卡洛芬 / RimadylBio-ServeMD150-2术后抗炎药物
透明树脂 v4FormlabsFLGPGR04在 3D 打印过程中由 3D 打印机通过光聚合固化的液态树脂
定制（穿梭）螺钉Advanced Machining and Tooling, Inc.Custom定制加工并带螺纹的螺钉
牙科丙烯酸液体组分Teets denture material批号# 329801义齿材料的液体 组分（见上文）
牙科丙烯酸粉末组分Teets denture material批号# 583987"冷固化"义齿材料，甲基丙烯酸甲酯；与液体组分混合后用于固定记录装置
DietGel BoostClearH2O72-04-5022适用于幼年或恢复期小鼠的高热量膳食补充剂
Digital Lynx 16SXNeuralynxDigitalLynx 16SX Base主记录设备，配备 16 个组合板插槽，最多支持 512 个记录通道
解剖剪刀 - 厚刃型FST14082-09多种用途
Dumont #5 陶瓷涂层镊子FST11252-50用于多通道电极（tetrode）的处理、穿线或固定
Dumont #5SF 镊子FST11252-00多用途装配操作
Dumont #5SF 镊子FST11252-00多用途外科操作
Dumont #7 细镊子（弯型）FST11274-20多种用途
Dumont #7 细镊子（弯型）FST11274-20多用途外科操作
EIB-36 接板适配器NeuralynxEIB-36 plating adapter用于接板/装配
EIB-36 接板适配器NeuralynxEIB-36 plating adapter立体定位手术附件，用于在手术中将驱动装置下放至颅骨
安乐死溶液Virbac710101用于安乐死的戊巴比妥钠
超细型 Bonn 剪刀FST14083-38多种用途
超细型 Graefe 镊子FST11150-10小型直型带齿镊子
超细型 Graefe 镊子FST11150-10小型直型带齿镊子
细型止血钳FST13006-12细型止血钳
细剪刀 - CeramaCutFST14958-09用于多通道电极（tetrode）切割
细剪刀 - ToughCutFST14058-09多种用途
Form 3+FormlabsPKG-F3-P-WS-SVC-BASIC用于制造所有打印部件/材料的 3D 打印机；低力立体光刻 3D 打印机（LFS）
凝胶型强力胶Loctite1363589多个步骤中使用
Graefe 镊子FST11049-10小型带齿角形镊子
接地导线A-M Systems批号# 582335直径 0.005" 的退火不锈钢裸线，100 英尺长
脱毛凝胶通用市售可得术前用于去除小鼠头部的毛发
热风枪DewaltD26960K用于多通道电极（tetrode）旋转后的融合处理
高温电凝套件FST18010-00如适用，可与骨蜡配合使用
热珠灭菌器FST18000-45用于手术过程中对器械进行临时灭菌的电气灭菌装置
异氟烷Covetrus11695067771标准液态异氟烷麻醉剂，用于异氟烷挥发器，最大浓度可达 5%
91% 异丙醇通用市售可得用于标准术前消毒程序
珠宝螺钉（幼年小鼠用骨螺钉）Component supply co.MX-000120-02SFL不锈钢 #000-120 x 1/8'' 圆头螺钉，带槽驱动
LaGrange 剪刀FST14173-12多种用途
大号聚酰亚胺套管Nordson medical批号 # 13564聚酰亚胺套管 — 内径 0.0071"；外径 0.0115"；长度 36"
液体型强力胶Loctite1365882多个步骤中使用
微型钻机ForedomK.1070K.1070 高速旋转微电机套件；含控制箱、3/32" 夹头、可变速度脚踏控制器、手柄支架；可适配立体定位仪；适用于 100–115 V 电压
微型钻头（0.5 mm 及以上）FST19007-05/07/09用于开颅手术
矿物油Sigma产品编号 Pcode 1002076577; M5904-500mL多个步骤中使用
矿物油Sigma产品编号 Pcode 1002076577; M5904-500mL用于保持开颅孔开放
微型一字螺丝刀FST30051-10用于骨螺钉的插入与紧固
Neosporin 三重抗生素软膏Johnson & Johnson512373700抗生素软膏
Omnetics 44 针纳米连接器NeuralynxNeuralynx 部件号 #A70427-801非标准件 — Omnetics 44 针（母头）双排直脚纳米连接器，带 2 个导向针（公头），用于定制平衡装置
铂铱合金丝（含 10% 铱）California fine wire订单号 M374710细记录导线，通过 tetrode 组装站和 spinner 2.0（见下文）加工成多通道电极（tetrode）用于记录；HML NATRL VG BOND 涂层；规格 .0007 英寸 × 200 英尺
铂黑电镀液NeuralynxPlatinum black plating solution用于电镀
聚碳酸酯笼底Thomas Scientific/Maryland plastics1113M35；制造商编号 E0270标准笼底；可加装带饲料和饮水瓶的金属网装置，用于未植入小鼠
带 N10 微滤器的聚碳酸酯笼顶AncareN/A标准笼顶，需用 PVC 管改装以适配平衡装置
10% 聚维酮碘通用市售可得用于标准术前消毒程序
PVC 管Charlotte pipeN/A1/2" × 600 PSI 40 级白色 PVC 管；用于小鼠恢复期间的平衡装置组装
手术刀片 - #4FST10060-00用于切口
手术刀柄 - #4 大体解剖型FST10060-13用于切口
自锁式针和骨螺钉镊子FST26100-00用于在颅骨中插入骨螺钉和接地螺钉时的夹持
小型 EIB 插针NeuralynxSmall EIB pins用于将多通道电极（tetrode）导线连接至 EIB 板
小号聚酰亚胺套管Nordson medical批号 # 19102423聚酰亚胺套管 — 内径 0.004 英寸；外径 0.0044 英寸；长度 36"
SolidWorksDassault SystemesSolidWorks用于微驱动装置设计的 3D CAD 软件
刮刀与探针FST1090-13用于涂抹凡士林/矿物油，也可临时用于多通道电极（tetrode）矫直
弹簧剪刀 - 8 mmFST15024-10用于颅部组织切口
弹簧剪刀 - 8 mmFST15024-10用于初始切口
标准型齿状镊子FST11000-12大型带齿镊子
外科剪刀 - 尖钝型FST14001-12多种用途
外科剪刀 - ToughCutFST14054-13多种用途
多通道电极（tetrode）组装站NeuralynxTetrode assembly station用于多通道电极（tetrode）组装
多通道电极（tetrode）旋转器 2.0NeuralynxTetrode spinner 2.0用于多通道电极（tetrode）组装
双组分环氧树脂Gorilla 品牌4200102多个步骤中使用

参考文献

  1. Konrad, K., Firk, C., Uhlhaas, P. J. Brain development during adolescence. Deutsches Arzteblatt International. 110 (25), 425-431 (2013).
  2. Silbereis, J. C., Pochareddy, S., Zhu, Y., Li, M., Sestan, N. The cellular and molecular landscapes of the developing human central nervous system. Neuron. 89 (2), 248-268 (2016).
  3. Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Progress in Neurobiology. 106-107, 1-16 (2013).
  4. Volk, L., Chiu, S. -L., Sharma, K., Huganir, R. L. Glutamate synapses in human cognitive disorders. Annual Review of Neuroscience. 38, 127-149 (2015).
  5. Lord, C., et al. Autism spectrum disorder. Nature Reviews Disease Primers. 6, 5(2020).
  6. McCutcheon, R. A., Reis Marques, T., Howes, O. D. Schizophrenia - An overview. JAMA Psychiatry. 77 (2), 201-210 (2020).
  7. Hopfield, J. J. Neural networks and physical systems with emergent collective computational abilities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (8), 2554-2558 (1982).
  8. Heeger, D. J. Theory of cortical function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (8), 1773-1782 (2017).
  9. Pouget, A., Dayan, P., Zemel, R. Information processing with population codes. Nature Reviews Neuroscience. 1, 125-132 (2000).
  10. Averbeck, B. B., Latham, P. E., Pouget, A. Neural correlations, population coding and computation. Nature Reviews Neuroscience. 7 (5), 358-366 (2006).
  11. Bey, A. L., Jiang, Y. -H. Overview of mouse models of autism spectrum disorders. Current Protocols in Pharmacology. 66, 1-26 (2014).
  12. Kazdoba, T. M., et al. Translational mouse models of autism: Advancing toward pharmacological therapeutics. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 28, 1-52 (2016).
  13. Mendoza, M. L., Quigley, L. D., Dunham, T., Volk, L. J. KIBRA regulates activity-induced AMPA receptor expression and synaptic plasticity in an age-dependent manner. iScience. 25 (12), 105623(2022).
  14. Bernardet, M., Crusio, W. E. Fmr1 KO mice as a possible model of autistic features. The Scientific World Journal. 6, 1164-1176 (2006).
  15. Weaving, L. S., Ellaway, C. J., Gécz, J., Christodoulou, J. Rett syndrome: Clinical review and genetic update. Journal of Medical Genetics. 42 (1), 1-7 (2005).
  16. Krawczyk, M., et al. Hippocampal hyperexcitability in fetal alcohol spectrum disorder: Pathological sharp waves and excitatory/inhibitory synaptic imbalance. Experimental Neurology. 280, 70-79 (2016).
  17. Jaramillo, T. C., et al. Altered striatal synaptic function and abnormal behaviour in Shank3 exon4-9 deletion mouse model of autism. Autism Research. 9 (3), 350-375 (2016).
  18. Suh, J., Foster, D. J., Davoudi, H., Wilson, M. A., Tonegawa, S. Impaired hippocampal ripple-associated replay in a mouse model of schizophrenia. Neuron. 80 (2), 484-493 (2013).
  19. Altimus, C., Harrold, J., Jaaro-Peled, H., Sawa, A., Foster, D. J. Disordered ripples are a common feature of genetically distinct mouse models relevant to schizophrenia. Molecular Neuropsychiatry. 1 (1), 52-59 (2015).
  20. Marcotte, E. R., Pearson, D. M., Srivastava, L. K. Animal models of schizophrenia: A critical review. Journal of Psychiatry and Neuroscience. 26 (5), 395-410 (2001).
  21. Makuch, L., et al. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71 (6), 1022-1029 (2011).
  22. Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
  23. Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: Drive fabrication. Journal of Visualized Experiments. (26), e1094(2009).
  24. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
  25. Farooq, U., Dragoi, G. Emergence of preconfigured and plastic time-compressed sequences in early postnatal development. Science. 363 (6423), 168-173 (2019).
  26. Langston, R. F., et al. Development of the spatial representation system in the rat. Science. 328 (5985), 1576-1580 (2010).
  27. Wills, T. J., Cacucci, F., Burgess, N., O'Keefe, J. Development of the hippocampal cognitive map in preweanling rats. Science. 328 (5985), 1573-1576 (2010).
  28. Bjerknes, T. L., Moser, E. I., Moser, M. B. Representation of geometric borders in the developing rat. Neuron. 82 (1), 71-78 (2014).
  29. Bjerknes, T. L., Dagslott, N. C., Moser, E. I., Moser, M. -B. Path integration in place cells of developing rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), E1637-E1646 (2018).
  30. Jansen, N. A., et al. Impaired θ-γ coupling indicates inhibitory dysfunction and seizure risk in a Dravet syndrome mouse model. Journal of Neuroscience. 41 (3), 524-537 (2021).
  31. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: Tetrode assembly. Journal of Visualized Experiments. (26), e1098(2009).
  32. Voigts, J., Siegle, J., Pritchett, D. L., Moore, C. I. The flexDrive: An ultra-light implant for optical control and highly parallel chronic recording of neuronal ensembles in freely moving mice. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 8(2013).
  33. Voigts, J., Newman, J. P., Wilson, M. A., Harnett, M. T. An easy-to-assemble, robust, and lightweight drive implant for chronic tetrode recordings in freely moving animals. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026044(2020).
  34. Guardamagna, M., et al. The Hybrid Drive: A chronic implant device combining tetrode arrays with silicon probes for layer-resolved ensemble electrophysiology in freely moving mice. Journal of Neural Engineering. 19 (3), (2022).
  35. Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
  36. Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, 417(2016).

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