本方案描述了一种用于评估心血管系统功能的大动物运动试验模型，可用于临床前阶段评价新疗法的有效性。该模型可与临床运动试验相媲美。
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摘要
摘要
尽管治疗手段不断进步，心血管疾病仍然是全球范围内导致死亡和疾病负担的最主要原因之一。基于基因治疗的治疗性血管生成是针对那些即使接受了最佳药物治疗和侵入性治疗后仍存在明显症状的患者的一种有前景的治疗方法。然而，许多在心血管基因治疗领域颇具潜力的技术在临床试验中未能达到预期效果。其中一个原因是临床前研究与临床试验中用于评估疗效的终点指标不一致。在动物模型中，研究通常侧重于易于量化的终点指标，例如通过组织学切片计算得到的毛细血管数量和面积。而在临床试验中，除死亡率和发病率外，终点指标往往是主观性的，例如运动耐受能力和生活质量。然而，临床前与临床终点指标可能衡量的是治疗效果的不同方面。尽管如此，这两类终点指标对于开发成功的治疗策略都是必需的。在临床实践中，主要目标始终是缓解患者的症状，改善其预后和生活质量。为了从临床前研究中获得更具预测价值的数据，必须使终点指标的测量方法与临床研究中的更为一致。本文介绍了一种在猪模型中具有临床相关性的跑步机运动试验方案。本研究旨在：（1）建立一种可靠的猪运动试验方法，可用于评估基因治疗及其他新型疗法的安全性和功能疗效；（2）更好地实现临床前研究与临床研究之间终点指标的一致性。
引言
慢性心血管疾病是全球范围内导致死亡和疾病负担的重要原因1,2。尽管目前的治疗方法对大多数患者有效，但由于弥漫性慢性病变或合并症等因素，许多患者仍无法从现有疗法中获益。此外，在部分患者中，现有治疗手段无法缓解心脏症状，即使接受最佳药物治疗，其心血管疾病仍会持续进展3。因此，迫切需要开发针对严重心血管疾病的新治疗策略。
近年来，研究人员发现了新的分子通路以及调控这些靶点的方法，使得基因治疗、细胞治疗及其他新型疗法成为治疗严重心血管疾病的现实选择4。然而，尽管在临床前研究中取得了令人鼓舞的结果，许多心血管领域的应用在临床试验中未能达到预期效果。尽管临床试验中的疗效欠佳，但多项试验已证实这些新型疗法具有良好的安全性5,6,7,8,9。因此，要将新的心血管疗法成功应用于患者，需要改进研究策略，并建立更优的临床前模型、研究条件和研究终点，以更准确地预测临床疗效。
在动物模型中，研究重点通常放在易于量化的终点指标上，例如通过组织学切片计算出的毛细血管数量和面积，或静息及药物应激状态下左心室成像所得的参数。而在临床试验中，许多终点指标则更具主观性，例如运动耐受能力或症状缓解情况4。因此，临床前研究与临床试验中的终点指标很可能反映的是治疗效果的不同方面。例如，血管数量的增加并不总是与灌注改善、心脏功能提升或运动耐受能力提高相关。然而，要开发出成功的治疗策略，这两类终点指标都是必需的10。 尽管如此，根本目标始终是缓解症状，改善患者的预后及生活质量。为实现这一目标，必须使临床前研究与临床试验之间的终点指标测量更加一致4。
心肺适能反映了循环系统和呼吸系统在持续体力活动期间提供氧气的能力，因此可量化个体的功能容量。功能容量是一个关键的预后指标，因为它对心血管疾病及全因死亡风险具有很强的独立预测作用11。心肺适能的改善与死亡风险降低相关12。运动试验适用于评估心血管疾病患者的有氧运动表现及治疗反应。根据设备条件，试验可在功率自行车或跑步机上进行。通常采用每分钟逐步增加负荷的方式，避免突然增加负荷，以获得线性的生理反应。运动试验中最重要的变量包括总运动时间、达到的代谢当量（METs）、心率，以及心电图（ECG）上QRS波群（Q波、R波和S波）与T波之间的ST段变化。临床负荷试验成本较低且易于实施13。由于这些优势，诸如6分钟步行试验等负荷试验已在临床中广泛应用，也应被用于新疗法的临床前评估。
据我们所知，目前尚无描述充分的大型动物模型可用于评估基因治疗或其他新型疗法的功能疗效。因此，具有临床相关性的运动试验为在临床前阶段评价这些新疗法的效率提供了一个极佳的视角。
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方案
所有实验均经东芬兰大学动物实验委员会批准。本方案描述了一种临床相关的猪 treadmill 运动试验，用于评估新型心脏病疗法的安全性和有效性。本研究采用体重为 25–80 kg 的雌性家猪。动物来源于商业渠道（见材料表）。
1. 设置跑步轨道
- 设置单向运行轨道，使动物只能朝一个方向移动。使用闸门和隔板防止动物倒退。运行轨道的平面图见图1，运行轨道的示例见图2。
- 确保跑步机（见材料表）有足够的空间以实现坡度调节。
- 确保跑步机具有可调节的宽度，以防止动物在跑步过程中转身。
- 使用透明塑料制作跑步机的前壁。这可以防止动物逃离跑步机，同时仍允许动物透过前壁观察。
注意：动物能够透过前壁观察至关重要，因为我们的经验表明，当猪看到墙另一侧的同伴时，其跑步的意愿更强。 - 将心电图监护仪和除颤器（见材料表）放置在跑步机旁。
注意：在应激测试期间可能发生致命性心律失常，尤其是当猪存在心肌缺血时14,15,16。 - 确保运行轨道内设有饮水点，以便动物在跑步后饮水和降温。
2. 测试前猪的适应期
- 实验开始前将动物饲养两周。
- 适应期的第一周内，确保动物适应饲养人员及其新的饲养环境，但不包括跑台。
- 适应期的第二周内，确保动物适应跑台环境。
- 开始让动物熟悉跑台。首先保持所有闸门打开，使动物可在跑台上自由行走并探索环境。
- 当动物对跑台较为熟悉后，启动跑步机，让动物每次短时间跑步，例如7分钟。每日需逐步延长跑步时间。
注意：在适应期间应记得奖励动物。例如，本研究中使用无盐爆米花作为猪的奖励。
3. 运动试验
注意：在运动测试前至少 2 小时，应让猪禁食，或仅在跑步前给予极少量食物。
- 打开跑步机，并将坡度设置为 5%–10%。
- 动物一上跑步机，立即以 2 km/h 的起始速度启动跑步机。
- 每 60 秒将速度增加 0.5 km/h，直至达到 5 km/h。总跑步时间为 15 分钟。
- 如果动物无法在整个测试期间以最高速度完成跑步，请执行以下步骤：
- 如果猪的跑步速度未达到设定速度，可轻轻从后方推动其背部，这可能会让动物感觉需要跑得更快，而不会减速。
- 轻轻推动动物的次数最多不超过三次；之后，每次降低 0.5 km/h 的速度，直到猪能够适应当前速度。速度不得低于 2 km/h。
- 如果动物即使在低速下仍拒绝跑步，则关闭跑步机并终止测试。
4. 运动试验期间的心电图监测
- 将心电图电极（参见材料表）放置在跑步过程中移动较少的解剖位置，例如肩胛骨区域或胸部。
注意：应使用专为运动测试设计的心电图电极，以增强与皮肤的黏附性。请记得在放置电极前剃除电极接触区域的毛发。 - 记录跑步过程中的心率变化。
注意：根据我们的经验，由于运动和其他干扰因素，ST段分析通常较为复杂。心律监测也可通过植入式循环记录仪或起搏器进行。
5. 数据采集
- 每次改变速度时，记录跑步距离、总时间和速度。
注意：现代跑步机可能会收集大量其他数据，因此必须熟悉跑步机的使用手册，以充分利用设备的全部功能。 - 注意动物行为的可能变化，例如跛行。
注意：如有需要，请联系兽医，并确保动物接受必要的镇痛治疗。在动物完全恢复之前，停止其参与后续运动训练。
6. 术后护理
- 确保动物能够接触到水源。
- 对动物进行奖励，例如给予零食或玩具。
- 跑轮运行结束后，监测动物 30 分钟，观察是否出现不良反应。
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结果
要成功实施本方案，操作者必须具备大型动物操作经验。研究人员需要能够判断动物停止跑动是由于疲劳还是缺乏动机。记录跑速和距离有助于对此进行评估，因为通常缺乏动机的动物会完全停止跑动，而疲劳的动物则会在减速后继续缓慢奔跑（图3）。如有必要，若结果看起来不可靠，可在第二天重复该方案。
图 4 展示了腺相关病毒（AAV）处理动物的代表性时间线。图 4 中的时间线可能因研究条件的不同而有所变化，尤其是安乐死时间点的选择。在设计实验时，请注意动物的适应期。
可以将结果与其他器官结构和功能的测量指标（如心脏超声）进行比较，以分析运动耐量与这些测量指标之间的关系。例如，跑步距离的变化与射血分数的变化相关。当射血分数较低时，动物在运动测试过程中无法全程保持最高速度（图5）。分析的变量可能因研究设置的不同而有所差异。本方案可实现对总跑步距离、速度变化、代谢当量（METs）...
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讨论
这种大型动物运动试验模拟了临床使用的测试方法，缩小了临床前研究与临床试验在终点指标上的差距。该试验可用于评估针对严重心血管疾病（如闭塞性动脉硬化、心力衰竭和缺血性心脏病）新疗法的有效性。本方案中应用的时间点可能根据所测试的治疗方法而有所不同。该方案基于长期使用大型动物的经验而标准化，可用于评估心血管基因治疗及其他新型治疗策略的安全性和有效性。
猪的心脏和心血管系统在生理、解剖和功能上与人类相似。因此，猪常被用于模拟心血管疾病的机制和治疗方案17。在我们的猪研究中，随访时间最长可达12个月18；然而，随着动物在长期随访期间不断生长，其饲养和管理变得越来越困难。
该方法包含多个关键步骤，这些步骤对于测试的成功至关重要，且事后无法纠正。首先，猪在奔跑动机方面存在个体差异。使动物产生奔跑动机，并在整个测试过程中维持足够的动机，是确保各个时间点具有可比性的关键。维持猪的奔跑动机需要深入了解其个体行为特征。在进行运动测试前，必须使动物适应跑台和...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢国家实验动物中心的 Minna Törrönen、Riikka Venäläinen、Heikki Karhunen 和 Inkeri Niemi 在动物实验方面提供的帮助。本研究由芬兰科学院、欧洲研究理事会（ERC）以及欧盟“地平线”计划 CardioReGenix 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 除颤器 | Zoll M series | TO9K116790 | 所有便携式除颤器均可使用 |
| 除颤电极片 | Philips | M3713A | 所有电极片均可使用，只要其与除颤器兼容 |
| 心电图电极 | 多个供应商 | 推荐专为运动试验设计的心电图电极 | |
| 循环记录仪 | Abbott Oy | DM3500 | 可选，用于心律监测 |
| 病人监护仪 | Schiller Argus LCM Plus | 7,80,05,935 | 所有便携式心电监护仪均可使用 |
| 猪 | Emolandia Oy | ||
| 跑步机 | NordicTrack | 所有可调节坡度和速度的跑步机均适用于运动试验。 跑步机应尽可能长且宽。 | |
| 超声系统 | Philips EPIQ 7 ultrasound | ||
| 各种建筑材料 | 多个供应商 | 用于根据图1和图2建造围栏、坡道和门 | |
| 动物用各种零食 |
参考文献
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