一种定量分析年龄相关性黄斑变性病变特异性眼底自发荧光变化的工作流程

摘要

本研究描述了一种工作流程，用于在考虑眼底不同区域自发荧光水平变化的情况下，测定并比较来自特定感兴趣区域（例如年龄相关性黄斑变性 [AMD] 中的玻璃膜疣和视网膜下玻璃膜疣样沉积物）的自发荧光水平。

摘要

眼底自发荧光（FAF）成像可对眼底固有荧光团进行无创性定位，特别是视网膜色素上皮（RPE）的荧光团，如今借助基于共焦扫描激光检眼镜的定量自发荧光（QAF）技术，已可实现量化分析。研究显示，在年龄相关性黄斑变性（AMD）患者中，后极部QAF信号总体呈降低趋势。然而，QAF与各类AMD病变（如玻璃膜疣、视网膜下玻璃膜疣样沉积物）之间的关系尚不明确。

本文描述了一种用于确定年龄相关性黄斑变性（AMD）中病灶特异性定量自发荧光（QAF）的工作流程。一种多模态 体内 采用成像方法，包括但不限于谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）黄斑区容积扫描和自发荧光成像（QAF）。利用定制的FIJI插件，将相应的QAF图像与SD-OCT扫描获得的近红外图像进行配准（依据特征性解剖标志，如血管分叉处）。在OCT图像中标记中心小凹及视神经乳头边缘，并将这些标记转移至配准后的QAF图像，以精确定位分析网格。

随后可在单个OCT B扫描图像或QAF图像本身上标记与年龄相关性黄斑变性（AMD）相关的病灶。为校正眼底不同区域QAF值的平均值和标准差差异，需建立规范化的QAF图谱（通过取代表性AMD组的QAF图像平均值，构建出标准化的视网膜QAF AMD参考图谱）。插件将记录所标记区域的X和Y坐标、z分数（一种数值度量，用于描述QAF值相对于自发荧光（AF）图谱平均值的标准差倍数）、平均强度值、标准差以及标记的像素数量。该工具还可计算所标记病灶边缘区域的z分数。 这一工作流程及分析工具将有助于加深对AMD发病机制的理解，并提升临床AF图像解读的准确性。

引言

眼底自发荧光（FAF）成像可对眼底自然存在或病理状态下出现的荧光团进行无创性成图¹。最常见的蓝光（488 nm 激发）自发荧光（AF）可激发视网膜色素上皮（RPE）中的脂褐素和黑色素脂褐素颗粒^2,3,4。这些颗粒的分布及其增加或减少在正常衰老过程以及多种视网膜疾病（包括年龄相关性黄斑变性（AMD））中起着核心作用⁵。

FAF 的进一步发展——定量眼底自发荧光（QAF）——现在可实现对视网膜自发荧光强度进行准确的地形定位分析^4,6。通过在 FAF 成像设备的光路中引入参考标准，可在不同设备、不同时间点及不同受试者之间比较自发荧光强度。该技术促使人们对年龄相关性黄斑变性（AMD）中一个假定的致病因素产生了范式转变，长期以来该因素被认为是由视网膜色素上皮（RPE）细胞中脂褐素过度积聚所致⁷。然而，组织学和临床的自发荧光定量研究表明，AMD 中的自发荧光实际上是降低的（这是由于自体荧光性脂褐素和黑素脂褐素颗粒的重新分布和丢失），而非先前推测的升高^8,9,10。

监测房颤具有临床意义。Von der Emde 等人及其他研究者已表明，在高风险的中晚期年龄相关性黄斑变性（AMD）患者眼中，房颤不仅降低，且随着 AMD 病程进展进一步下降。^8,9此外，组织学研究表明，大多数受年龄相关性黄斑变性（AMD）影响的视网膜色素上皮（RPE）细胞在RPE细胞丢失之前，会表现出颗粒聚集和外排的特征性行为。 通过 下陷、脱落、迁移或萎缩^13,14,15,16这进一步表明，房颤的丧失可能是疾病进展的触发因素或替代性信号。

迄今为止，自发荧光（QAF）研究仅使用预制的网格极坐标系统（如QAF8/Delori网格）在全球范围内评估后极部的自发荧光¹⁷。采用预制网格测量自发荧光会导致每位受试者每只眼的预定区域产生多个自发荧光值。以这种方式分析自发荧光值可能遗漏具有病理性改变的局部区域中的变化，例如年龄相关性黄斑变性（AMD）中位于或邻近玻璃膜疣或视网膜下玻璃膜疣样沉积物（SDDs）的区域。尤其是SDDs，与进展为晚期AMD和视力丧失的高风险相关。特别是玻璃膜疣通常在多年内逐渐增大，并可能在萎缩发生前迅速恶化。可以设想，在AMD中，整体自发荧光可能降低，但在这些特定的疾病相关局灶性病灶内部及周围，自发荧光可能升高，或进一步降低。

不同的局部自发荧光（AF）模式也可能对疾病进展具有预后意义。例如，自发荧光水平可用于评估玻璃膜疣是否在增大，或是否已进入萎缩消退阶段。已有研究表明，地图样萎缩病灶周围异常的AF模式在很大程度上会影响萎缩随时间的进展过程¹⁸。此外，局部自发荧光模式还可进一步揭示视网膜色素上皮（RPE）的健康状况。很多时候，光学相干断层成像（OCT）显示脉络膜毛细血管层出现高反射信号，而RPE层看似完整。结合局部定量自发荧光（QAF）数值与OCT的多模态方法，可能有助于区分那些具有高风险RPE破坏及即将发生萎缩的病灶。

在研究中未进行空间分辨分析的原因之一是，最常用的制造商软件未提供用于此类分析的工具。不同病变的自发荧光（AF）特性随年龄相关性黄斑变性（AMD）疾病阶段而变化，这可能进一步解释AMD的发病机制。因此，开发一种能够测量区域性、病灶特异性自发荧光的工具将具有重要意义。为了准确比较位于视网膜不同区域的病灶，该工作流程需要能够校正人眼眼底自发荧光程度的差异¹⁹。其中，黄斑中心区域的自发荧光通常较低，这主要是由于黄斑色素的遮蔽效应以及颗粒数量的差异所致^20,21。

自发荧光（AF）在距黄斑中心凹约9°处（即各个方向上到中心凹的距离）达到峰值，并在更远的周边区域显著减弱⁴。因此，若直接比较来自软性玻璃膜疣（位于黄斑中心凹及旁中心凹低AF区域）和SDDs（位于旁中心高AF区域）的AF绝对值，所得结果将不具备可比性²²。受Pfau等人研究以及敏感度损失概念（在年龄相关性黄斑变性[AMD]中，将健康对照组的视野隆起区[即视网膜敏感度随距中心凹距离增加而下降]进行校正，用于眼底控制性视野检查）的启发，本研究将AF值与整个黄斑区内标准化的AF值进行比较^23,24。结果以z分数形式报告（即感兴趣区域数值相对于均值的标准化数值度量）。

本研究旨在评估一种新工具在测量年龄相关性黄斑变性（AMD）患者不同类型病灶局部定量自发荧光（QAF）水平中的应用。该工具用于测量在光学相干断层扫描（OCT）图像上识别出的病灶的自发荧光水平，从而实现对软性玻璃膜疣或小玻璃膜疣沉积物（SDDs）等病灶局部自发荧光水平的评估，并可追踪病灶随时间推移的自发荧光变化。该工具的潜在价值在于提供一种新的结构生物标志物，用于评估视网膜色素上皮（RPE）的健康状况，并可能对所研究的病灶具有预后意义。

方案

本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了波恩大学伦理委员会的批准（方案编号 305/21）。所有参与研究的受试者均签署了书面知情同意书。我们要求视频中的所有参与者签署授权表，允许我们在制作在线视频时使用其肖像和个人信息。

1. 定量自发荧光（QAF）图像采集

1. 使用QAF设备进行准确图像采集时，确保受试者舒适地坐在设备前方。让受试者将下巴和前额紧贴下颌托和头托。调节下颌托的高度，直至外侧睑裂角与红色标记处于同一水平。
2. 通过旋转记录设备上的转轮，使近红外模式下的图像聚焦，直至小血管清晰可见。通过向前移动相机来放大眼部图像，直至图像四角照明均匀。通常情况下，将焦点调整至球镜等效度数。在进行QAF成像前，将焦点减少一到两个屈光度，因为蓝色QAF使用较短波长的光，并将QAF设备的模式从近红外模式切换至QAF模式。
3. 重新调整并增强照明亮度，微调图像焦点，直至靠近黄斑中心凹的小血管清晰聚焦，且图像明亮均匀，无红点出现（红点提示照明过强）。在图像采集前，至少在QAF模式下等待30秒以漂白视色素，使持续的蓝光激发能够漂白相机视野内感光细胞中的色素。
4. 采集图像时，按下成像设备触摸板上的图像采集按钮；为防止采集过程中受试者眨眼或眼球突然移动，应确保采集多于一张的QAF图像。
   ​注意：该工作流程还需光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）图像。OCT图像采集方法在其他文献中已有详细说明，因其在临床实践中广泛应用²⁵。

2. 图像导出

1. 对于此分析流程，需确保自发荧光（QAF）和光学相干断层扫描（OCT）图像为可扩展标记语言（XML）文件格式。在 HEYEX viewer 中，右键单击目标 QAF/OCT 图像，然后从下拉菜单中选择 导出 | 为 XML 格式。

3. 用于 QAF 分析的开源插件——安装流程

注意：所展示的 QAF 软件是一个名为 "Spectralis pipeline" 的开源插件，专为开源软件 ImageJ（FIJI 扩展）开发²⁶。

1. 要访问插件，请打开 FIJI，从下拉菜单中选择 帮助，然后选择 更新，接着点击 管理更新站点，将 Creative Computation 更新站点 "https://sites.imagej.net/CreativeComputation/” 添加到现有的更新站点中。
2. 下载插件后重新启动 FIJI。此时，Spectralis 流程已安装完毕。不同的 Spectralis 插件位于下拉菜单 插件 | Spectralis 或 插件 | SpectralisBatch 中。

4. 设置——数据存储

注意：为了实现顺畅的工作流程，建议按以下方式设置文件夹结构。首先，为每位研究对象建立一个文件夹。Oculus dexter（OD）和 oculus sinister（OS）分别表示右眼和左眼，这些缩写将在整个工作流程中使用。

1. 对每位受试者的每只被检眼，分别建立一个 OCT 文件夹，命名为 OD_OCT 和 OS_OCT。让 Spectralis 流程自动将其 "Mark_BScans_OCT" 插件的输出结果以制表符分隔值的形式保存在这些文件夹中。
2. 对于 QAF 图像，创建两个文件夹，分别命名为 OD_QAF 和 OS_QAF。
3. 若使用其他多模态成像方式，需创建额外的文件夹。确保最终的文件夹结构与下列结构相似：
   CASE_ID
   OD_OCT
   OD_QAF
   OD_other_imaging_modality
   OS_OCT
   OS_QAF
   OS_other_imaging_modality

5. 将 QAF XML 文件转换为 QAF 图像（使用的插件：QAF_xml_reader）

1. 光谱仪QAF XML导出文件以红-绿-蓝（RGB）格式存储，其数值范围限定在0至255之间（代表测得的自发荧光值），并包含"标准"和"黑场"校准区域。"QAF_xml_reader"插件用于生成QAF图像。操作时，请打开插件下拉菜单，选择光谱仪 | QAF_XML_Reader，然后关闭初始显示界面。
2. 将弹出一个新窗口，提示请选择包含光谱仪XML QAF导出文件的目录：。选择相应的目录，然后点击选择。
3. 输入QAF设备的参考校准因子（RCF，可在QAF图像的信息中找到）以及拍摄图像时患者的年龄。
4. 下一个窗口名为QAF参数。若患者在图像采集时为人工晶状体眼，则应选择年龄20岁（这相当于不进行年龄校正）。点击确定后，当出现标注为映射至8位的弹窗时，请输入用于生成彩色编码QAF图像的最小QAF值（qafMin）和最大QAF值（qafMax）。如果qafMin和qafMax未知，可使用默认设置，点击确定，并观察随后出现的标注为原始QAF数据的图像，以及32位QAF图像和8位彩色编码QAF图像。
   ​注意：彩色编码的QAF图像仅用于示意图展示；进一步分析应使用包含实际QAF数值的32位QAF图像。

6. 使用插件 Register_OCT_2 将 QAF 图像与 OCT 图像配准

注意：此步骤需要准确对齐OCT图像与QAF图像，以确保QAF图像中的病灶与OCT B扫描图像中的病灶位置一致。

1. 通过下拉菜单访问该插件 插件 | Spectralis，或创建一个快捷键以访问所使用的不同插件。为此，请选择 注册_OCT_2 在……下方 插件 | 快捷方式 | 添加快捷方式 并选择 期望的快捷键.
2. 打开插件后，点击 好的 在第一个出现的窗口中。接下来，会出现一个包含提示的窗口： 选择包含 Spectralis OCT XML 导出文件的目录： 将在主 ImageJ 窗口中显示。选择包含该文件夹的 Spectralis OCT XML 导出 并点击 开放.
   注意：OCT 现在将开始加载，具体时间取决于所用计算机的处理能力，可能需要长达 2 分钟。
3. 接下来，等待出现包含提示的窗口 保存已注册的图像至： 弹出。选择目录所在的位置 EnFaceStack （对齐后的图像文件）将被保存，然后单击 开放.
4. 等待出现包含提示的弹出窗口 选择要添加到 EnFaceStack 的图像： 以显示，请选择 32位 QAF 图像 与SD-OCT图像对齐，然后单击 开放. 如果本实验所需的全部图像均已 EnFaceStack 包括在内，选择 取消.
5. 当下一个窗口提示用户选择标签时 EnFaceStack，选择预设的 QAF 标签；或者，在“其他”框中输入所需模态名称。选择 好的 以完成图像配准。
   注意：请勿在其中包含空格或其他标点符号 其他 领域
6. 观察弹出的三个窗口。第一个窗口标有 定位器 并显示SD-OCT作为 左眼（OS） 图像。第二个窗口命名为QAF，或之前选择的其他一种模式，作为原始的左眼（OS）或右眼（OD）。最后一个窗口称为 标志物，要求选择 一到三个解剖标志点 在每张图像中。
7. 通过选择每幅图像中的一个至三个标志点（如血管分叉或其他两种模态均可见的特征）来对齐两幅图像。放大（使用 " +" 键盘字符可放大 " -" 在选择标记点之前，先缩小图像视图。确保所选标记点在图像中于垂直和水平方向上均分布均匀。完成所有标记点的标注后，选择 好的 在 标志物 标签和 取消 在下一个提示中。
8. 当出现提示窗口时 您想查看结果吗 出现，选择 是 检查图像是否已正确对齐。通过放大一个小血管，将光标置于其旁边，然后向上或向下滚动，观察该血管相对于光标移动的程度来判断对齐情况。如果对齐不精确，请删除该 ".tiff" 在 OD_QAF 目录中创建文件，并从第 2 步的起始位置重新启动该流程。
   ​注意：由于 Mark_BScans_OCT 上的标记必须精确，SD-OCT 图像与 QAF 图像之间的对齐也必须非常准确。大多数图像可实现逐像素对齐，但在某些情况下，对齐精度仅能控制在三到四个像素范围内。

7. 创建平均QAF图像以进行比较（使用的插件：StandardRetina/BatchStandardRetina）

注意：自发荧光量子产率（QAF）值高度依赖于视网膜位置（例如，黄斑色素引起的中心区域遮蔽效应）。因此，应将玻璃膜疣的QAF值与同一区域的标准QAF值进行比较。作为分析的前提条件，StandardRetina 会生成平均QAF图像的 enface 图谱（例如，来自年龄匹配的对照队列）。所得到的 enface 图谱显示了中央视网膜每个像素的平均QAF值分布图。

1. 在Spectralis工作流程中有两种创建标准视网膜的方法：第一种， AddToStandardRetina_OCT，每次允许向层面图添加一个新病例，而第二种方法 批次标准视网膜，一次性添加多个案例。
   1. 一次添加一张图片，请选择 插件 | Spectralis | AddToStandardRetina_OCT 并关闭初始界面。当弹出窗口显示文本时 选择包含 Spectralis OCT XML 导出文件的目录，选择 文件夹 并点击 选择 打开BScan。
   2. 当一个新窗口出现并显示提示时 选择包含已注册 EnFace 图像的目录：，选择 相应的文件夹 并单击 选择.
   3. 观察弹出的三个窗口，其中一个标有 EnFaceStack 显示在第二步中所选文件夹内的堆叠图像，第二个标记为 B扫描堆栈 显示OCT B扫描图像，以及中间出现的第三个窗口，标注为 选择成像模式. 从以下选择一种成像模式 EnFaceStack.
   4. 选择一种模式，并观察弹出的新窗口中的提示 选择一个目录 含有 标准视网膜包含一个目录的 标准视网膜 尚不存在时，选择一个空文件夹以创建新的 标准视网膜.
   5. 检查新的 标准视网膜，上下滚动并移动光标以查看该特定位置的均值和标准差。点击按钮 接受？ 将最新照片添加到 标准视网膜 或丢弃。
2. 要同时添加多张图片，请使用 批次_QAF_标准视网膜.
   1. 首先，准备一个 "manifest.txt" 与病例编号位于同一文件夹中，并确保其列出 相对路径 从 .txt 文件的位置到 OCT 以及 EnFaceStack用一个将两者分开 制表符空格 并确保名称前后没有多余的空白。文件应类似于以下设置：
      pathToOCT_1>pathToEnFaceStack_1>001/OD-OCT>001/OD-QAF
      pathToOCT_2>pathToEnFaceStack_2>002/OD-OCT>002/OD-QAF
   2. 在电子表格软件中创建文件，并将其另存为 txt 文件确保所有路径均包含该切片（字符字母） QAF 以确保清单文件正常运行。插件位于下拉菜单中 插件 | SpectralisBatch-批量 | QAF_标准视网膜.
   3. 关闭启动界面，并等待新窗口打开以显示提示 选择初始标准视网膜. 选择一个包含预先存在文件的文件夹 标准视网膜 或选择一个空文件夹以创建新的 标准视网膜.
   4. 查找标记为的提示 选择成像模式 将要出现；默认为 QAF. 确保各模态的文件名与每个切片的文件名完全一致 EnFaceStack 在清单文件中命名。接下来，当弹出窗口提示用户选择清单文件（如前所述）时，若无需向此次操作添加其他清单文件，请点击取消 标准视网膜 或选择另一个清单文件。检查新的 标准视网膜 在名为的新窗口中 接受？，并决定是否将最新一批加入 标准视网膜 或丢弃最近的一批。
      注意：将所有QAFs组合在一起的过程 标准视网膜 可能需要一些时间。

8. 用于分析的感兴趣区域标注（所用插件：Mark_BScans_OCT）

1. 标记病灶（如玻璃膜疣），打开 插件 | Spectralis | 标记_B扫描_OCT 并关闭初始提示。查找一个标有 选择包含 Spectralis OCT XML 导出文件的目录 待出现。选择包含所需 OCT 的文件夹并点击 好的.
2. FIJI 加载 OCT 后，观察带有标签的新窗口 选择包含已配准的平面图像的目录 出现。选择包含该目录的 EnFaceStack 并点击 选择.
3. 现在会出现三个新窗口，其中一个标有 EnFaceStack，一个标记的 B扫描图像序列，以及一个命名为 用户参数.
   1. 的 用户参数 窗口会提示用户输入以下参数： 病例编号，该内容将出现在输出的 CSV 文件名中 带宽（毫米），the 表面线宽，该 B扫描线宽度，以及 区域遮罩不透明度.
      1. 参数 带宽（毫米） 以毫米（mm）为单位确定每个等值轮廓的宽度。使用 Enface 线宽 更改标记病变在标注窗口中的线宽 EnFaceStack.
      2. 的 B扫描线宽度 确定窗口中的线条宽度 B扫描序列请注意将此参数设置为 1 在大多数情况下，这是最佳的线宽设置。
      3. 在……之间选择 正面遮罩 或 a 距离图 在单独的窗口中显示，以确定内部条带是否需要着色。然后，单击 完成 在 B扫描标记 插件中的窗口。
   2. 接下来，当被要求选择一个现有的 标准视网膜，选择包含该文件的文件夹 标准视网膜 并点击 选择请注意，如果一个 标准视网膜 被选中时，输出 Mark_BScans_OCT 将选择模式 z分数 （测量得到的QAF值与 标准视网膜）。如果 原始QAF值 首选，点击 取消 并等待一个标有新窗口的出现 消息 警告 结果将为原始值，而非z分数.
4. 查找弹出的新窗口提示 选择包含已保存状态的目录 使用已保存的数据。如果保存文件存在，请单击 包含切片的目录 | 选择若不保存进度，请选择 取消. 寻找一个标有新窗口 B扫描中标记，然后从下拉菜单中选择 保存，忽略，完成，以及 标记.
   1. 马克： 开始使用与在BScan中相同的命令标注感兴趣区域 "注册_OCT_2" 如上所述的插件。要标记一个区域，请选择 开始 通过右键单击并拖动鼠标光标至病灶末端，确保 标记 被选中在 B扫描中标记 窗口，然后单击 好的该感兴趣区域现已在此BScan中标记。
   2. 忽略： 选择 忽略 在 B扫描标记 窗口并单击 好的 忽略标记。
   3. 保存： 选择 保存 在 B扫描标记 窗口并单击 好的 弹出一个新窗口，其中包含提示信息 选择一个目录以保存状态选择一个已存在的文件夹或创建一个新文件夹。通过启动来打开已存在的文件 "Mark_BScans_OCT" 并选择包含保存状态的目录 选择包含已保存状态的目录 窗口出现。
      注意：一个目录中无法存储多个保存状态；不同区域之间的保存状态无法轻松切换（例如，从德语到美国）。
   4. 完成： 选择 完成 在 B扫描中标记 窗口并单击 好的 创建一个带有标签的新窗口 选择成像模式 出现。
   5. 当一个标记为 将正确的成像模式置于 enface 图像序列的顶部 出现，启动称为 QAF 上方，使用对齐 "注册_OCT_2". 通过滚动页面来完成此操作 EnFaceStack，选择 正面堆栈 窗口，或单击 左侧 或 右箭头请注意，模态名称显示在左上角。
   6. 为了更清晰地观察和标记病灶，放大B-scan窗口。点击 B超扫描 窗口中，将鼠标指向要放大的方向，然后按下 + 要缩小，请按 - 键。
   7. 滚动浏览 B扫描 通过滚动鼠标上下移动来逐层查看，或拖动底部的滑块左右移动以浏览扫描图像，或通过选择 B超扫描 帧并点击 左侧 和 右箭头 键盘上的按键。请注意，当前区域的概览 B扫描 堆栈由红线提供 EnFaceStack 窗口，位于左上角的 B扫描 显示BScan编号（例如，31/120）的窗口。
5. 点击 好的 创建一个新的 .tsv 文件到相应位置 "OD_OCT" 或 "OS_OCT" 文件夹。请注意，.tsv 文件的文件名将由 "标记_B扫描_OCT" 以及在 Mark_Bscans_OCT 的最后一步中输入的病例 ID、侧别和选择的模态。此外，采用彩色编码 "等值船体" 玻璃膜疣的尺寸现在将显示在 EnFaceStack.

结果

查看输出结果
为了充分分析结果并得出结论，理解 Mark_Bscans_OCT 的输出文件至关重要。前三个列分别标注为病例编号、文件的眼别以及所选择的成像模式。第四列称为模式，标记为z分数。请注意，截至撰写本文时，Mark BScans 仅能一次性计算所有病灶；各行对应的是等值壳层（iso-hulls），其距病灶外缘的距离由电子表格中的下限和上限列指定。等值壳层用于测量病灶周围特定周长范围内的自发荧光（AF）z分数（在定量自发荧光QAF情况下）。请注意，等值壳层中像素的最小值可在标记为min的列中找到，而标记为median、max、mean和stdev的列则分别包含该等值壳层内像素值的中位数、最大值、均值及均值的标准差。n列包含一个等值壳层内的像素总数。图1展示了一名84岁男性中间期年龄相关性黄斑变性（iAMD）患者单个标记的软性玻璃膜疣。

图2 显示了一位代表性患者的左眼，其中使用 QAF-Workflow 工具标记了 SDD（图3）。该患者的 SDD 与降低的自发荧光（AF）相关（z 值 = -0.4 ± 0.2）。类似地，SDD 周围的等值轮廓区域也显示出较标准视网膜降低的 AF 水平（例如，最近的等值轮廓区域 = -0.3 ± 0.3）。这一现象可能的解释是 SDD 病变对视网膜色素上皮（RPE）产生的遮蔽效应（透光性降低）。SDD 的应用具有示范性。该工具还可用于评估其他病灶（如玻璃膜疣）的局部 AF 水平。此外，该工具还能够追踪病灶随时间推移的 AF 变化情况。

图1：一名84岁男性中度年龄相关性黄斑变性（iAMD）患者单个显著软性玻璃膜疣。（A）左眼带有标记玻璃膜疣的自发荧光（QAF）图像。（B）玻璃膜疣的放大图：棕色中心代表显著的玻璃膜疣，彩色条带表示周围的等值轮廓（iso-hulls）。下表显示输出文件内容。QAF玻璃膜疣数值与标准视网膜（StandardRetina）中相应偏心度的QAF值进行比较，从而得到z分数，表示与无病变区域均值的偏离程度。蓝色框从左到右显示：病例编号、眼别、所用成像模式以及所需输出结果（本例为z分数）。橙色框内的列表示测量区域的边界（单位为毫米，lower = 下限，upper = 上限）。绿色框标注了QAF测量值的列，从左到右依次为：最小值、中位数、最大值、像素数量、均值及均值的标准差。每一行代表一个等值轮廓（iso-hull），蓝色框内的行表示病灶内部的数值，紫色框内的行表示围绕每个病灶的等值轮廓（由上至下，距病灶距离递增）。比例尺 = 1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：一名80岁女性早期年龄相关性黄斑变性（AMD）患者定量自发荧光（QAF）图像中标记的视网膜下细小沉积物（SDD）。（A）QAF图像中可见SDD。同一QAF图像显示了SDD的叠加标注。（B）在每个标记病灶周围，以颜色编码方式描绘了等值轮廓（浅绿色、深绿色和红色）。（C）蓝色矩形区域的放大图。每个SDD的外缘以蓝色标出。缩写：QAF = 定量自发荧光；AMD = 年龄相关性黄斑变性；SDD = 视网膜下细小沉积物。比例尺 = 1 mm。请点击此处查看该图的高清版本。

图 3：确定病灶 AF 的工作流程。 本图展示了用于确定病灶特异性 AF 所需的软件插件。（A）图像显示了一幅按颜色编码的 QAF 图像，可用于可视化 QAF 值的分布情况，但不应将其用于进一步分析。（B）显示了前景为 QAF 图像、背景为 SD-OCT 扫描的红外图像。该图旨在展示如何利用血管分叉点进行图像配准，此步骤可使用 Register_OCT_2 插件完成。（C）所示为用于测量病灶 z 分数的 StandardRetina。StandardRetina 可通过 StandardRetina/BatchStandardRetina 生成。（D）一幅 B 扫描图像，蓝色箭头指向 SDD，黄色线条对其进行了高亮标注（注：无论在 z 方向上的具体位置如何，病灶始终标记在 RPE 下方）。 （E）所有已标记的病灶均被叠加显示在一幅 QAF 图像上（见图 1）。最后两个步骤通过 Mark_BScans_OCT 插件完成。缩写：AF = 自发荧光；QAF = 定量自发荧光；SDD = 视网膜下软性玻璃膜疣沉积物；IR = 红外；RPE = 视网膜色素上皮；SD-OCT = 谱域光学相干断层扫描。请点击此处查看本图的放大版本。

讨论

本工作流程逐步指导如何使用开源的 FIJI 插件工具来测定和比较与年龄相关性黄斑变性（AMD）特异性病灶的自发荧光（AF）。这些插件提供了易于使用的模板，无需任何编程知识，医师可在无需技术支持的情况下独立应用²⁷。据我们所知，这些工具是目前唯一可用于病灶特异性自发荧光定量分析的工具。

定量自发荧光（QAF）值在视网膜上自然存在差异，由于视网膜内脂褐素和黑色素脂褐素分布不均、血管自发荧光较低以及黄斑色素分布不均，周边部QAF值较高，而黄斑区较低。由于视网膜中自然存在的QAF水平变异较大，直接分析病灶的绝对QAF值并非一种可靠的方法。例如，周边部的低自发荧光病灶其绝对QAF值仍可能高于黄斑区生理性的荧光水平。采用标准视网膜（StandardRetina）以及使用z分数来测量玻璃膜疣的荧光水平，可校正这种自然存在的QAF值变异。

z分数是一种用于衡量感兴趣区域的数值相对于标准视网膜（StandardRetina）均值关系的数值指标。其计算方法为：将个体在标准视网膜相同位置的数值减去该位置的均值，再将所得结果除以标准差。这种标准化方法使得不同QAF图像之间可以进行比较，因为z分数表示某一数值偏离均值的标准差数量。正的z分数表示该数值高于均值，而负的z分数表示该数值低于均值。

需要注意的是，可能存在一些应予以考虑的潜在问题。尽管该方法考虑了眼底不同区域自发荧光（AF）水平的差异，但它可能仍不是测量和比较视网膜色素上皮（RPE）自发荧光的最准确方法。个体之间黄斑部叶黄素色素的含量和分布存在差异，且病变可能影响覆盖其上的视网膜的透光性^28,29。因此，在玻璃膜疣样沉积物（SDD）区域测得的自发荧光降低（见代表性结果）可能是由于遮蔽效应所致，而非RPE内荧光团减少^30,31,32。

我们目前正在开发一种工作流程，利用线性混合模型来校正视网膜反射率、厚度以及黄斑色素的量化（使用绿色和蓝色自发荧光）。此外，目前的定量自发荧光（QAF）技术采用基于年龄的校正因子来校正晶状体混浊，但该方法忽略了同龄受试者之间晶状体混浊程度的个体差异³³。因此，我们正在开发一种针对个体化晶状体自发荧光和混浊的校正因子工作流程。为了可靠地从小病灶中提取自发荧光信息，需要具备足够的QAF图像的测试-重测可靠性。为进一步区分哪些QAF图像适合进行更详细的分析，我们正在研究"QAF图像可靠性指数"，以预测QAF图像的测试-重测可靠性。在现阶段，稳妥的做法是采集重复图像，并评估病灶特异性自发荧光的重测可靠性。

额外分析病灶等值壳（iso-hulls）的方法在技术上难以实现，因为邻近病灶的等值壳会发生融合。融合区域的等值壳可根据所考虑的病灶不同而表现出不同的特征。我们的解决方案是将同一类型的全部病灶视为一个整体病灶，并将其周围区域作为联合等值壳进行分析。然而，该方法显著降低了对单个玻璃膜疣（drusen）等值壳的测量能力，可能被视为该技术的又一局限性。未来若能采用更复杂的技术手段来处理融合的等值壳，或在融合区域暂停报告自发荧光（AF）信号，将有助于进一步推动病灶周围区域AF信号的分析。

本研究以年龄相关性黄斑变性（AMD）作为模型疾病，该工作流程也可用于研究其他疾病的病灶。迄今为止，定量自发荧光（QAF）已应用于多种脉络膜视网膜疾病，包括隐性Stargardt病、Bestrophin-1相关疾病、各种形式的视网膜色素变性、急性区域性隐匿性外层视网膜病变、弹性纤维假黄瘤以及其他疾病^{17,33,34,35,36,37}。由于该工作流程采用开源软件，我们鼓励其他研究者复制本研究方法，以确定特定病灶的自发荧光（AF）水平，从而拓展对视网膜疾病的认识。总之，我们提出了一种用于测定和比较黄斑区不同视网膜病灶AF水平的工作流程。该流程为深入分析AF特征奠定了基础，并可能促进AMD及其他视网膜疾病中新生物标志物的开发。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BatchStandardRetina 插件	n.a.	n.a.	n.a.
FIJI（Image J）	n.a.	n.a.	n.a.
Mark_Bscans_OCT 插件	n.a.	n.a.	n.a.
Microspft office	Microsoft	n.a.	n.a.
QAF_xml_reader 插件	n.a.	n.a.	n.a.
Register_OCT_2 插件	n.a.	n.a.	n.a.
Spectralis	Heidelberg Engineering	n.a.	QAF 扩展
StandardRetina 插件	n.a.	n.a.	n.a.