方法文章

改进的玉米叶原基横切面与展平全组织制片方法用于荧光及共聚焦成像

4.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65239

⸱

2023年9月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, School of Science and Engineering, Ateneo de Manila University, 2Division of Biological Sciences, Interdisciplinary Plant Group, and Missouri Maize Center, University of Missouri

本文内容

摘要

玉米叶片原基深陷于叶鞘中且呈卷曲状，难以进行研究。本文介绍了制备玉米叶片原基横切面和展平的整体装片的方法，适用于荧光和共聚焦成像。

摘要

在玉米（Zea mays）及其他禾本科植物（Poaceae）中，叶原基深陷并被包裹在叶鞘内，呈卷曲状态，这使得早期叶发育的研究十分困难。本文介绍了制备玉米叶原基横切面和展开的整体装片的方法，用于荧光和共聚焦成像。第一种方法使用剥线钳去除较老叶片的上部组织，暴露叶原基的顶端，以便准确测量并更精确地进行横切面取样。第二种方法使用透明双面纳米胶带将整个叶原基展开并固定，用于成像观察。我们展示了这两种方法在可视化和分析玉米中荧光蛋白报告基因表达方面的应用价值。这些方法解决了玉米叶原基独特形态结构所带来的技术挑战，将有助于在玉米及其他禾本科物种中对叶的解剖结构和发育特征进行可视化观察与定量分析。

引言

禾本科作物是全球人口重要的食物和生物燃料来源1，改良叶片解剖结构有望提高其生产力2,3。然而，目前对禾本科植物叶片解剖结构调控机制的理解仍然有限4，需要分析叶片原基，因为叶片的许多解剖和生理特征在发育早期就已预先决定5,6,7。细胞成像技术（如荧光成像和共聚焦成像）对于研究禾本科植物叶片解剖结构和细胞特征至关重要，但这些技术难以应用于禾本科叶片原基，因为它们深藏于叶鞘内并卷曲在叶环中。为解决这一问题，我们建立了制备玉米叶片原基横切面和展开的全叶装片的方法，用于荧光和共聚焦分析；玉米是研究禾本科植物叶片解剖结构与发育的模式系统2,8。

玉米叶片与所有禾本科植物的叶片一样，由带状的叶片和包裹茎秆及发育中茎尖的叶鞘组成9,10,11,12,13。叶片以对生排列方式从茎尖分生组织（SAM）发育而来，每片新叶在前一片叶的相对位置起始，从而在垂直轴上形成两列叶片（图1A）14。每个叶原基的发育阶段以其相对于SAM的位置来确定，最靠近SAM的原基称为 plastochron1（P1），随后的原基依次为P2、P3等（图1B,C）2。在发育过程中（图1D），叶原基最初在SAM基部呈新月形突起（P1），随后生长为覆盖分生组织的帽状结构（P2）9,10,11。帽状结构的基部边缘随后向两侧扩展并相互重叠，顶端向上生长，形成圆锥形原基（P3–P5）10。原基随后迅速伸长，在基部叶鞘与叶片交界处，随着叶舌的形成而变得更加明显；叶舌是叶片近轴面一侧的 fringe-like 突起结构（P6/P7）。最终，在稳态生长过程中，叶片从叶环中展开，此时细胞分裂局限于叶片基部较小的区域，沿近-远轴方向形成细胞扩展与分化的梯度（P7/P8）15。玉米幼苗的茎尖包含多个处于不同发育阶段的叶原基，是研究叶片发育的优良模型8。

准确分析叶片早期发育需要进行分期，或使用标准化标准，以根据其他生长或形态参数来定义原基发育的不同阶段。由于禾本科植物的叶原基隐藏在茎尖内部，研究者通常采用植株年龄或新出现叶片的大小等参数，作为预测叶原基所处阶段和大小的依据9,16。在玉米中，植株的时间年龄可通过播种或萌发后的天数（DAP/DAG）来确定17,18。营养阶段（V阶段）则由最上部具有可见叶环的叶片决定；叶环是叶片与叶鞘交界处远轴面的一条浅色线条，对应于叶舌和耳状体的位置，后者为叶片基部的一对楔形区域（图1A,B）17,19。在萌发后20至25天之间，茎尖分生组织（SAM）转变为花序分生组织，不再产生新的叶片20。玉米叶原基的生长速率可能因环境条件和植株基因型的不同而有所变化。因此，仅依靠植株年龄和新出叶片的大小无法准确预测叶原基的大小；然而，利用这些参数仍有助于在实验中预测叶原基所处阶段和大小的范围。

横切面分析是研究玉米及其他禾本科植物叶片解剖结构与发育的常用方法，因为它能够在单个切片中跨越茎轴取样多个叶原基发生周期（plastochron）21,22,23。该方法也便于对新鲜样品进行细胞成像，因为周围的叶片可作为支架，在切片和制片过程中使叶原基保持在原位24。然而，该方法的一个缺点是在对完整茎轴进行切片时，难以精确定位目标叶原基发生周期及原基内的特定区域。此外，由于叶片生长在不同叶原基发生周期以及近-远轴方向上存在差异2,5，取样不精确可能导致对切片中叶原基发育阶段和区域的错误判断。因此，建立一种精确的横切面取样方法，对于确保禾本科植物叶原基解剖学和发育分析的准确性与可重复性至关重要。

全叶表装片分析能够对发生在整个器官尺度上的组织和细胞过程进行综合而全面的研究，例如增殖性生长25和叶脉模式形成26,27,28。该方法提供了叶片的平行表面整体视图，有助于发现那些通过横切面分析难以察觉的独特过程和模式24,27。与拟南芥中已有成熟的全叶表装片成像方法29,30不同，目前尚无针对禾本科植物未展开全叶表装片成像的标准方法。先前一项关于展开分离玉米叶原基的实验方案涉及不常见的材料，且不适用于细胞水平的成像31。先进的成像技术，如计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI），可在无需分离和展开原基的情况下获取三维解剖信息11,32,33，但这些技术成本高昂且需要专用设备。开发一种能够克服玉米及其他禾本科植物叶原基卷曲和圆锥形态限制的技术，将推动对其解剖结构和发育特征的深入研究。

本文介绍了制备玉米叶原基横切面及展开的整体装片的方法，用于荧光和共聚焦成像。我们利用这些方法对玉米叶原基中的维管束数目进行定量，并利用荧光蛋白（FPs）24对激素在时空上的分布进行定位。第一种方法是使用剥线钳去除玉米幼苗上部较老叶片的顶端部分（图1E）。通过暴露叶原基（P5-P7）的顶端，可在不完全去除周围较老叶片的情况下测定其长度，从而实现简便而精确的切片操作。第二种方法是利用透明双面纳米胶带将整片叶原基（P3-P7）展开并固定（图1F）。这些方法适用于多种荧光蛋白24的观察，但若用于荧光染料和透明试剂则需要进一步优化。此外，我们还概述了在ImageJ/FIJI34中对z轴层扫图像进行展平、图像拼接和通道合并的一些操作流程，这些适用于上述两种方法所获得的图像。这些方法适用于玉米叶片的常规荧光或共聚焦成像，也可推广至其他模式禾本科植物，如水稻、狗尾草（Setaria）和短柄草（Brachypodium）。

共聚焦成像用植物切片制备示意图；显示叶片修剪、装片及图像处理步骤。
图1：玉米叶原基的结构与形态及实验方法概览。（A）玉米幼苗的示意图。玉米具有对生叶序，新叶在前一片叶的对侧位置起始发育。叶序编号表示自萌发以来叶片出现的时间顺序（即第一叶，L1；第二叶，L2；第三叶，L3；依此类推）。每片叶包括远端的叶片部分和基部的叶鞘部分，两者之间由叶环分隔，叶环对应于叶舌和叶耳。最上方可见叶环的叶片指示植株所处的营养生长阶段。本示例中的幼苗处于V2期，L2叶环（箭头）可见。剪刀图标表示需在中胚轴（me）处剪断幼苗以进行取材。（B）解剖后茎尖的示意图，显示分离出的L1至L4叶，而L5至L9叶原基在（C）中以放大图展示。叶原基的 plastochron 编号表示其相对于茎尖分生组织（SAM）的位置，最年轻的叶原基（P1）最靠近SAM，较老的叶原基（P2、P3、P4等）依次远离2。（D）玉米P1至P5叶原基形态的示意图。（E）玉米叶原基横切面分析方法的示意图概览。（1）使用剥线钳修剪较老的叶片。（2）测量叶原基并切割茎尖。（3）将切片置于载玻片上用于成像与后续处理（4, 5）。（F）玉米叶原基整体装片分析方法的示意图概览。（1）去除周围叶片以提取目标叶原基。（2）切开并将其平铺于纳米胶带上。（3）装片后进行成像与处理（4, 5）。缩写：L = 叶；bl = 叶片；sh = 叶鞘；co = 叶环；me = 中胚轴；V = 营养期；P = plastochron；SAM = 茎尖分生组织。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 玉米叶片发育的分期及实验设计

  1. 种植植物并确定叶片发育阶段
    1. 确定实验所用植物的年龄和发育阶段，并对叶片发育进行详细分期。
      注意：建议在与突变体或转基因品系相同遗传背景的植物上进行分期。根据遗传背景和生长条件的不同，茎尖分生组织（SAM）在播种后20至25天（DAG）之间停止产生新叶。因此，本文所述方法最适合用于7至14 DAG的玉米幼苗。
    2. 按照合适的植物养护方案，在温室或人工气候室中培养玉米植株35。
    3. 使用小刀或剪刀在中胚轴（mesocotyl）处切割，采集目标年龄或V期的植株，中胚轴是位于土壤表面以下的茎部（图1A）。将切割工具小心插入幼苗旁边的土壤中，并以45°角滑至基部，切断中胚轴。
    4. 将幼苗从土壤中取出，轻轻抖落附着在植株上的残留泥土或土粒。用手去除胚芽鞘（coleoptile），即幼苗初生茎所包裹的保护性鞘状结构。
    5. 对每株植物记录其V期、叶片数量以及从叶环中最新长出叶片的长度。拍摄植株照片以供后续参考。
    6. 逐个去除较老的叶片。操作时用手握住中胚轴或茎部残余部分，用牙科探针从叶鞘基部切除每片叶子，并以环形方式轻轻展开叶鞘（图1B）。
      注意：参见步骤2.1中关于快速去除周围叶片的方法。
    7. 在体视显微镜下（放大倍数约2倍），将剩余的茎尖在湿润的擦拭纸上进行解剖，以防样品干燥。使用带弯针的牙科探针或精细镊子，小心地逐个切除并展开叶原基，直至茎尖分生组织（SAM）、P1和P2清晰可见（图1D）。记录每个叶 plastochron 的形态特征及其测量数据。
      注意：参见补充文件1中玉米幼苗叶片发育分期的示例。
  2. 实验设计
    注意：仔细规划实验可提高效率。例如，在横切面分析中，预先确定成像特定 plastochron 或区域时的大致切割位置，可减少解剖时间。图2展示了标准化取样的一个示例。此外，根据荧光蛋白（FP）或荧光探针的特性优化成像参数，也可提升实验效率。
    1. 利用分期信息作为指导，将实验聚焦于特定的 plastochron、原基区域和组织。使用感兴趣的荧光蛋白（FP）或其他荧光探针，在少量样本上参照下文第2和/或第3节进行操作。
      注意：可在 https://www.maizegdb.org/data_center/stock 查询现有的玉米荧光蛋白标记品系36-42的种子资源。
    2. 为每种FP报告基因或探针确定最佳图像采集参数，包括合适的检测器或滤光片、激发和发射波长、针孔大小及其他设置。保存这些参数，以便在后续实验中重现相同的工作条件。
      注意：有关发育中叶片共聚焦激光扫描显微镜操作的技术指南，参见 Linh 和 Scarpella30。
    3. 根据FP报告基因的半衰期及其他特性规划成像时间43。
      ​注意：在实验设计时还需考虑从解剖到成像之间的时间间隔，因为新鲜植物样本在此期间可能发生脱水及细胞结构变化。

植物发育阶段示意图及横切面图像，突出显示生长区 P3-P7。
图 2：玉米叶原基横切面分析的取样方案。（A，左）7 DAG（萌发后天数）玉米幼苗的近端茎部，显示处于 P7 阶段的第四片叶（L4）。虚线表示沿叶原基分布的七个取样点，从 0.5 mm 到 10 mm。（A，右）叶原基的示意图，展示每个叶龄期（plastochron）的预期大小和位置：P7（白色）；P6（洋红色）；P5（蓝色）；P4（绿色）；P3 至 SAM（黄色）。（B-H）代表图 A 中取样点的横切面荧光图像，从 10 mm（B）到 0.5 mm（H）。叶原基根据图（A）中的叶龄期颜色方案进行伪彩着色。切片使用落射荧光显微镜配合长通发射紫外滤光片检测自发荧光成像。比例尺 = 200 µm（B-H）。本图经 Robil 和 McSteen24 许可修改并重印。缩写：DAG = 萌发后天数；P = 叶龄期；SAM = 茎尖分生组织；† = 叶鞘或前叶舌区；* = 茎尖分生组织；** = 茎。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 玉米叶原基横切面成像

  1. 去除较老的外围叶片并测量叶原基
    1. 按照步骤 1.1.3-1.1.4 所述，用小刀或剪刀在土壤表面以下的中胚轴处小心地切割，采集幼苗（图 1A）。
    2. 确定应使用的剥线钳孔径大小以及在茎上进行切割的位置。确保孔径足够大，能够容纳目标原基。
    3. 从茎的更远端开始切割，并逐渐向基部推进，直至暴露出原基的顶端。
    4. 进行切割时，手持剥线钳，使钳口朝向茎部。将茎插入选定的孔中，并挤压剥线钳手柄以切断叶鞘层。
      注意：为避免意外切断目标原基，需仔细对齐茎的中心与剥线钳的孔中心。对于较大的植株，建议在使用剥线钳前先手动去除部分周围叶片。
      注意：剥线钳钳口锋利，若使用不慎可能导致割伤或其他伤害。
    5. 在持续挤压手柄的同时，将剥线钳从茎部向外滑动，以修剪叶片的上部。确保原基中的目标区域仍被周围叶片包裹（补充图 S1C,D）。
      注意：修剪上部叶片后，茎部将暴露出一个原基顶端（P5、P6 或 P7，具体取决于切割位置和所用剥线钳孔径；图 1E）。该原基将作为估算更年轻原基大小和发育阶段的参考。由于其尺寸范围和针状形态，P6 是玉米幼苗中最实用的参考原基。
    6. 使用直尺测量从原基顶端至茎基部的长度，并记录测量值。
      注意：由于原基基部存在几毫米的茎段，原基长度会略微被高估（图 2A）。
  2. 叶原基的手工切片与成像
    1. 在体视显微镜下（约 0.8 倍放大倍数），将茎固定在光滑表面上（如玻璃切片板或其他耐刮擦材料），使用剃刀刀片或解剖刀在原基长度方向上的目标位置切取薄片（0.25–0.8 mm）。
    2. 首先在目标区域稍上方进行初步切割，弃去茎的远端部分，然后在目标区域附近获取薄切片。为获得干净的切面，应将刀片垂直于茎部，并以平稳均匀的动作向内滑动刀片。
      注意：对于较大的原基（P6 或 P7），切片位置可有几毫米的容差。但对于较小的原基（P5 及更早阶段），1 mm 的差异可能显著影响取样，因为这些原基在茎基部最初几毫米内紧密堆叠（见 图 2A、F-H）。建议使用双刃剃刀刀片以实现更精细的切片。
      注意：使用剃刀刀片和解剖刀时需格外小心，避免意外割伤或受伤。
    3. 定期更换剃刀刀片，因为叶鞘容易使刀片变钝。每次切片后，用湿润的擦拭布覆盖茎部，防止样品干燥。
    4. 将叶切片置于洁净的载玻片（75 mm × 25 mm）上，用移液器滴加一滴水（或 50% 甘油）至切片上，然后盖上盖玻片（22 mm × 22 mm）。
    5. 若使用荧光染料，将染料溶液滴加至切片上，盖上盖玻片，并根据需要进行孵育。
      注意：根据染料类型，在进入下一步之前，可能需要对叶切片进行额外处理步骤。参考文献44、45、46、47 提供了荧光染料在植物细胞成像中的一般细节和应用。核染荧光染料 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）已在玉米叶原基横切面上有效应用48。相比之下，细胞膜染色染料（如 Fei Mao 4-64（FM 4-64）和碘化丙啶）效果不佳（图 3A-D）。
    6. 将载玻片置于落射荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜的载物台上，根据需要调整焦距和设置以观察荧光团30。有关所选玉米荧光蛋白报告品系的照明和图像采集参数，请参见 表 1。
      注意：厚切片可能产生较强的背景自发荧光。可考虑采用一些成像和样品制备策略以缓解此问题30、49（见 表 2）。
      注意：使用强光源和激光时需谨慎，并佩戴护目镜，以降低眼部损伤风险。
    7. 在不同放大倍数和检测通道（包括明场照明）下对叶切片进行成像30。使用 4 倍放大倍数 对整个横切面成像，使用 20 倍 或 40 倍 放大倍数对特定组织成像。在落射荧光成像中，为保护样品免受快速光漂白，应在较高放大倍数下缩短曝光时间（见 表 1）。
    8. 采集整个切片或特定感兴趣区域（ROIs）的图像。如有必要，采集 z-堆栈图像，即在不同焦深下获取的一系列图像30。
    9. 为采集 z-堆栈，首先确定样品中上下两个位置，然后确定这两个位置之间需采集的光学切片数量。光学切片数量越少，z-步长（即各切片之间的距离）越大。根据荧光蛋白的特性和所用放大倍数，采集 3 至 25 个光学切片，z-步长在 1 至 12 µm 之间，用于成像玉米叶原基的横切面。
      ​注意：为展平 z-堆栈，可使用适当的体绘制技术50，该操作可通过显微镜软件或 ImageJ/FIJI34 实现（见步骤 4.1 和 4.2）。
    10. 保存所有图像文件及其相关元数据（如可用）。

表1：用于选定玉米荧光蛋白报告基因的荧光与共聚焦成像的照明及图像采集设置。 缩写：FP = 荧光蛋白；TRITC = 四甲基罗丹明；FITC = 异硫氰酸荧光素；WLL = 白光激光器；Ar-ion = 氩离子激光器；HyD = 混合探测器；AU = 艾里单位；Hz = 赫兹，每秒扫描线数。请点击此处下载该表格。

3. 玉米叶原基整体铺片的成像

  1. 解剖原基并用纳米胶带制备玻片
    1. 用小刀或剪刀按照步骤1.1.3–1.1.4所述，在土表下方的中胚轴处小心切割，采集幼苗图1A).
    2. 准备载玻片（75 mm × 25 mm），并贴上透明双面纳米胶带（补充图 S1H在解剖植物之前，剪取一块矩形的纳米胶带，将其粘贴到洁净的玻璃载片中央。不要移除胶带上表面的保护性塑料薄膜。
      注意：根据待成像样本的大小确定所用胶带的尺寸（参见超大样本示例 补充图 S1I,J）。纳米胶带有丙烯酸或聚氨酯凝胶材料两种类型。两种类型均适用于荧光和共聚焦成像24为防止胶带变色，应将其存放在避光容器中，避免长时间暴露于光照下。
    3. 按照步骤2.1所述，使用剥线钳切除老叶的上部，开始对茎进行解剖。
    4. 用牙科探针夹住胚轴并小心去除周围的叶片以提取原基。操作时，从茎基部开始逐片剥离叶片并展开，直至目标原基暴露。
    5. 或者，使用剥线钳在茎基部进行切割，直接提取叶原基（补充图 S1E-G).
      注意：该方法存在较高的原基断裂风险。
  2. 原基的固定与成像
    1. 移除胶带上的保护膜。将暴露的原基置于胶带上。使用剃刀刀片在原基基部进行切割，弃去基部茎段和下胚轴。图1F).
    2. 使用牙科探针配合弯针（针尖直径为0.25–0.6 mm）将原基展开。对于小于3 mm的原基（P3至早期P4），应使用微探针（针尖直径为0.15–0.2 mm）。
    3. 将针尖与表面平行放置，展开外基底边缘，轻轻按压使其贴附于胶带。
    4. 为使叶片更顺畅地展开，可将针尖浸入100%甘油中，然后润滑叶片内表面（近轴面）。
    5. 将针尖与叶片的长轴平行，外缘贴附在胶带上，轻轻侧向滑动针尖，使叶片在胶带上展开并展平（图1F).
      注意：在展开过程中叶片破裂或受损较为常见，尤其是在具有粗壮中脉的较大原基中（参见 图3E- G）。用力展开叶片可能会损伤其表面，并在成像过程中产生伪影（图 3H）。参见 表2 以及针对这些问题推荐解决方案的讨论。
    6. 在未展开的叶原基上滴加一滴水。立即将盖玻片覆盖在水滴和叶原基上。轻轻按压盖玻片边缘，使其粘附于胶带上。
      注意：建议使用较大的矩形盖玻片（50 mm × 24 mm 或 60 mm × 24 mm），以便在粘贴胶带时留出足够的边缘区域。应尽量减少气泡的产生，因为气泡可能导致叶片变形并引起不均匀的光折射（参见 图 3I-K）。确保盖玻片完全贴附于胶带上，因为若盖玻片贴附不牢，已固定的原基边缘可能会向内卷曲（参见 图3L).
    7. 将载玻片置于落射荧光显微镜的载物台上（参见 补充图 S1K）或共聚焦激光扫描显微镜，并根据需要调整焦距和设置以观察荧光染料30参见 表1 用于所选玉米荧光蛋白报告基因品系的照明与图像采集设置。
    8. 通过各种检测通道对整片叶片或特定的感兴趣区域进行成像30为了对整个叶片进行成像，可手动采集叶片的拼接图像，或在低倍放大（4x 或 10x）下使用显微镜的拼接功能。
      注意：即使在最低放大倍数下，玉米叶原基也可能过大，难以使用落射荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜进行成像，导致成像时间延长，可能引起光漂白（参见 图3M）或背景自发荧光增强。因此，建议使用荧光体视显微镜对大于5 mm的完整叶片样本进行成像。
    9. 对于共聚焦成像，需要获取涵盖叶片厚度的z轴层扫图像（参见步骤2.2.9）。
    10. 保存所有图像文件及其相关元数据（如可用）。

表2：玉米叶原基横切面及整体封片成像中常见问题的解决方案。 请点击此处下载该表格。

细胞图案化可视化、荧光与明场显微镜、植物根结构、CFP标记、FM 4-64染色分析。
图3：玉米叶原基的次优横切面及整体装片制备。（A-D）叶原基横切面的代表性共聚焦图像，显示质膜标记蛋白PIP2-1-CFP（A）和质膜结合荧光染料FM 4-64（B），及其对应的明场图像（C,D）。与PIP2-1-CFP相比，FM 4-64对细胞轮廓的显示效果较差。（E-M）叶原基整体装片的代表性荧光图像，显示存在撕裂（E-G）、表面压伤†（H）、气泡*（I-K）、边缘卷曲（L）以及光漂白区域‡（M）。这些叶原基分别表达DII-Venus（E-G）、GAR2-YFP（H-J）、mDII-Venus（K）、PIN1a-YFP（L）和DR5-RFP（M）。比例尺 = 200 µm（A-D）；500 µm（E-M）。图3A经Robil和McSteen24许可修改并重印，而图5B-M为作者未发表的数据。缩写：P = 叶原基发生周期（plastochron）；YFP = 黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein）；RFP = 红色荧光蛋白（red fluorescent protein）；CFP = 青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein）；PIP2-1-CFP = pZmPIP2-1::ZmPIP2-1:CFP；DII-Venus = pZmUbi:DII:YFP-NLS；GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP；mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS；PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP；DR5-RFP = DR5rev::mRFPer；BF = 明场（bright-field）。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 使用 ImageJ/FIJI 处理图像

  1. 使用最大强度投影（MIP）展平z轴堆栈
    1. 启动ImageJ/FIJI并打开图像堆栈，或通过从菜单中选择图像 | 堆栈 | 图像合成为堆栈，将多个独立图像创建为一个新的堆栈。
    2. 选择图像堆栈。从菜单中选择图像 | 堆栈 | Z轴投影…。在Z轴投影对话框中，从投影类型下拉菜单中选择最大强度。点击确定以生成最大强度z轴投影。
      注：展平后的图像是z轴堆栈中各像素最高强度值的二维投影50。该方法适用于荧光染料的可视化，但不适用于厚横切面及整叶制片明场图像中的解剖结构显示。
    3. 通过选择文件 | 另存为 | TIFF将图像保存为TIFF（标签图像文件格式）。输入文件名并点击保存。
      注：建议使用TIFF格式存储荧光和共聚焦图像，因其在保存图像时能保留图像质量和细节。
  2. 使用扩展景深（EDF）插件展平z轴堆栈51
    1. 安装EDF插件52。从http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ 下载Extended_Depth_Field.jar文件（版本17.05.2021），并将其放入ImageJ/FIJI的“plugins”文件夹中。
    2. 启动ImageJ/FIJI并打开图像堆栈，或通过从菜单中选择图像 | 堆栈 | 图像合成为堆栈，将多个独立图像创建为一个新的堆栈。
    3. 选择图像堆栈。从菜单中选择插件 | 扩展景深 | EDF简易模式。在扩展景深对话框中，使用速度/质量下的滑块设置所需的质量和处理速度，并使用高度图正则化设置地形平滑程度。点击运行以生成重建图像。
      注：EDF通过投影最佳焦点区域，将堆栈合并为一幅清晰的复合二维图像51。该技术有助于克服有限的景深，适用于厚横切面或整叶制片明场图像的重建。在使用该滤波器可视化荧光染料时需谨慎，因为与MIP不同，EDF会调整图像对比度，从而影响像素强度。
    4. 通过选择文件 | 另存为 | TIFF将图像保存为TIFF文件。输入文件名并点击保存。
  3. 使用网格/集合拼接插件（Grid/Collection Stitching）拼接图像53
    1. 将需要拼接的图像或图像堆栈保存至同一目录中。
    2. 启动ImageJ/FIJI，从菜单中选择插件 | 拼接 | 网格/集合拼接。在网格/集合拼接对话框中，从类型下拉菜单中选择未知位置，然后从顺序中选择目录中所有文件。点击确定。
    3. 在网格拼接：未知位置，目录中所有文件对话框中，通过在目录文本框中键入或粘贴路径，或点击浏览…选择目录，指定图像所在位置。点击确定开始拼接过程。
      注：网格/集合拼接插件中的未知位置选项通过分析相邻图像的重叠区域，重建一幅复合图像。因此，该选项适用于拼接非通过平铺扫描获取的横切面或整叶制片图像马赛克。
    4. 拼接完成后，将弹出一个新窗口显示拼接后的图像。通过选择文件 | 另存为 | TIFF将图像保存为TIFF文件。输入文件名并点击保存。
      注：使用显微镜软件中的图像重建命令，或通过ImageJ/FIJI中的Bio-Formats导入选项，也可实现对大型2D和3D图像拼接图的拼接。
  4. 使用“合并通道”命令组合多个通道
    1. 启动ImageJ/FIJI并打开需要合并的图像或图像堆栈。
      注：可先使用步骤4.1或4.2对图像堆栈进行展平。通常建议使用MIP展平荧光染料通道，而EDF更适合展平明场通道或其他具有不同景深的通道。
    2. 使用图像 | 调整 | 亮度/对比度调整图像的亮度和对比度。通过滑块或输入框调整参数，然后点击应用。或者，选择处理 | 增强对比度…使用线性直方图拉伸方法。设置饱和像素的百分比，勾选归一化，然后点击确定。
      注：在对图像间荧光染料信号强度进行定量或比较时，通常不建议调整亮度或对比度，因为这会改变图像中像素强度的相对关系，从而影响测量结果和比较分析。
    3. 为区分不同通道，可使用查找表（LUT）为特定图像应用伪彩色。操作方法为：选择图像后，在ImageJ/FIJI菜单中选择图像，点击查找表，然后从下拉列表中选择合适的LUT。
    4. 从菜单中选择图像 | 颜色 | 合并通道。对于每个通道（C1、C2、C3…），使用下拉列表选择要分配给该通道的图像。点击确定以合并通道。
    5. 通过选择文件 | 另存为 | TIFF将新图像保存为TIFF格式。输入文件名并点击保存。

结果

玉米叶原基横切面分析
我们使用方案第2部分对表达荧光蛋白（FPs）的玉米叶原基横切面中的维管束数量进行量化，并表征激素响应模式图4)24为评估植物激素生长素在叶片生长和叶脉形成中的作用，我们对一种生长素缺乏的玉米突变体的叶原基中的叶脉数目进行了定量分析。 vanishing tassel254在早期叶序中，发育中的维管束在玉米叶原基的中层细胞中表现出明显的细胞分化。21,22然而，使用传统组织学技术识别和计数血管22 可能费时且劳动强度大。因此，为了定量分析维管束，我们采用了玉米生长素外排蛋白标记 pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP41 （下文简称PIN1a-YFP），可标记发育中的维管束和原形成层束（PCSs； 图4A）。利用第2节中的实验方案，我们能够在切片前通过测量原基来标准化横切面取样（图4B, C）。我们发现了一种趋势，即 vt2 原基更宽，叶脉比正常情况多（图 4D，E)24，这与完全展开叶片的数据一致55，表明缺陷在 vt2 在叶片发育早期便已开始。利用第2部分的实验方案，我们还能够系统地检测激素响应荧光蛋白报告基因在叶原基中的表达模式（见图像示例于 图4F-我通过标准化的横切面取样方案，我们绘制了生长素、细胞分裂素（CK）和赤霉素（GA）响应在叶原基不同叶序周期及区域中的分布图谱，发现了若干新的响应模式，我们推测这些模式对叶片生长和叶脉形成具有重要意义。24因此，这些代表性结果证明了方案第2部分在玉米叶原基横切面分析中的实用性。

植物原基分析；示意图和荧光显微镜显示 PIN1、DR5-RFP 和叶脉数据。
图 4：玉米叶片原基横切面分析的代表性结果。 （A-E）利用生长素外排蛋白标记 PIN1a-YFP 对正常植株和 vanishing tassel2 突变体中叶片原基的叶脉数目及原基宽度进行定量分析。 （A）P5 至 P7 阶段表达 PIN1a-YFP 的横切面代表性荧光图像，显示发育中的叶脉和原形成层束。使用落射荧光显微镜配合 FITC 滤光片（495–519 nm 激发波长）获取横切面图像。利用 FIJI/ImageJ 软件中的多点工具和自由手绘线工具分别对叶脉数量和原基宽度进行量化。 （B）去除上部叶鞘后的玉米幼苗，暴露出第四片叶（L4）的顶端。括号所示为投影的原基长度范围，虚线表示中点位置。 （C）P5 至 P7 阶段原基形态变化的示意图，说明在不同发育阶段，中点处（水平虚线）的叶脉数量和原基宽度可能发生变化。 （D,E）在正常植株和 vt2 突变体中，测量 L4 叶片原基中点横截面上的原基宽度（D）和叶脉数量（E）。趋势线表示测量值的 10 mm 滑动平均值，误差线为均值标准误（SEM）。 （F-I）表达多种荧光标记的叶片原基横切面代表性共聚焦图像，包括 PIN1a-YFP、生长素响应报告基因 DR5-RFP、细胞分裂素响应报告基因 TCS-Tomato、赤霉素响应标记 GAR2-YFP，以及 mDII-Venus（一种突变形式的生长素信号输入报告基因 DII-Venus）。每幅图像中荧光蛋白通道信号叠加于明场图像之上。比例尺 = 200 µm（A）；10 mm（B）；100 µm（F-I）。本图经 Robil 和 McSteen24 许可修改并重印。缩写：DAG = 萌发后天数；P = 叶间隔期；vt2 = vanishing tassel2；PCS = 原形成层束；YFP = 黄色荧光蛋白；FITC = 异硫氰酸荧光素；RFP = 红色荧光蛋白；PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP；DR5-RFP = DR5rev::mRFPer；TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato；GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP；mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS。 请点击此处查看本图的放大版本。

玉米叶原基的整体分析
我们按照方案第3部分，对玉米叶原基整片叶子的装片进行荧光蛋白表达的可视化与分析图5通过PIN1a-YFP可视化叶脉模式，我们发现叶脉的形成在早期 plastochron 期间发生在整个原基中，但在发育后期该过程逐渐局限于近端区域。图 5A)24与横切面分析相辅相成，全叶铺片分析揭示了维管束形成过程中激素响应在组织和发育阶段上的特异性模式24一个例子是CK响应报告基因TCSv2::NLS-tdTomato的表达模式37 (TCS-番茄)，相对于PIN1a-YFP表达（图5B)24通过遵循第3个实验步骤，我们能够对叶原基中的荧光蛋白（FP）表达进行定性和定量分析（图5D-F；未发表数据）。我们检测了生长素响应报告基因 DR5rev::mRFPer 的表达模式41 (DR5-RFP) 及一种赤霉素响应型标记，pZmGAR2::ZmGAR2:YFP39 （GAR2-YFP）在单突变体和双突变体的整叶制片中的表达 vt2 和 矮化植株3 (d3），一种赤霉素缺陷型突变体56 (图5D）。我们还比较了正常与病变细胞增殖的相对水平 vt2 使用p标记叶原基ZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 （Cyclin-D2B-YFP），是细胞周期中G1/S期转换的标志物57 (图5E，F）。在正常与 vt2，Cyclin-D2B-YFP 的表达与早期叶序发生周期中已知的细胞增殖模式一致31我们得出结论：方案第3部分是分析玉米叶原基整体样本的有效方法，此类样本由于具有卷曲的形态而难以成像。

PIN1a-YFP expression analysis in plant tissue; fluorescence microscopy, PIN1a localization study.
图5玉米叶原基整体染色分析的代表性结果 (A) 7日龄玉米幼苗叶原基的代表性荧光图像，显示由生长素外排蛋白标记物PIN1a-YFP标记的发育中叶脉和原形成层束。P3-P6原基从基部切下，展开并展平，近轴面向上。插图为P3和P4的放大图像。在P5和P6中，虚线标示增殖区远端边界，该区域多数原形成层束仍处于发育和延伸阶段。B，C代表性共聚焦图像，显示 P5 原基近端边缘区域中 PIN1a-YFP 和细胞分裂素响应报告基因 TCS-Tomato 的表达。D) 正常植株及单突变体和双突变体中P4原基的代表性荧光图像，显示生长素响应报告基因DR5-RFP和赤霉素响应标记GAR2-YFP的表达情况 vanishing tassel2 和 矮化植株3. (EP3和/或P4期表达Cyclin-D2B-YFP的代表性共聚焦图像，该报告基因标记细胞周期中的G1/S期转换。F正常与突变体P3/P4叶原基中细胞增殖的相对量 vt2 通过使用 ImageJ/FIJI 测量原基区域内 Cyclin-D2B-YFP 信号的积分密度来进行定量。柱状图表示平均测量值 ± 平均值的标准误差。比例尺 = 500 µmA、D、E）；200 µm（B）；100 µm（C). 图 4A-C 已根据 Robil 和 McSteen 的授权进行修改和转载24，而 图 4D-F 为作者未发表的数据。缩写：DAG = 萌发后天数；P = 叶序期 vt2 = 花序消失2；d3 = 矮秆3 YFP = 黄色荧光蛋白；RFP = 红色荧光蛋白；PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP；TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato；DR5-RFP = DR5rev::mRFPer；GAR2-YFP = pZmGAR2::ZmGAR2:YFP；Cyclin-D2B-YFP = pZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP；ns = 无显著差异；au = 任意单位 请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件1：玉米幼苗叶片发育分期示例。 请点击此处下载该文件。

补充图 S1：实验方案中使用的植物样品和材料。（A,B）一株萌发后7-8天的玉米幼苗，其上部叶鞘已用剥线钳去除。（B）插图显示茎尖部分的放大图像，其中P6原基暴露清晰。（C-G）去除上部叶鞘的玉米幼苗茎尖，用于横切面分析（C,D），以及完全去除周围叶片后用于整体染色分析的茎尖（E-G）。（H）一卷透明双面聚氨酯凝胶纳米胶带。（I,J）P6叶原基（I）和P8叶近端区域（J）被展开并用纳米胶带固定在载玻片上。（K）载玻片上展开的叶原基置于落射荧光显微镜载物台上的图像。缩写：DAG = 萌发后天数。请点击此处下载该文件。

讨论

我们介绍了两种用于玉米叶片原基细胞成像的制备方法。第一种方法（方案第2部分）允许对原基进行测量，以便进行横切面分析；第二种方法（方案第3部分）则可将原基展开并压平，用于整体装片分析。这些方法有助于对玉米叶片原基中的荧光蛋白（FPs）进行细胞水平成像24（如图4和 图5所示），并为成像发育中玉米叶片所面临的挑战提供了简便的解决方案。方案第2部分通过在切片前直接测量原基尺寸，而非仅依赖发育分期参数9,16，从而缩短了解剖时间并提高了取样准确性。利用市售的纳米胶带，方案第3部分解决了长期以来难以对玉米整片叶原基进行成像的问题。该方案改进了此前使用透析管的方法31，且相较于CT和MRI技术11,32,33，成本显著降低。然而，在可视化叶片解剖特征及获得最佳成像结果方面，这两种方案均存在一定局限性，具体如表2所列，并在下文中进一步详细讨论。

在方案第2部分中，我们在观察叶原基较厚的横切面时难以清晰分辨细胞轮廓，使用细胞壁或质膜结合型荧光染料进行复染也未能获得满意结果。例如，FM 4-64 的染色效果相较于质膜荧光蛋白标记物 pZmPIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39（PIP2-1-CFP；图3A-D）较差。为克服这一局限，我们建议使用振动切片机制备更薄的组织切片（约0.1 mm）58，以实现细胞轮廓清晰的明场成像，或优化复染方案47,59。

在方案第3部分中，主要局限在于固定叶片时难以避免撕裂、损伤或产生气泡，具体如方案步骤3.2.5-3.2.6所述（图3E-K）。由于玉米叶片为两侧对称结构，因此仅固定半片叶片可能已足以实现观察9。为此，可在将叶原基展开至中脉后，沿纵轴用剃刀片将其切开，仅固定其中一半。方案第3部分的另一局限是叶片厚度可能限制深部成像时荧光信号的光学分辨率。为解决此问题，可采用组织透明化技术60。然而，我们发现常用于植物组织成像的透明化试剂ClearSee61与本方案不兼容，因其会导致样品及盖玻片从纳米胶带脱落。一种可能的解决方案是在叶片样品上覆盖一层半透膜31，使样品在纳米胶带固定下仍可接受透明化溶液处理。此类允许液体溶液作用于展开叶片的方法，也可用于整体原位RNA杂交（whole-mount RNA in situ hybridization）和免疫定位（immunolocalization）技术，这些技术此前已在发育中的玉米花序中优化，但尚未应用于完整的叶原基62,63。

我们描述了玉米的实验方案，玉米在苗期就具有较大的叶原基。对于叶原基小得多的其他禾本科物种，如水稻、大麦、小麦、狗尾草（Setaria）和短柄草（Brachypodium）16,23,64,65,66，可能需要使用额外的精密工具才能有效应用这些方案。此外，这些方案并非针对活细胞成像而设计，活细胞成像能够捕捉组织形成和细胞响应的实时动态过程。然而，随着植物活细胞成像中荧光探针、成像技术及计算能力的不断进步67，未来的研究可在此基础上发展出针对禾本科植物叶原基独特特征的活细胞成像策略。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢玉米遗传合作组织（Maize Genetics Cooperation）、玉米细胞基因组学项目（Maize Cell Genomics Project）、Dave Jackson（冷泉港实验室，纽约）、Anne W. Sylvester（海洋生物学实验室，芝加哥大学，伊利诺伊州）、Andrea Gallavotti（罗格斯大学，新泽西州）以及Carolyn G. Rasmussen（加州大学河滨分校）提供突变体和转基因材料；同时感谢密苏里大学哥伦比亚分校先进光学显微镜核心设施（Advanced Light Microscopy Core）的Robert F. Baker和Alexander Jurkevich在共聚焦显微镜实验方面的协助。JMR的研究得到了J. William Fulbright奖学金、Diane P.和Robert E. Sharp基金以及美国国家科学基金会植物基因组研究计划（IOS-1546873，项目负责人：PM）的资助。 CDTC、CMRV、EDCDP 和 RJRR 获得雅典耀大学学院奖学金项目的资助。CDTC、EDCDP 和 RJRR 获得菲律宾科技部-科学教育研究所（DOST-SEI）奖学金项目的资助。&T 本科生奖学金。DODL 获弗朗西斯·斯坦布格勒神父学术奖学金（Fr. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship）资助。RJRR 获 Aiducation International–高等教育之路奖学金（Aiducation International–Pathways to Higher Education Scholarship）资助。本研究得到马尼拉雅典耀大学理学与工程学院及黎刹图书馆（School of Science and Engineering and the Rizal Library, Ateneo de Manila University）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙烯酸凝胶透明双面纳米胶带 5米 × 3厘米，厚2毫米EZlifego 商店（亚马逊）B07YB1ZXG61卷
Bellucci 探针曲头微型探针 16.8 厘米，6.6 英寸Bausch && 罗姆N1692 91 个
Clayman导向微探针Sinskey钩，弯轴，11.6 cm，4.6 inStorz 眼科器械E05421 个
牙科探针，弯头针，14 厘米（5.5 英寸）Ted Pella135531 个
DOWELL 10-22 AWG 剥线钳道威尔商店（亚马逊）10-22 AWG1 件
双刃碳钢刀片Ted Pella121-9pkg/10；用于精细切片
磨砂端玻璃显微镜载玻片，75 mm × 25 mm × 1–1.2 mmTed Pella260442pkg/144
GEM 单刃，不锈钢未涂层刀片Ted Pella121-1盒/200；用于常规切割/切片
甘油赛默飞世尔科技PI179041 升
ImageJ/FIJI 配备 EDF 插件（版本 17.05.2021）和 Grid/Collection 拼接插件美国国立卫生研究院（NIH）版本 2.9.0/1.54秒EDF 插件由 Alex Prudencio、Jesse Berent 和 Daniel Sage 为生物医学成像小组开发， É巴黎综合理工学院édé洛桑联邦理工学院（EPFL；http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/）。网格/图像拼接软件由斯特凡·普赖比施（Stephan Preibisch）为马克斯·普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所（MPI-CBG）开发。
Kimwipes Ex-L 小号 111.76 毫米 × 213.36 毫米Kimtech Science34155箱/280 英尺
微型盖玻片，22 mm × 22 mm × 0.13 - 0.16 mm 厚Ted Pella2601401 盎司
PU凝胶透明双面纳米胶带 29.5 英尺 × 1.18 英寸，厚度 1 毫米Yecaye 商店（亚马逊）L354 W1.182卷
超滑盖玻片，24 mm × 50 mm × 0.13 - 0.16 mm 厚Ted Pella2601661 盎司
超滑盖玻片，24 mm × 60 mm × 0.13 - 0.16 mm 厚Ted Pella2601681 盎司
钢化玻璃切菜板哈卡罗亚（亚马逊）B09XMXBT5S4 件

参考文献

  1. McSteen, P., Kellogg, E. A. Molecular, cellular, and developmental foundations of grass diversity. Science. 377 (6606), 599-602 (2022).
  2. Wang, P., Vlad, D., Langdale, J. A. Finding the genes to build C4 rice. Current Opinion in Plant Biology. 31, 44-50 (2016).
  3. Wang, P., et al. Candidate regulators of early leaf development in maize perturb hormone signalling and secondary cell wall formation when constitutively expressed in rice. Scientific Reports. 7 (1), 4535(2017).
  4. Perico, C., Tan, S., Langdale, J. A. Developmental regulation of leaf venation patterns: Monocot versus eudicots and the role of auxin. New Phytologist. 234 (3), 783-803 (2022).
  5. Wang, P., Kelly, S., Fouracre, J. P., Langdale, J. A. Genome-wide transcript analysis of early maize leaf development reveals gene cohorts associated with the differentiation of C4 Kranz anatomy. The Plant Journal. 75 (4), 656-670 (2013).
  6. Liu, W. Y., et al. Regulators of early maize leaf development inferred from transcriptomes of laser capture microdissection (LCM)-isolated embryonic leaf cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (35), e2208795119(2022).
  7. Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (10), 3979-3984 (2013).
  8. Strable, J., Nelissen, H. The dynamics of maize leaf development: Patterned to grow while growing a pattern. Current Opinion in Plant Biology. 63, 102038(2021).
  9. Reynolds, J. O., Eisses, J. F., Sylvester, A. W. Balancing division and expansion during maize leaf morphogenesis: Analysis of the mutant, warty-1. Development. 125 (2), 259-268 (1998).
  10. Richardson, A. E., et al. Evolution of the grass leaf by primordium extension and petiole-lamina remodeling. Science. 374 (6573), 1377-1381 (2021).
  11. Johnston, R., Leiboff, S., Scanlon, M. J. Ontogeny of the sheathing leaf base in maize (Zea mays). New Phytologist. 205 (1), 306-315 (2015).
  12. Sharman, B. C. Developmental anatomy of the shoot of Zea mays L. Annals of Botany. 6 (22), 245-282 (1942).
  13. Johnston, R., et al. Transcriptomic analyses indicate that maize ligule development recapitulates gene expression patterns that occur during lateral organ initiation. The Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  14. Sharman, B. C. Leaf and bud initiation in the Gramineae. Botanical Gazette. 106 (3), 269-289 (1945).
  15. Nelissen, H., et al. A local maximum in gibberellin levels regulates maize leaf growth by spatial control of cell division. Current Biology. 22 (13), 1183-1187 (2012).
  16. Itoh, J., et al. Rice plant development: From zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  17. Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Iowa State University of Science and Technology. , (1986).
  18. Freeling, M., Walbot, V. The Maize Handbook. , Springer Science & Business Media. (2013).
  19. Freeling, M., Hake, S. Developmental genetics of mutants that specify knotted leaves in maize. Genetics. 111 (3), 617-634 (1985).
  20. Durbak, A. R., et al. Transport of boron by the tassel-less1 aquaporin is critical for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 26 (7), 2978-2995 (2014).
  21. Langdale, J. A., Lane, B., Freeling, M., Nelson, T. Cell lineage analysis of maize bundle sheath and mesophyll cells. Developmental Biology. 133 (1), 128-139 (1989).
  22. Bosabalidis, A. M., Evert, R. F., Russin, W. A. Ontogeny of the vascular bundles and contiguous tissues in the maize leaf blade. American Journal of Botany. 81 (6), 745-752 (1994).
  23. Junqueira, N. E. G., et al. Anatomy and ultrastructure of embryonic leaves of the C4 species Setaria viridis. Annals of Botany. 121 (6), 1163-1172 (2018).
  24. Robil, J. M., McSteen, P. Hormonal control of medial-lateral growth and vein formation in the maize leaf. New Phytologist. 238 (1), 125-141 (2023).
  25. Donnelly, P. M., Bonetta, D., Tsukaya, H., Dengler, R. E., Dengler, N. G. Cell cycling and cell enlargement in developing leaves of Arabidopsis. Developmental Biology. 215 (2), 407-419 (1999).
  26. Govindaraju, P., Verna, C., Zhu, T., Scarpella, E. Vein patterning by tissue-specific auxin transport. Development. 147 (13), (2020).
  27. Linh, N. M., Scarpella, E. Leaf vein patterning is regulated by the aperture of plasmodesmata intercellular channels. PLoS Biology. 20 (9), e3001781(2022).
  28. Verna, C., Ravichandran, S. J., Sawchuk, M. G., Linh, N. M., Scarpella, E. Coordination of tissue cell polarity by auxin transport and signaling. eLife. 8, e51061(2019).
  29. Sawchuk, M. G., Head, P., Donner, T. J., Scarpella, E. Time-lapse imaging of Arabidopsis leaf development shows dynamic patterns of procambium formation. New Phytologist. 176 (3), 560-571 (2007).
  30. Linh, N. M., Scarpella, E. Confocal imaging of developing leaves. Current Protocols. 2 (1), e349(2022).
  31. Poethig, R. S., Szymkowiak, E. J. Clonal analysis of leaf development in maize. Maydica. 40, 67-76 (1995).
  32. Sprangers, K., Thys, S., van Dusschoten, D., Beemster, G. T. S. Gibberellin enhances the anisotropy of cell expansion in the growth zone of the maize leaf. Frontiers in Plant Science. 11, 1163(2020).
  33. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 cofactors, BLH12 and BLH14, regulate internode patterning and vein anastomosis in maize. The Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  34. Schindelin, J., et al. FIJI: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Plant Care Protocols - Maize. The Donald Danforth Plant Science Center's Plant Growth Facility. , Available from: https://www.danforthcenter.org/our-work/core-facilities/plant-growth/ (2019).
  36. Mir, R., et al. A DII domain-based auxin reporter uncovers low auxin signaling during telophase and early G1. Plant Physiology. 173 (1), 863-871 (2017).
  37. DeBlasio, S. L., Sylvester, A. W., Jackson, D. Illuminating plant biology: Using fluorescent proteins for high-throughput analysis of protein localization and function in plants. Briefings in Functional Genomics. 9 (2), 129-138 (2010).
  38. Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: Generation and applications. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 535-543 (2013).
  39. Mohanty, A., et al. Advancing cell biology and functional genomics in maize using fluorescent protein-tagged lines. Plant Physiology. 149 (2), 601-605 (2009).
  40. Baker, R. F., et al. Sucrose transporter ZmSut1 expression and localization uncover new insights into sucrose phloem loading. Plant Physiology. 172 (3), 1876-1898 (2016).
  41. Gallavotti, A., Yang, Y., Schmidt, R. J., Jackson, D. The relationship between auxin transport and maize branching. Plant Physiology. 147 (4), 1913-1923 (2008).
  42. Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), 12(2015).
  43. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: A cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  44. Geng, Y., Zhou, Y. Confocal live imaging of shoot apical meristems from different plant species. Journal of Visualized Experiments. (145), e59369(2019).
  45. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell Biology. 139, Elsevier. 203-223 (2017).
  46. Fodor, E., Ayaydin, F. Fluorescent probes and live imaging of plant cells. Advances in Plant Ecophysiology Techniques. , Springer. 241-251 (2018).
  47. Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. The Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
  48. Conklin, P. A., Johnston, R., Conlon, B. R., Shimizu, R., Scanlon, M. J. Plant homeodomain proteins provide a mechanism for how leaves grow wide. Development. 147 (20), (2020).
  49. Shaw, S. L. Imaging the live plant cell. The Plant Journal. 45 (4), 573-598 (2006).
  50. Klaus, A. V., Schawaroch, V., Frischmann, K. J. Confocal imaging and three-dimensional visualization of thick autofluorescent specimens. Methods in Molecular Biology. 1075, 213-225 (2014).
  51. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Extended depth-of-focus for multi-channel microscopy images: a complex wavelet approach. 2004 2nd IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: Nano to Macro (IEEE Cat No. 04EX821). IEEE. , 660-663 (2004).
  52. Extended Depth of Field. EPFL Biomedical Imaging Group. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2022).
  53. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  54. Phillips, K. A., et al. vanishing tassel2 encodes a grass-specific tryptophan aminotransferase required for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 23 (2), 550-566 (2011).
  55. Robil, J. M., et al. GrasVIQ: An image analysis framework for automatically quantifying vein number and morphology in grass leaves. The Plant Journal. 107 (2), 629-648 (2021).
  56. Helliwell, C. A., Chandler, P. M., Poole, A., Dennis, E. S., Peacock, W. J. The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 2065-2070 (2001).
  57. Gutierrez, R., Quiroz-Figueroa, F., Vazquez-Ramos, J. M. Maize cyclin D2 expression, associated kinase activity and effect of phytohormones during germination. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 166-173 (2005).
  58. Atkinson, J. A., Wells, D. M. An updated protocol for high throughput plant tissue sectioning. Frontiers in Plant Science. 8, 1721(2017).
  59. Lux, A., Morita, S., Abe, J., Ito, K. An improved method for clearing and staining free-hand sections and whole-mount samples. Annals of Botany. 96 (6), 989-996 (2005).
  60. Heriche, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. Imaging plant tissues: Advances and promising clearing practices. Trends in Plant Science. 27 (6), 601-615 (2022).
  61. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  62. Chuck, G., Muszynski, M., Kellogg, E., Hake, S., Schmidt, R. J. The control of spikelet meristem identity by the branched silkless1 gene in maize. Science. 298 (5596), 1238-1241 (2002).
  63. Tran, T. M., et al. An optimized whole-mount immunofluorescence method for shoot apices. Current Protocols. 1 (4), e101(2021).
  64. O'Connor, D. L. PINs Lost and PINs Gained: Auxin-Transport Mediated Patterning in the Grasses. University of California, Berkeley. , Doctoral Dissertation (2012).
  65. Sharman, B. C., Hitch, P. A. Initiation of procambial strands in leaf primordia of bread wheat, Triticum aestivum L. Annals of Botany. 31 (2), 229-243 (1967).
  66. Serra, L., Tan, S., Robinson, S., Langdale, J. A. Flip-flap: A simple dual-view imaging method for 3D reconstruction of thick plant samples. Plants. 11 (4), 506(2022).
  67. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章